桑树PDS基因VIGS转化体系的构建与鉴定

[目的]建立桑树的病毒诱导基因沉默(VIGS)转化体系,为桑树功能基因的分析研究提供技术支持.[方法]以丰驰桑为试验材料,克隆含BamH I和Xba I酶切位点的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因片段,经Xba I和BamH I双酶切后与烟草脆裂病毒(TRV)连接构建重组病毒载体pTRV2-PDS,转化农杆菌GV3101后通过压迫注射方式侵染桑树幼苗叶片.[结果]克隆获得的桑树PDS基因干扰片段346 bp,与改造后的TRV质粒连接可成功构建携带桑树PDS基因的重组病毒载体pTRV2-PDS.桑树叶片被侵染15 d后,接种重组病毒载体pTRV2-PDS桑树的第二轮真叶开始出现叶片白化现象,侵染20 d后,白化现象沿叶脉向四周逐渐扩散,叶片呈现明显的白化表型.实时荧光定量PCR检测结果显示,重组病毒载体pTRV2-PDS侵染的桑叶PDS基因相对表达量仅为阴性对照(pTRV2)的58%,二者差异极显著(P<0.01),表明桑树PDS基因表达被有效抑制.[结论]利用TRV构建的桑树VIGS体系能有效沉默PDS基因,使桑树叶片呈现明显的白化症状,即可用于后续的桑树功能基因鉴定.     

黄瓜花叶病毒基因沉默载体的效率和稳定性分析

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)已被广泛应用于植物基因的功能研究。试验以八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)作为指示基因,在本生烟体内分析黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)作为VIGS载体对植物内源PDS mRNA的沉默效率。采用分子克隆的方法,将FnyCMV 2b ORF替换为不同长度的PDS序列,并分析了其在本生烟植物上诱导的PDS沉默效率。结果表明,该重组病毒能诱导上部系统叶的光漂白表型,且沉默效率与插入片段长度呈一定的正相关性,但在顶端新生叶中均不引起明显的光漂白现象,过长的片段插入(≥518 nt)影响病毒基因组的遗传稳定性,导致插入片段的部分缺失。CMV作为VIGS载体,最适合的插入片段约为350 nt。     

利用VIGS技术在本氏烟中沉默枸杞PDS同源基因的研究

[目的]本项研究旨在通过建立一个异源VIGS体系,为枸杞重要性状相关基因的功能鉴定提供前期信息.[方法]从枸杞叶片中克隆获得409 bp长的八氢番茄红素脱饱和酶基因(phytoene desaturase,PDS)的编码区片段,构建入基于烟草脆裂病毒的VIGS空载体中,通过农杆菌介导的侵润接种,将重组的病毒沉默载体pT...     

Cf-19介导的抗番茄叶霉病（Cladosporium fulvum）免疫应答酵母双杂交cDNA文库构建和鉴定

番茄叶霉病(Cladosporium fulvum)是番茄栽培生产中最严重的病害之一,造成严重经济损失。Cf-19基因是目前已知抗性最强、抗性范围最广的叶霉病抗病基因之一,其免疫应答过程具有代表性,为研究Cf-19介导的免疫应答过程中蛋白质互作机制,采用Gateway技术构建Cf-19介导的抗番茄叶霉病免疫应答酵母双杂交cDNA文库。结果表明,酵母cDNA文库滴度为5.0×10~7CFU·mL~(-1),重组率为100%,cDNA文库插入片段长度500～2 000 bp,插入片段平均长度1 000 bp以上。由此可知,Cf-19介导的抗番茄叶霉病(C. fulvum)免疫应答酵母双杂交cDNA文库,可用于筛选互作蛋白。     

小麦SBEⅡa、SSⅡa基因片段的克隆及VIGS重组载体的构建

[目的]克隆小麦SBEⅡa、SSⅡa基因部分序列并构建二者的VIGS重组载体,为在小麦上利用VIGS技术研究SBEⅡa、SSⅡa基因与小麦淀粉合成的关系奠定基础.[方法]根据GenBank中公布的小麦SBEⅡa(AF286319.1)、SSⅡa(AF155217.2)基因序列分别设计特异引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡa、SSⅡa基因的特异片段.然后以BSMV:γ-PDS为原载体,通过酶切连接用SBEⅡa、SSⅡa基因片段分别将原载体中的PDS基因进行替换,从而构建BSMV:γ-SBEⅡa和BSMV:γ-SSⅡa重组载体.[结果]克隆的SBEⅡa和SSⅡa基因片段长分别是178 bp和171 bp.序列分析表明:SBEⅡa基因片段与小麦SBEⅡa(AF286319.1)序列同源性为100;;、SSⅡa基因片段与SSⅡa(AF155217.2)序列同源性也为100;;酶切鉴定结果表明成功构建BSMV:γ-SBEⅡa和BSMV:γ-SSⅡa重组载体.[结论]构建的BSMV:γ-SBEⅡa和BSMV:γ-SSⅡa重组载体将为下一步利用VIGS技术在小麦上研究SBEⅡa、SSⅡa基因与小麦淀粉合成的关系奠定基础.     

不同VIGS体系在棉花中沉默效率的研究

[目的]比较不同病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系在棉花中的沉默效率.[方法]本研究以35S启动子驱动的抗卡那霉素基因nptⅡ为目标基因,利用RNA病毒载体TRV和DNA病毒载体CLCrV构建基因沉默载体,研究这2套VIGS体系在棉花中的基因沉默效率和沉默持续时间的差异.[结果]TRV体系比CLCrV体系沉默效率高,T...     

番茄抗叶霉病基因Cf6的RAPD及SCAR标记

 【目的】寻找与番茄抗叶霉病基因Cf6连锁的分子标记。【方法】 以番茄抗叶霉病和感叶霉病亲本组合（03036×03748）的F2分离群体为研究材料,采用BSA法和RAPD技术筛选与抗病基因连锁的分子标记。【结果】经F2单株分析,在后代群体中扩增出了两条长约500 bp的特异片段,该特异标记与叶霉病抗性基因Cf6紧密连锁,遗传距离为8.7 cm。测序结果显示,目标片段的大小分别为619 bp和559 bp,并将该标记转换为SCAR标记。【结论】SCAR标记,可用于番茄叶霉病抗性分子标记辅助育种。     

番茄独脚金内酯合成关键基因CCD7、CCD8 RNA沉默载体的构建

根据已知的番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)CCD7和CCD8基因的序列设计特异性引物,采用RT-PCR克隆CCD7和CCD8基因片段,通过特定酶切将2个基因进行拼接,再将串联基因以反向重复的方式连入p UCCRNAi载体,并定向插入到p35植物表达载体上。结果表明,克隆获得了大小约为400 bp的CCD7和CCD8基因片段,基因片段拼接后获得800 bp左右的串联片段CCD7-8;将该基因片段插入p UCCRNAi载体后得到1 700 bp大小的含Intron的反向重复序列In-7-8,并成功插入到植物表达载体p35中,通过酶切分析,RNAi载体构建正确。最终成功构建了番茄CCD7和CCD8 2个串联基因的RNA沉默表达载体p35-In-7-8。     

利用PCR技术同时检测番茄抗根结线虫基因(Mi-1)和抗叶霉病基因(Cf-9)

   利用同一PCR反应体系,对分别与番茄抗根结线虫的Mi-1基因和抗番茄叶霉病的Cf-9基因紧密连锁的CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)标记进行同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合与Cf-9基因紧密连锁的CAPSl标记在抗病试材中可扩增出2775 bp的特异片段,且存在Taq I酶切位点,酶切后产生1177 bp、446 bp、370 bp和160 bp的不同特异片段;与Mi-1基因紧密连锁的CAPS2为共显性标记,抗性材料中产生915 bp的特异片段,Taq I酶切后产生719bp和196 bp的特异片段该体系可用于在同一PCR反应体系中对Mi-1和Cf-9 2个抗病基因进行同时筛选鉴定该体系的建立不仅省时、省工,节省费用,而且可用于苗期早期辅助选育,加快番茄育种进程     

适于烟草脆裂病毒诱导的本氏烟基因沉默分析的对照载体构建(英文)

对烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默分析体系中目前最常用的对照载体——空pYL156载体(pYL156∷00)对沉默处理后番茄和本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株的病毒症状和生长影响进行分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的番茄和本氏烟植株均表现出严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,因此,pYL156∷00并不是一个用于TRV诱导的番茄和本氏烟基因沉默分析的好的对照载体;为获得更好的对照载体,试验构建了2个新的对照载体pYL156∷NIRi和pYL156∷eGFP,它们分别通过在pYL156∷00载体多克隆位点插入253bp菜豆亚硝酸还原酶基因内含子序列和400bp eGFP基因片段而获得,对这2个对照载体对沉默处理后本氏烟植株的病毒症状和生长情况的影响与pYL156∷00进行比较分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的植株表现出较严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,其中26.7%植株死亡;pYL156∷NIRi沉默处理后的植株也表现出明显的病毒症状以及生长受抑制现象,但与pYL156∷00相比,所受影响较小,只有13.3%植株死亡;而pYL156∷eGFP沉默处理后的植株不表现明显的病毒症状,植株生长也不受显著影响;病毒积累量检测结果显示,3个对照载体沉默处理的植株病毒症状和生长受抑制情况与植株体内TRV病毒的积累水平密切相关.这些结果表明,新构建的pYL156∷eGFP可以作为一个优越的对照载体应用于TRV诱导的基因沉默分析.     

利用多重PCR反应同时筛选番茄Ty-1和cf-5基因

利用同一PCR反应体系同时扩增、筛选分别与番茄抗黄化曲叶病毒病的Ty-1基因和番茄抗叶霉病的cf-5基因紧密连锁的SCAR标记,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合.与Ty-1基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感材料均产生398 bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在TaqⅠ酶切位点,酶切后分别产生了303 bp和95 bp以及398、303 bp和95 bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点,酶切后仍呈现398 bp的特异带.与cf-5基因紧密连锁的SCAR2标记扩增后抗感材料均产生960 bp的特异片段,用限制性内切酶TaqⅠ酶切后,含cf-5基因的材料产生一条256 bp的特异带,而不含cf-5基因的材料产生一条225 bp的特异带.     

美洲棉铃虫CYP321A1基因启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体的构建及活性测定

【目的】构建美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,为探索CYP321 A1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】设计合成PCR引物,从美洲棉铃虫基因组DNA中扩增并克隆CYP321 A1基因的启动子区;将克隆的启动子片段插入载体pGL3-basic构建萤火虫荧光素酶报告基因载体p(-1 470/+64);用p(-1 470/+64)转染美洲棉铃虫脂肪体细胞系BCIRL-HzFB33,并用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】p(-1 470/+64)经双酶切、PCR鉴定及DNA测序分析鉴定准确无误;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,证实所构建的重组载体p(-1 470/+64)可以反映CYP321 A1启动子活性;黄酮、花椒毒素处理极显著地增强了重组载体p(-1 470/+64)的荧光活性。【结论】成功构建了美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,CYP321A1启动子活性可以被植物次生物质黄酮、花椒毒素高度诱导。     

病毒诱导的基因沉默

    "病毒诱导的基因沉默"(virus-induced gene silencing,VIGS)一词最早用于描述被病毒侵染的植物的"恢复"现象,是一种植物抗病毒侵染的自然机制,现在已被开发成通过插入目的基因片段的重组病毒抑制植物内源基因表达的遗传技术,用于基因功能分析VIGS由小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)驱动,siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)结合后,特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合,并降解RNA模板已有源于15种不同类型病毒的VIGS载体得到开发和应用在VIGS栽体中插入的目的片段、重组VIGS病毒载体的植物导入方法、沉默处理时的寄主生育期、沉默处理后的植物培育条件等均显著影响VIGS的效率作为一种新型的基因鉴定和功能研究技术工具,VIGS具有无需事先知道目的基因全长序列、获取表型迅速、无需构建转基因植株等诸多优点,已越来越广泛地被应用于植物基因功能研究     

辣椒上TRV介导的番茄斑萎病毒N基因沉默体系构建及鉴定

【目的】研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)核衣壳蛋白基因(N)对辣椒抗病性的影响。【方法】以易感TSWV的辣椒湘研11为研究对象,采用同源序列克隆获得辣椒CaPDS基因和TSWV N基因;利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)和病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术构建辣椒CaPDS基因沉默载体(pTRV2-CaPDS)和TSWV N基因沉默载体(pTRV2-N),农杆菌GV3101注射接种辣椒,通过qRT-PCR检测重组载体沉默效率。【结果】湘研11接种含pTRV2-CaPDS载体菌液3周后,新叶出现白化现象,说明辣椒上的pTRV2-CaPDS沉默载体构建成功。qRT-PCR结果表明:pTRV2-N载体可高效沉默N基因,其表达量仅为6.79%±2.56%,说明沉默N基因后,湘研11不易感染TSWV。【结论】本研究成功构建了pTRV2-N沉默载体,沉默TSWV的N基因后辣椒对入侵的TSWV产生一定的抗性。     

番茄Cf-5基因的SNP分子标记开发

根据已知的叶霉病抗性基因Cf-5基因序列,设计了3对嵌套引物。以4份抗病材料和4份非抗病材料DNA为模板,扩增番茄Cf-5基因并比较了抗感材料Cf-5基因的序列,在580、2 879 bp位点分别有T与C、G与T的碱基替换,设计了等位基因特异引物,获得了稳定的等位基因PCR产物,成功地开发了抗叶霉病基因Cf-5的SNP标记,为培育抗叶霉病番茄品种奠定了基础。     

基于VIGS技术干扰病毒RNA防控烟草黄瓜花叶病毒病

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)引起的花叶病是烟草上的重要病害。本试验通过病毒诱导基因沉默技术(virus induced gene silencing, VIGS)构建靶向沉默CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP和CMV-CP的VIGS载体,测定基因沉默后CMV相对表达量、CMV病毒浓度和TRV相对表达量,并对VIGS载体对CMV的防治效果进行评价。结果表明,试验建立的VIGS载体能够有效导入烟株;沉默CMV-2a的处理CMV相对表达量最低,基因沉默效率最高,为46.25%;接种病毒30 d后CMV-2a处理的病毒浓度最低,仅为对照的72.8%,TRV载体的相对表达量显著高于其他处理;沉默CMV-2a的处理发病时间推迟,病情指数最低,防治效果最好。本研究建立的CMV-2a VIGS体系能够有效沉默外源侵入的CMV基因表达,抑制CMV在烟株内的传播,为防治烟草黄瓜花叶病毒病提供了新的思路与方法。     

人参CYP716A53v2基因的克隆与序列分析

研究人参皂苷生物合成途径中的影响因子。以五年生人参根组织为试验材料,提取总RNA,反转录合成c DNA的第1条链,利用PCR法对人参中的原人参三醇合成酶(CYP716A53v2)基因的c DNA进行克隆及序列分析。获得CYP716A53v2基因全长片段为1 506 bp,开放阅读框长1 410 bp,编码470个氨基酸多肽。生物信息学分析显示,CYP716A53v2基因编码蛋白质不含跨膜区域。说明CYP716A53v2基因与其他植物氨基酸序列具有较高同源性,其中与人参、西洋参、三七同源性分别为99%、98%、98%。     

黄花菜八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的克隆及VIGS转化表达验证

为了拓宽对黄花菜基因功能研究的技术体系,本研究以黄花菜‘大同黄花’为试验材料,基于转录组数据库检索和PCR技术克隆得到了黄花菜HcPDS基因完整编码序列,序列全长1710 bp,编码570个氨基酸。该基因编码的蛋白质具有PDS基因家族典型的Phytoene desat结构域,分子量为63.719 72 kD,等电点为7.53,是亲水不稳定性蛋白。通过序列比对,发现HcPDS基因与水仙、芦笋等植物中的PDS基因具有较高的同源性。通过构建黄花菜病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系,黄花菜幼苗被侵染后,接种pTRV2-HcPDS的植株新叶出现不完全的光漂白现象,叶片中的HcPDS基因表达量相比接种TRV2空载的阴性对照和空白对照植株分别下降了73.33%和71.72%。空白对照和阴性对照植株叶片则无光漂白现象出现,且空白对照和阴性对照的HcPDS基因表达量相比无显著差异。所构建的黄花菜VIGS体系可有效沉默HcPDS基因,为黄花菜功能基因的鉴定与分析奠定了技术基础。     

棉花病毒诱导基因沉默体系构建

探索了病毒诱导基因沉默载体在棉花上的应用,由烟草脆裂病毒(TRV)改造的pTV00载体,构建了棉花标记PDS基因病毒诱导基因沉默的载体,成功建立了棉花病毒诱导基因沉默体系。     

萼脊兰SeAP1-like基因的克隆与表达载体构建

根据NCBI网站上萼脊兰AP1-like全长基因序列设计引物,采用RT-PCR法从萼脊兰花瓣中扩增Se AP1-like基因,对扩增产物进行克隆和测序。结果表明,获得的萼脊兰Se AP1-like基因为743 bp,编码247个氨基酸。将Se AP1-like基因插入p CAMBIA1304载体中,经PCR、双酶切鉴定,证实重组表达质粒中含有目的片段,表明成功构建了高效植物表达载体p CAMBIA1304-Se AP1。对Se AP1-like基因的结构域和所表达蛋白质的亲水性进行了分析,并预测了该基因所表达蛋白的二维结构。结果显示,该基因包含MADS-box和K-box保守域,属于MADS-box基因家族,该蛋白分子属于亲水性蛋白。二级结构分析表明,其包含57.49%的α螺旋、6.07%的延伸链、36.44%的不规则折叠。