苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。     

来源于盐惰菌属Halopiger xanaduensis的木聚糖酶基因在毕赤酵母中诱导表达及其酶学性质的研究

根据毕赤酵母的密码子偏爱性和木聚糖酶的蛋白序列设计并合成了木聚糖酶基因片段,与表达载体pYPX88连接,构建成分泌表达载体;构建的分泌表达载体经BglⅡ酶切后电击转化到毕赤酵母GS115中,筛选得到阳性克隆。研究了重组木聚糖酶的最适pH、pH稳定性、最适温度、温度稳定性以及部分金属离子、十二烷基硫酸钠(SDS)和二硫苏糖醇(DTT)对该酶性质的影响。结果表明:重组木聚糖酶最适pH为6.0,在pH 4.5—8.0时酶学性质稳定;最适温度为60℃在20-65℃时酶学性质稳定;金属离子Mn~(2+)与Cu~(2+)对该酶有抑制作用,化合物DTT对该酶有明显促进作用。     

枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体的构建及木聚糖酶基因的表达

构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体并用菌体自身信号肽引导表达外源木聚糖酶基因,为枯草芽孢杆菌木聚糖酶高效分泌表达系统的建立奠定基础。利用基因工程的原理和方法,将壮观霉素抗性基因(spec)与短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因(xynA)克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体GJ148上,构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体pYG,将枯草芽孢杆菌信号肽Epr克隆到已构建载体上,以枯草芽孢杆菌WB700为表达宿主,引导木聚糖酶基因进行表达。最终成功构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体pYG,将枯草芽孢杆菌信号肽Epr克隆到pYG上,在WB700中引导并表达木聚糖酶基因。试验证明信号肽筛选载体可以成功构建,在克隆入信号肽后可成功表达木聚糖酶基因,为信号肽的系统性筛选和木聚糖酶高效表达提供依据。     

木聚糖酶XynB-E18的重组表达纯化及酶学性质测定

为了测定木聚糖酶Xyn B-E18的活性以及酶学特征,采用大肠杆菌原核表达系统对来源于青贮饲料菌群的木聚糖酶Xyn B-E18进行重组表达纯化。在16℃180 r·min-1条件下表达,并通过Ni亲和层析和分子排阻层析的方法进行纯化,用DNS显色法测定其酶学性质。得到的重组蛋白能在大肠杆菌中获得高效表达,纯化后的蛋白溶液纯度达90%以上,蛋白分子量约为38k Da,酶活力可达1782 U,最适反应p H为6.5,在中性偏碱性条件下酶的稳定性较好,最适反应温度为50℃,在50℃以下酶的热稳定性保持较好。实验结果表明Xyn B-E18具有良好的稳定性,可具有更大应用潜力。     

产蛋白酶和淀粉酶芽孢杆菌SDYB-1的分子鉴定及酶学性能研究

对筛选到的一株产蛋白酶和淀粉酶的芽孢杆菌SDYB-1进行分子鉴定和酶学性能研究。克隆了SDYB-1菌株的16S r DNA序列,该序列全长1 548 bp。BLAST显示该菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)同源。以同源性为基础构建了相关属种的系统发育树,该菌株在进化关系上也与枯草芽孢杆菌聚成一族。结合形态学、生理生化特征及16S r DNA分子鉴定,将其鉴定为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis SDYB-1。对枯草芽孢杆菌SDYB-1产酶性能研究表明,蛋白酶活性在接种4 h后快速升高,16 h达到最高值,之后快速下降;淀粉酶活性随培养时间不断增加,至24 h达到最高值,之后快速下降。SDYB-1蛋白酶活性的最适反应温度为60℃,50℃下的稳定性较好;最适p H为8.5,p H 8.5时比较稳定。淀粉酶的最适反应温度为70℃,50℃下表现了很强的稳定性,50 min仍保持原有酶活的97%;最适p H为5.6,在p H 4.6~7.0范围内比较稳定。     

重组枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的纯化和性质研究

研究嗜热枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组酶的纯化和性质。该基因序列全长723bp,编码240个氨基酸。根据基因同源性分析,该壳聚糖酶与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的壳聚糖酶前体基因的同源性最高,为98%。粗酶液经Ni-IDA亲和层析得到电泳级纯酶,比活力高达1 051.8U/mg。经测定,该酶反应最适温度为45℃,最适pH为6.0,在40℃和pH 4.5～8.0下稳定。该酶为内切壳聚糖酶,能够高效降解壳聚糖,生成一系列的壳寡糖,在壳寡糖的制备生产方面具有广阔的应用前景。     

壳聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达研究

克隆了壳聚糖酶基因及其自身信号肽,并将其与p MA5载体连接,利用组成型启动子在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中进行转录表达。结果表明,重组壳聚糖酶工程菌在没有诱导物的条件下实现了表达,同时对壳聚糖酶的酶活性进行了研究,最适温度50℃,最适p H 6,为其工业化奠定了很好的基础。     

启动子及信号肽筛选提高普鲁兰酶在地衣芽孢杆菌中的表达

普鲁兰酶(pullulanase)是一种淀粉脱支酶,在淀粉糖化加工等工业生产中具有重要的应用价值。选用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) BL10作为表达宿主,为了提高其中的普鲁兰酶产量,对来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168和地衣芽孢杆菌BL10中的15种不同信号肽以及4种不同启动子进行筛选,构建了不同的重组工程菌株,最终发现在以P43为启动子、apr为信号肽的条件下,上清液中普鲁兰酶的表达量最高,酶活可达12 U/m L,且测得其最适反应温度为60℃,最适p H为4.5。结果表明通过对启动子及信号肽进行筛选是提高重组工程菌株中目的蛋白表达量的一种有效手段。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时间为6 h,IPTG的最佳诱导浓度为1 mmol/L,且具有良好的热稳定性;在诱导后6 h,耐热β-半乳糖苷酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的20%,表达效率较高;对透析蛋白进行蛋白质定量,蛋白质量浓度为0.75 mg/mL,透析蛋白的耐热β-半乳糖苷酶活性为75 U/mL,比活性为100 U/mg;酶促动力学研究表明,耐热β-半乳糖苷酶的反应常数为0.398μmol/mL,最大反应速度为27.435μmol/(min.mL)。【结论】耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中得到成功表达,并且在很大程度上提高了耐热β-半乳糖苷酶的活性。     

牛型结核分枝杆菌ESAT-6原核表达载体的制备和蛋白纯化

本研究拟构建牛型结核分枝杆菌ESAT-6的原核表达载体,并纯化得到目的蛋白。将牛型结核分枝杆菌ESAT-6的PCR扩增产物连接到p NC-His E载体,构建ESAT6-p NC-His E重组质粒。将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定为阳性;将该阳性枯草芽孢杆菌单菌落接种于培养基中,不需诱导即可分泌表达,离心取上清,并对上清进行纯化、检测,得到目的蛋白。本研究提供一种可快速、简便地获得大量枯草芽孢杆菌分泌性表达ESAT-6蛋白的方法。     

枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶学性质

对枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶学性质进行了研究,结果表明:枯草芽孢杆菌凝乳酶作用的最适反应温度为55℃、最适pH值为5.0,在pH值为6.0时最稳定,在65℃保温60 min酶活基本丧失,Mn2+、Li+、Fe2+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+对该凝乳酶有促进作用,Mg2+、Ca2+促进作用较为明显,而Cu2+对该酶有明显的抑制作用;酶修饰剂中β-巯基乙醇对凝乳酶活力的影响较小,EDTA可抑制该凝乳酶的活力;蛋白酶抑制剂σ-phenantroline可以明显抑制酶活性,证实该酶为金属蛋白酶类。在与商品酶对比中发现枯草芽孢杆菌凝乳酶与商品酶的酶学性质相近。     

芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得不含有信号肽序列的phyC基因表达片段,亚克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K的多克隆位点,并电转化毕赤巴斯德酵母GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子PP9KC.首次在毕赤巴斯德酵母中实现了有生物学活性芽孢杆菌植酸酶的分泌表达,去糖基化试验表明该植酸酶的分子量为53.5 kD和50.9 kD糖基化程度不同的两种糖蛋白.用麦芽汁半合成培养基对PP9KC进行诱导培养,培养48 h后酶活可达到2453 U/mL,表达量为出发菌株的10.5倍.酶学性质分析表明,其酶促反应最适pH值为7.0,最适反应温度为65℃,经90℃处理10 min,残留酶活性为37℃时的78.2%.     

产耐热纤维素酶菌株的筛选及其酶学性质研究

[目的]筛选产耐热纤维素酶菌株,并对其酶学性质进行研究。[方法]分离筛选产耐热纤维素酶的菌株,并用菌种鉴定试剂盒进行鉴定。对产耐热纤维素酶的菌株的酶学性质进行研究。[结果]从江苏淮安土壤中分离出1株产耐热纤维素酶的细菌,将其命名为H3,经菌种鉴定试剂盒初步鉴定为枯草芽孢杆菌。该酶最适反应温度为60℃,最适反应pH值为5.5,Cu^2＋、Mn^2＋对酶活性有一定的激活作用,Mg^2＋、Zn^2＋对酶活性有一定的抑制作用。[结论]该研究为降低纤维素酶生产成本以及推动生物质乙醇的发展提供了科学依据。     

内切葡聚糖酶基因在穿梭载体中的表达研究

将无信号肽编码序列的内切葡聚糖酶基因(GenBankNo.DQ782954)与表达载体PMK4连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性转化子DH5α-PMK4-egls,并将提取的质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600原生质体内,获工程菌WB600-PMK4-egls。同时,通过刚果红染色和SDS-PAGE分析表明,该基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达。通过优化培养基因工程菌,胞外上清液中的酶活力达998U,该酶促反应的最适温度为60℃,最适pH为6.0,且pH在4.5～7.5,温度在30℃～65℃范围内,可保持最高酶活的70%以上。     

脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp. A15木聚糖酶基因xynA15的克隆表达及性质研究

从云南保山市的一眼温泉中分离到一株嗜热嗜酸菌,脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.A15。通过同源克隆和TAIL-PCR方法,从该菌株中克隆得到一个木聚糖酶基因,xynA15,全长990 bp,编码329个氨基酸和一个终止密码子。将xynA15基因克隆到原核表达载体pET-22b(＋)上,并转化至BL21(DE3),经过IPTG诱导,其表达产物具有木聚糖酶的活性。对其酶学性质研究发现,XynA15的最适温度为50℃,最适pH值为70,不仅在较广的温度范围（35℃~60℃）内具有较高的酶活,而且在50℃具有较好的热稳定性。     

碱性蛋白酶PB92在枯草芽孢杆菌中高效转化方法的建立及其分泌表达

枯草芽孢杆菌转换效率低一直制约着该菌基因改造技术的应用,本研究比较了化学法和高渗电转化法对枯草芽孢杆菌转化率的影响,发现高渗电转化法的转化效率较高.从Bacillus alcalophillus PB92中扩增出碱性蛋白酶基因Mapr,构建成重组分泌型表达载体pWB980-Mapr,碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌DB104中得到表达.SDS-PAGE 分析,重组蛋白酶的分子量为 28 000.pWB980-Mapr在枯草芽孢杆菌中表达的酶活为1 563 U/ml.     

表达PEDV-S1蛋白的重组枯草芽孢杆菌构建及鉴定

猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起新生仔猪严重腹泻和死亡,给养猪业造成巨大经济损失。根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)调节动物胃肠道菌群平衡的功能和结构特征,选择其作为PEDV S1蛋白表达的宿主菌,构建重组基因工程枯草芽孢杆菌。实验将重组质粒p LA-PEDV-S1电转至枯草芽孢杆菌,提取枯草芽孢杆菌的重组质粒,采用PCR、Western blot和免疫荧光方法鉴定阳性质粒DNA。获得了重组pLA-PEDV-S1/B.Subtilis,S1蛋白成功展示表达在菌体表面,重组PEDV S1蛋白能够和猪源PEDV阳性血清结合,具有反应原性。该重组菌可能成为预防PEDV感染的口服疫苗候选菌株。     

果胶裂解酶、木聚糖酶及果胶裂解酶、木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

运用RT-PCR技术,从绿色木霉(AS3.3711)mRNA中扩增出木聚糖酶基因xyn2,并与质粒pPIC9K相连,构建了表达载体pPIC9K-xyn2,转化毕赤酵母GS115,并且将pPIC9K-xyn2和pPIC9K-PelC(果胶裂解酶)同时转化毕赤酵母GS115,通过组氨酸营养缺陷型筛选,G418高拷贝菌株筛选,以及摇瓶诱导表达筛选,分别得到一株高表达木聚糖酶毕赤酵母菌株X5和一株同时高表达木聚糖酶和果胶裂解酶毕赤酵母菌株PX6。同时,将一株高表达果胶裂解酶毕赤酵母菌株P2保存。重组酶酶学性质分析表明,P2和PX6分泌果胶裂解酶,X5和PX6分泌木聚糖酶最适温度均为50℃;P2分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为14.2U/mL;X5分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为5.8U/mL;PX6分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为12.6U/mL,分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为4.2U/mL。     

来源于瓶霉Phialophora sp. G5的酸性木聚糖酶基因的克隆及性质的研究

通过简并PCR和TAIL-PCR技术从瓶霉Phialophora sp. G5菌株基因组DNA中克隆得到一个新的编码b-1,4-木聚糖酶的基因,命名为xyn11G5。该基因ORF全长879 bp,共编码292个氨基酸和一个终止密码子,前19个氨基酸为信号肽序列。将xyn11G5在毕赤酵母中进行分泌表达,重组蛋白经纯化达到电泳纯。酶学性质分析表明,该重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为5.0,在中性条件下具有良好的稳定性,并且具有一定的热稳定性,在饲料行业和生物能源行业领域具有潜在的应用前景。     

红色亚栖热菌耐热木聚糖酶的克隆表达及生物信息学分析

从自主分离的Meiothermus.rubber菌株的基因组中克隆到木聚糖酶基因,并进行了超量表达、重组酶的纯化和酶学性质研究。结果表明,重组木聚糖酶Mru是热稳定性酶,最适反应温度为65℃,能够有效降解木聚糖产生木糖和木二糖。生物信息学分析发现,木聚糖酶Mru与数据库中来自亚栖热菌的木聚糖酶的同源性为60%~100%。在木聚糖酶Mru的结构模型中,GH10木聚糖酶的保守位点大多位于β折叠,α螺旋保守性很低。本研究揭示,木聚糖酶Mru代表一类新型热稳定性GH10木聚糖酶。