乳酸杆菌S-层蛋白对产肠毒素大肠杆菌黏附Caco-2细胞的协同作用

设计3种黏附试验分别研究了嗜酸乳酸杆菌和S-层蛋白对产肠毒素大肠杆菌黏附Caco-2细胞的影响。结果显示:在置换试验中,嗜酸乳酸杆菌及S-层蛋白对产肠毒素大肠杆菌黏附Caco-2细胞没有影响;但在排斥试验和竞争试验中,嗜酸乳酸杆菌及S-层蛋白均对产肠毒素大肠杆菌黏附Caco-2细胞产生明显的协同作用,在排斥试验中嗜酸乳酸杆菌及S-层蛋白分别增加产肠毒素大肠杆菌的黏附数量95.23%±4.22%(P0.01)和352.30%±2.26%(P0.01),在竞争试验中分别增加389.06%±3.35%(P0.01)和55.57%±5.81%(P0.05);并且S-层蛋白在排斥试验中,对产肠毒素大肠杆菌的协同黏附作用大于竞争试验中的协同黏附作用。可见,乳酸杆菌对产肠毒素大肠杆菌的协同黏附作用关键在于S-层蛋白,S-层蛋白可能起到"连接桥"的作用。     

菌酶协同发酵对鱼废弃物中氨基酸组成及含量的影响

为提高鱼废弃物发酵产物中游离氨基酸的含量,以鲭鱼废弃物为原料,设置了添加戊糖片球菌（CK）、戊糖片球菌+酵母菌（FJ）、戊糖片球菌+酵母菌+木瓜蛋白酶（FJM）、戊糖片球菌+酵母菌+风味蛋白酶（FJF）、戊糖片球菌+产朊假丝酵母菌（FC）、戊糖片球菌+产朊假丝酵母菌+木瓜蛋白酶（FCM）、戊糖片球菌+产朊假丝酵母菌+风味蛋白酶（FCF）7个处理进行发酵,采用高效液相色谱法测定了发酵后样品中的氨基酸含量,并进行了主成分分析和聚类分析。结果表明：不同处理的鱼废弃物发酵产物中均检测出21种游离氨基酸;与CK相比,FC、FJ、FCF、FCM、FJF和FJM有3～16种氨基酸显著上升,游离氨基酸总量显著增加了12.84%～62.50%。通过主成分分析和聚类分析得出,与CK相比,各处理对鱼废弃物发酵产物中的游离氨基酸产生了一定影响,其中FJM的综合得分最高,说明添加戊糖片球菌、酵母菌与木瓜蛋白酶进行菌酶协同分段发酵对鱼废弃物中游离氨基酸的形成最为有利。     

可结合Caco-2细胞表面蛋白的副溶血弧菌外膜蛋白的筛选与鉴定

[目的]筛选可结合Caco-2细胞表面蛋白的副溶血弧菌外膜蛋白。[方法]筛选副溶血弧菌外膜中的黏附蛋白,将Caco-2细胞表面蛋白生物素化并固定于中性卵白素树脂上,进一步利用亲和层析技术来筛选副溶血弧菌的外膜蛋白。[结果]通过LC-MS/MS质谱技术鉴定出3个候选蛋白:ATP synthase subunit alpha、ATP synthase subunit beta和outer membrane protein U。通过对这3个蛋白进行克隆基因和原核表达,成功纯化得到相应重组蛋白。通过进一步的间接免疫荧光试验,发现3种蛋白对于Caco-2细胞均有黏附作用。[结论]推测ATP synthase subunit alpha、ATP synthase subunit beta和outer membrane protein U这3种蛋白可能是潜在的黏附因子。     

绿色魏斯氏菌对单增李斯特菌毒力特性的影响

[目的]本文旨在研究绿色魏斯氏菌与单增李斯特菌共存对单增李斯特菌的生长能力、毒力基因表达及细胞黏附能力的影响,揭示乳酸菌与单增李斯特菌之间的交互作用机制。[方法]采用膜隔离装置,取4℃贮藏条件下放置0、12、24、48和96 h的菌悬液分别测定单增李斯特菌和绿色魏斯氏菌的数量,同时提取单增李斯特菌的RNA进行反转录和荧光定量PCR,分析单增李斯特菌6种主要毒力基因(hly A、prf A、bsh、act A、sig B和inl A)的表达情况。利用Caco-2细胞进行绿色魏斯氏菌与单增李斯特菌的竞争、排斥和置换试验,观察单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附效果。[结果]产细菌素绿色魏斯氏菌C1可降低单增李斯特菌的数量,而不产细菌素绿色魏斯氏菌C2对单增李斯特菌的生长影响不大。C1和C2的代谢产物使单增李斯特菌6种毒力基因表达量下调,且C1导致的下调趋势比C2大。C1主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附,而C2的作用较弱。[结论]产细菌素绿色魏斯氏菌C1比不产细菌素绿色魏斯氏菌C2能够更好地控制单增李斯特菌的生长,抑制相关毒力基因的表达,并主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附。产细菌素绿色魏斯氏菌C1可作为单增李斯特菌的防控菌株。     

具抑菌活性乳酸菌筛选及抑菌活性物质分析

以大肠杆菌O157∶H7为指示菌,采用spot-on-lawn法从食源性乳酸菌菌种库中筛选获得2株高抑菌活性乳酸菌,基于16S rRNA基因序列分析,分别鉴定为戊糖片球菌和发酵乳杆菌。利用改良牛津杯法测定2株乳酸菌发酵浓缩液对常见食源性病原菌的抑菌谱,并分析蛋白酶K、pH值、温度对抑菌物质活性的影响,结果发现2菌株均能显著抑制大肠杆菌和李斯特菌,其中戊糖片球菌发酵液具有更明显广谱抑菌效果;发酵液抑菌活性均受pH值影响,戊糖片球菌发酵液对蛋白酶、热敏感,发酵乳杆菌发酵液对蛋白酶、热不敏感。研究结果表明,戊糖片球菌发酵液抑菌活性物质有多肽(蛋白)和有机酸,发酵乳杆菌来源的抑菌物质化学成分是一些具有热稳定性的有机酸。该研究获得乳酸菌可以用于食品发酵和防腐领域,且为抑菌物质分离、鉴定和抑菌机制研究奠定基础。     

丹江口库区土著Pediococcus pentosaceus菌株的分离鉴定及发酵培养基的优化

[目的]筛选出具有自主知识产权、良好适应库区环境的土著戊糖片球菌菌株,再通过对戊糖片球菌的发酵培养基进行条件优化,降低戊糖片球菌的发酵成本。[方法]采用MRS培养基从库区的青贮饲料中分离目的菌株,并进行16S rRNA的分子鉴定,再分别对戊糖片球菌发酵培养基中的碳源种类、碳源浓度、氮源种类、氮源浓度、无机盐离子及离子浓度进行优化。[结果]获得了1株具有自主知识产权的土著Pediococcus pentosaceus菌株,命名为Pediococcus pentosaceus NY001;优化得到较适宜的发酵培养基为葡萄糖40g/L、酵母粉40g/L、MgSO₄·7H₂O 1.0g/L,在此条件下,戊糖片球菌的最大发酵活菌数可达2.2×10⁹ CFU/mL,显著高于初始发酵水平(2.5×10⁷CFU/mL)的88倍。[结论]该研究为肠道益生菌的发酵培养及后续畜禽无抗健康养殖研究奠定了坚实基础。     

戊糖片球菌摇瓶种子培养基的优化

[目的]对戊糖片球菌摇瓶种子培养基进行优化,为高效、优质的微生态制剂产品研制奠定基础.[方法]通过单因素试验和正交试验,对戊糖片球菌摇瓶种子培养基进行优化研究.[结果]获得最优的种子培养基配方为:葡萄糖3.5;、酵母粉1.0;、牛肉膏1.0;、乙酸钠0.6;、磷酸氢二钾0.2;、柠檬酸氢二铵0.2;、硫酸镁0.04;、硫酸锰0.009;、吐温80 1.5 mL、碳酸钙1.0;.培养周期为18 h.[结论]戊糖片球菌在优化的培养基培养下活菌数达到8.6×109 CFU/mL.     

戊糖片球菌C1C-4菌株培养基、发酵条件及其发酵产品储藏温度的优化

【目的】优化戊糖片球菌C1C-4发酵工艺,获取活菌数高、经济效益好的菌株制剂。【方法】以活菌数为参考指标,采用单因子试验和正交试验对其发酵培养基主要成分氮源、碳源、无机盐质量浓度进行优化,在此基础上对其生长曲线进行测定并对其发酵产物保存温度做优化。【结果】方差分析表明,氮源和碳源对戊糖片球菌的生长有显著影响(P<0.05),无机盐的影响则不显著(P>0.05)。正交试验得到的最优培养基配比为豆粕粉35g/L、蔗糖35g/L、无机盐1.5g/L,相应的活菌数为6.02×109 CFU/mL。采用优化过的培养基对戊糖片球菌进行摇菌培养,结果表明戊糖片球菌在0~8h生长缓慢;12~24h则进入对数生长期;28h过后为平台期,发酵时间以28~32h为最优。高温(37℃)和常温(25℃)比低温(4℃)条件下戊糖片球菌菌粉活菌数随时间下降更快,保存时间较短,故戊糖片球菌菌粉应置于低温环境下保存。【结论】培养基成分和发酵条件的优化提高了戊糖片球菌的发酵效率,储藏温度的优化能延长发酵产品的保质期。     

乳酸菌及其相应的上清液对凡纳滨对虾存活率、生长性能、免疫反应和抗病性的影响

试验分别从商业益生菌及中国明对虾和矛尾刺虾虎鱼的肠道中分离出53株乳酸菌(LAB)菌株,并对这些菌株的抗菌性和黏附活性进行测定。结果表明,戊糖乳杆菌HC-2和屎肠球菌NRW-2分别具有较高的抗菌性和黏附活性,菌株的鉴定是基于16S r RNA基因序列分析方法。本研究的目的是探讨和比较屎肠球菌NRW-2、L-戊糖乳杆菌HC-2及其相应上层清液对虾(南美白对虾)的生长性能和免疫反应的影响,采用实时荧光定量PCR方法检测中肠、肝胰腺中免疫和消化相关基因的表达水平。研究结果表明,屎肠球菌NRW-2对所有测试的基因有较强的刺激作用,除了喂养2周后中肠Crus tin基因和4周后的pro PO基因,而L-戊糖乳杆菌HC-2和相应的上清液在肝胰腺中有较强的基因诱导作用。根据激发实验,所有治疗组的存活率均显著高于对照组。此外,饲喂菌株的对虾特定生长率比对照组高,而L-戊糖乳杆菌HC-2组低于对照组,但差异不显著。研究表明,所选择的菌株可以用作虾饮食的有效成分,且比L-戊糖乳杆菌HC-2的上层清液效果更好。     

枯草芽孢杆菌拮抗病原菌黏附和入侵Caco-2细胞的研究

为探讨枯草芽孢杆菌及其培养上清液对产肠毒素大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抗黏附作用,本试验将产肠毒素大肠杆菌K88或鼠伤寒沙门氏菌SL1344与枯草芽孢杆菌及其培养上清液先后加到Caco-2细胞上,用活菌计数的方法观察产肠毒素大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌及枯草芽孢杆菌黏附Caco-2细胞的情况。结果显示:在排斥、竞争和置换试验中,枯草芽孢杆菌菌体均能够明显抑制K88和SL1344的黏附及SL1344的内化,在竞争试验时K88的黏附减少了71.2%、SL1344的黏附及内化减少了92.9%,但枯草芽孢杆菌的培养上清液只有在竞争试验中才能明显抑制K88和SL1344的黏附及SL1344内化。提示:枯草芽孢杆菌通过与病原菌竞争黏附位点来抑制病原菌对Caco-2细胞的黏附和入侵。     

产类细菌素乳酸菌的筛选及培养条件优化

从紫花苜蓿青贮、牛奶及奶酪、酸菜中的分离到4株可产生类细菌素菌株,即戊糖乳杆菌（Lactobacilluspentosus）、植物乳酸菌（Lactobacillusplantarum）、戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）、丙酸杆菌（Propionibacterium）。粗提4株细菌的发酵液对金黄色葡萄球菌有较强的抑制生长作用,对大肠杆菌的抑制作用较弱。4株分离菌类细菌素在80℃热处理15min后活性基本不变,100oC处理15min仍保持一定活性;在pH3～5范围内抑菌活性较强。胃蛋白酶、胰蛋白酶均可使该类细菌素完全失活;酸性蛋白酶不能使其失活。对分离株戊糖乳杆菌培养条件优化后,在30℃（pH值为6．0）条件下,选择碳氮质量分数为5％、碳氮质量比为3：2,添加MgS040．07g／100ml,MnSO4 0．05g／100ml,0．2ml／100mlTween-80有利于类细菌素的产生,抑菌直径可达18．2mm,是传统培养基配方抑菌效果的1．2倍。     

类M蛋白对HEp-2细胞的黏附作用

采用通用的模式细胞HEp 2作黏附及黏附抑制试验 ,研究马链球菌兽疫亚种ATCC35 2 4 6株类M蛋白的黏附作用。结果表明 ,ATCC35 2 4 6株可以黏附HEp 2细胞。用重组表达的类M蛋白鼠抗血清处理ATCC35 2 4 6 ,可抑制其对HEp 2细胞的黏附 ,最大抑制率达 81 4 % ;而ATCC35 2 4 6的全菌鼠抗血清在 1∶80 0时能完全抑制它对HEp 2细胞的黏附。此外 ,热酸提取的ATCC35 2 4 6株的类M蛋白和重组表达的类M蛋白可不同程度地抑制该菌株的黏附 ,前者在 16 0μg·mL-1有最大的黏附抑制率 ( 4 0 % ) ,而后者在 6 0 μg·mL-1的黏附抑制率可达最高值 ( 2 3% )。结果显示 ,类M蛋白是ATCC35 2 4 6株的黏附素之一 ,在对细胞的黏附过程中发挥作用     

鸡源戊糖片球菌微胶囊制剂对肉仔鸡生产性能和免疫器官指数的影响

【目的】探讨戊糖片球菌微胶囊的最佳包埋条件及该微胶囊制剂对肉仔鸡生产性能和免疫器官指数的影响。【方法】以从散养成年地方鸡种(草科鸡)公鸡盲肠筛选得到的戊糖片球菌(编号CGMCC No.6566)为对象,设计L9(34)正交试验,筛选制备该戊糖片球菌微胶囊的最佳配方,并检测该制剂对人工胃液的耐受性、肠溶性及贮存稳定性。将120只1日龄健康AA肉鸡随机分成两组,组内3个重复,对照组饲喂基础日粮,饲喂组在基础日粮中以拌料的方式添加1g/kg戊糖片球菌微胶囊,饲喂6周,对肉仔鸡生产性能和免疫器官指数进行测定。【结果】①戊糖片球菌微胶囊包埋产率最高可达80.44%,且产品具有较好的耐酸性与肠溶性,在室温(20℃)下具有较好的贮存稳定性;②饲喂戊糖片球菌显著提高了肉仔鸡的生产性能,全期平均增重较未添加组(对照组)提高13.36%,料肉比降低6.07%,显著提高胸肌率和腿肌率,胸肌率较未添加组提高15.58%,腿肌率提高11.07%,胸腺、脾脏、法氏囊指数与对照组比较差异不显著。【结论】在试验期内持续添加戊糖片球菌微胶囊可提高肉鸡饲料利用率,提高生长性能,同时也能改善肉鸡产肉性能。     

戊糖乳杆菌的分离及其发酵特性

对酱腌菜中的戊糖乳杆菌进行分离鉴定后研究其在蔬菜汁培养基中生长特性,并利用优良戊糖乳杆菌菌株发酵泡菜。结果分离得到11株乳酸杆菌,5株为戊糖乳杆菌,其中2株戊糖乳杆菌在蔬菜汁培养基中生长良好,分别为戊糖乳杆菌Mao62和戊糖乳杆菌Tang32。利用这两株菌分别接种发酵泡菜,结果表明,发酵时间较自然发酵泡菜短,且产品感官品质优良。     

南安板鸭发酵工艺技术研究

利用植物乳杆菌、戊糖片球菌、木糖葡萄球菌和变异微球菌混合发酵生产发酵型南安板鸭。采用正交试验,得到最佳的发酵工艺条件为：植物乳杆菌、戊糖片球菌、木糖葡萄球菌与变异微球菌之间的比例为1∶1∶2∶2,发酵温度为30℃,发酵时间为18 h,接种量为3%。经混合发酵后,氨基酸态氮含量增加,板鸭风味增强,营养价值提高。     

金黄色葡萄球菌黏附素及其靶位疫苗的研究进展

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原体,因其具有细胞内定殖和对抗生素极易产生耐药性的特点,使得用抗生素治疗的效果越来越差,为此疫苗防治成为首选。黏附素在金黄色葡萄球菌致病过程中起着至关重要的作用,在金黄色葡萄球菌感染的早期,黏附素是最重要的致病因子,只有当金黄色葡萄球菌黏附到宿主细胞上,毒素和荚膜才能开始表达。因此阻断金黄色葡萄球菌感染的初始阶段,特别是阻止细菌黏附到细胞和定殖在黏膜表面,将是预防和治疗奶牛乳腺炎的最有效途径。因此近些年研究者致力于黏附素的结构及功能的研究,试图以黏附素为靶点设计金黄色葡萄球菌疫苗。本研究对近几年黏附素的种类和作用,以及其相关疫苗的研究进行了综述。     

苜蓿青贮用戊糖片球菌的选育

通过单因素试验和正交试验设计,对戊糖片球菌种子培养基条件进行了筛选。确定了戊糖片球菌最优培养基,从碳源、氮源的筛选确定产酸培养基如下:葡萄糖2%,蛋白胨0.5%,酵母膏0.5%,KH_2PO_40.1%,Tween80水溶液0.5%,CaCO_32%。培养条件:于37℃,静置培养24h。     

益生菌增加IPEC-J2细胞表面半乳糖在抑制RV感染中的作用

轮状病毒通过识别细胞表面糖链附着于肠上皮细胞,一些肠道内常驻菌群可以修改细胞表面糖链。以3种益生菌上清孵育猪小肠上皮细胞IPEC-J2,猪轮状病毒(PRV)感染细胞。采用凝集素荧光技术测定各处理组IPEC-J2细胞表面半乳糖,检测对应轮状病毒滴度和RV含量变化。结果表明,对照组PRV TCID_(50)·0.1 mL~(-1)为10~(-7.15±0.14),干酪乳杆菌组TCID_(50)·0.1mL~(-1)为10~(-3.875±0.125),食淀粉乳杆菌PRV TCID_(50)·0.1 mL~(-1)为10~(-4.125±0.138),枯草芽孢杆菌PRV TCID_(50)·0.1 mL~(-1)为10~(-4.16±0.144)。3组益生菌上清组在RV感染48 h内,RV量显著低于未处理组。凝集素荧光标记表明,3株益生菌上清均可改变细胞表面半乳糖含量。干酪乳杆菌、食淀粉乳杆菌和枯草芽孢杆菌上清可增加IPEC-J2细胞表面半乳糖含量,提高细胞抗RV感染能力,阻断RV黏附,保护肠道上皮细胞。     

4种花色苷在Caco-2细胞单层模型的转运吸收规律

以Caco-2单层细胞为体外吸收评价模型，以矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cy-3-G)、飞燕草素-3-葡萄糖苷(Dp-3-G)、锦葵素-3-葡萄糖苷(Mv-3-G)、天竺葵素-3-葡萄糖苷(Pg-3-G)为对象，研究其跨膜吸收规律。结果表明，在相同浓度下，4种花色苷在Caco-2细胞单层模型中的吸收表现为Mv-3-G最高，其次依次为Pg-3-G、Cy-3-G、Dp-3-G,它们在Caco-2细胞的吸收过程中均存在外排现象，但是相互间的外排率无显著性差异。花色苷在Caco-2单层细胞吸收过程中的双向转运对时间有一定依赖性，正向的转运吸收作用比反向的外排作用大，且存在显著方向性，参与吸收的途径有主动运输和被动运输。花色苷苷元结构上的基团差异可能是导致其跨膜吸收差异的结构基础，转运方式的不同是其吸收差异的另一个原因。     

羽衣甘蓝花青素的定位及含量成分测定

为鉴定羽衣甘蓝植株中花青素的分布及组成，利用徒手切片制作临时装片在光学显微镜下观察紫叶羽衣甘蓝和白叶羽衣甘蓝纯系茎和叶中花青素的分布情况，测定紫叶羽衣甘蓝叶片中花青素相对含量，并通过HPLC-MS技术对叶片中花青素成分进行分析。结果表明:花青素主要分布于叶表皮细胞邻近的叶肉细胞，并以下表皮邻近叶肉细胞居多，茎中花青素集中分布在表皮细胞及表皮下的薄壁细胞中，整个茎表现为越靠近上部花青素分布越少；白叶羽衣甘蓝心叶、外叶和茎中均未观察到花青素类物质的存在。在10 ℃条件下生长的叶片(心叶和外叶)中花青素含量显著高于20 ℃条件中生长的叶片中的含量。紫叶羽衣甘蓝中共鉴定出9 种花青素苷，分别为矢车菊素-3-葡萄糖-5-葡糖苷、矢车菊-3-槐糖-5-葡糖苷、矢车菊素-3-槐糖(对香豆酰)-5-葡糖苷、矢车菊素-3-槐糖(咖啡酰)-5-葡糖苷、矢车菊素-3-槐糖(阿魏酰)-5-葡糖苷、矢车菊素-3-槐糖(草酸酰-对羟基苯甲酰)-5-葡糖苷、矢车菊素-3-槐糖(芥子酰)-5-葡糖苷、飞燕草-3-葡糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖(咖啡酰)-5-葡糖苷。紫叶羽衣甘蓝叶片中含有丰富的高度酰基化和糖苷化的花青素苷，是一种值得开发的新型花青素苷应用产品资源。