日本百脉根牻牛儿基牻牛儿基氢化酶的电子克隆及进化分析

根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学的方法,以拟南芥牻牛儿基牻牛儿基氯化酶（GGH）基因cDNA序列为信息探针,搜索GenRank中的HTGs数据库,找到一个与之高度匹配的日本百脉根基因组DNA序列LJT46M09,用GENSCAN软件分析该序列得到一个包含2个外显子和1个内含子的基因。以此基因序列BLAST检索GenBank中的est-others数据库获得了同源的EST片段。进行EST拼接后得到该基因的cDNA序列,GenBank登录号为DQ013361,由1389bp核苷酸组成,具有完整的开放阅读框架（ORF）,推测编码蛋白为462个氨基酸。推导的氨基酸序列与大豆、截形苜蓿、烟草、拟南芥、小麦、水稻的牻牛儿基牻牛儿基氢化酶基因氨基酸序列的一致率分别为91％、89％、84％、81％、73％、74％。访基因与叶绿素等的生物合成有关。     

基于转录组信息的艾纳香牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(BbGGPS)的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE(Rapid amplification of c DNA ends)技术,从艾纳香(Blumea balsamifera L·DC)的叶片中克隆到二萜化合物合成的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Bb GGPS)基因。结果显示:Bb GGPS基因的c DNA全长1475 bp,包含开放阅读框(ORF)1002 bp,编码334个氨基酸;亚细胞结构定位于叶绿体,既非膜蛋白也非分泌性蛋白。疏水性分析显示,Bb GGPS是亲水性蛋白。同源性比对结果显示,Bb GGPS蛋白与其他植物中GGPS蛋白具有高度的相似性。系统发育分析表明,所有序列被聚为5大类,Bb GGPS与菊科植物刺菜蓟聚(Cynara cardunculus var)为一类,表明与其亲缘关系最近。     

芥蓝牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因BoaGGPPS1的克隆及表达分析

本试验以芥蓝为试验材料,通过同源序列检索分析设计特异性引物,采用反转录PCR方法成功分离出芥蓝GGPPS1基因。BoaGGPPS1基因CDS全长为1 113 bp,编码370个氨基酸。生物信息学分析结果显示,BoaGGPPS1蛋白的等电点为6.07,相对分子量为39 790,不含跨膜结构域和信号肽。序列分析结果显示,BoaGGPPS1与其他植物GGPPS高度保守,与结球甘蓝的一致性最高,达到98%。系统进化树分析结果表明,BoaGGPPS1与十字花科其他植物的亲缘关系较近,与结球甘蓝的亲缘关系最近。BoaGGPPS1基因在芥蓝不同器官中均有表达,其中叶片中的表达量最高,根系中的表达量最低。构建原核表达载体p EASY-Blunt E1-BoaGGPPS1,并对其进行诱导表达,结果发现该蛋白在大肠杆菌体内主要以包涵体的形式存在。     

红豆杉香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因克隆分析

20碳单位的香叶基香叶基焦磷酸是紫杉醇生物合成的直接前体,它由香叶基香叶基焦磷酸合成酶催化生成.采用RT-PCR技术从高原植物西藏红豆杉中克隆了编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因,命名为TwGGPPS(Gen-Bank登录号:DQ 364604).该基因编码区长为1 182 bp,编码393个氨基酸的多肽;生物信息学分析表明TwGGPPS定位于质体,在其氨基端具有长为18个氨基酸的质体转运肽;TwGGPPS属于异戊烯基转运酶家族,具有该酶家族特有的2个天冬氨酸富集基序;分子系统进化分析表明植物的GGPPS分为被子植物和裸子植物2种类型,TwGGPPS属于裸子植物类型的GGPPS;对TwGGPPS的蛋白质结构模拟分析结果表明,TwGGPPS由大量的α-螺旋通过随机卷曲连接而成,这些α-螺旋环绕形成一个袋状空腔,其空腔口部为底物结合与碳链延伸的活性部位.对TwGGPPS基因组结构的分析表明该基因没有内含子.该基因的克隆和分析为实现紫杉醇的基因工程提供了一个重要的基因和作用靶点.     

日本百脉根■牛儿基■牛儿基氢化酶的电子克隆及进化分析

根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学的方法,以拟南芥牛儿基牛儿基氢化酶(GGH)基因cDNA序列为信息探针,搜索GenBank中的HTGs数据库,找到一个与之高度匹配的日本百脉根基因组DNA序列LJT46M09,用GENSCAN软件分析该序列得到一个包含2个外显子和1个内含子的基因。以此基因序列BLAST检索GenBank中的est-others数据库获得了同源的EST片段。进行EST拼接后得到该基因的cDNA序列,GenBank登录号为DQ013361,由1 389 bp核苷酸组成,具有完整的开放阅读框架(ORF),推测编码蛋白为462个氨基酸。推导的氨基酸序列与大豆、截形苜蓿、烟草、拟南芥、小麦、水稻的牛儿基牛儿基氢化酶基因氨基酸序列的一致率分别为91%、89%、84%、81%7、3%、74%。该基因与叶绿素等的生物合成有关。     

河北省牻牛儿苗科野生植物资源研究

为了掌握更多的河北省牻牛儿苗科(Geraniaceae)野生植物种质资源状况,实现对该科植物的可持续利用,该文通过在网络、书籍中获取信息,进行资料整理,对牻牛儿苗科的资源价值进行了分析,结果表明:河北省牻牛儿苗科野生植物共3属,16种,有1变种。药用、观赏植物资源丰富,其中药用植物10种,观赏植物6种。经过对河北省牻牛儿苗科野生植物种质资源信息进行整理分析,为人类对该科植物进行合理的开发利用以及保护提供理论依据,对想要更深入了解、开发更多用途的人们提供便利,并根据野生植物资源现状提出保护建议。     

红豆杉香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因克隆分析

20碳单位的香叶基香叶基焦磷酸是紫杉醇生物合成的直接前体,它由香叶基香叶基焦磷酸合成酶催化生成。采用RT-PCR技术从高原植物西藏红豆杉中克隆了编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因,命名为TwGGPPS（GenBank登录号：DQ364604）。该基因编码区长为1182bp,编码393个氨基酸的多肽;生物信息学分析表明TwGGPPS定位于质体,在其氨基端具有长为18个氨基酸的质体转运肽;TwGGPPS属于异戊烯基转运酶家族,具有该酶家族特有的2个天冬氨酸富集基序;分子系统进化分析表明植物的GGPPS分为被子植物和裸子植物2种类型,TwGGPPS属于裸子植物类型的GGPPS;对TwGGPPS的蛋白质结构模拟分析结果表明,TwGGPPS由大量的α-螺旋通过随机卷曲连接而成,这些α-螺旋环绕形成一个袋状空腔,其空腔口部为底物结合与碳链延伸的活性部位。对TwGGPPS基因组结构的分析表明该基因没有内含子。该基因的克隆和分析为实现紫杉醇的基因工程提供了一个重要的基因和作用靶点。     

茉莉花JsGGPPS基因的克隆及生物信息学与表达分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(Geranylgerany pyrophosphate synthase,GGPPS)是萜烯类香气物质合成途径中的关键酶。采用RT-PCR和RACE相结合的方法,克隆了茉莉花牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因的全长cDNA(命名为JsGGPPS,GenBank登录号AIY24421.1),采用实时荧光定量PCR技术分析JsGGPPS基因在茉莉花开放过程中的表达模式。结果表明,JsGGPPS全长cDNA为1 410bp,含1 083bp完整的开放阅读框(ORF),其推导的氨基酸序列包含360个氨基酸,属于trans-isoprenyl diphosphate synthases(IPPS)和class I terpene cyclases家族,含链长控制区(CLDR)、2个天冬氨酸富集区以及其他保守区。JsGGPPS基因与独行菜Lepidium apetalum、橡胶草Taraxacum kok-saghyz的同源性分别为91%、86%。实时荧光定量PCR结果表明,茉莉花开放过程中JsGGPPS基因在晚上18:00时表达量较低,呈上调趋势,在22:00时达到最高,呈下调趋势,在翌日2:00时表达量最低,与茉莉花释香趋势相似,为深入研究茉莉花萜烯类香气物质代谢途径奠定基础。     

番茄GGPS2基因的克隆与表达载体的构建

牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)在牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成、植物代谢和生长发育中具有重要作用.采用RT-PCR的方法,从番茄品种Solanum lycopersicon L.cv.Ailsa Craig成熟果实中扩增出GGPS2基因,分别构成了该基因的原核与植物表达载体.     

水分胁迫对广西莪术产量及牻牛儿酮含量的影响

通过控制广西莪术不同生长期的土壤含水量,研究了轻度、重度干旱胁迫和涝渍胁迫3个处理对广西莪术产量及挥发油中牻牛儿酮含量的影响,以探讨广西莪术产量及挥发油的生物合成过程与土壤含水量的关系,为广西莪术的合理栽培及质量控制提供科学依据。结果表明,轻度胁迫处理对莪术产量及存活量无显著影响;经重度干旱胁迫及涝渍胁迫处理后,莪术产量和存活率显著降低;轻度和重度干旱条件下能促进牻牛儿酮含量的积累,因此在莪术整个生长期可进行适度的干旱胁迫(土壤含水量为10%～15%),能提高牻牛儿酮含量,且对莪术产量不造成影响。     

洋常春藤法呢基焦磷酸合酶基因的克隆与序列分析

以洋常春藤叶片为材料,采用同源RT–PCR方法,克隆获得了洋常春藤法呢基焦磷酸合成酶基因,其c DNA序列大小为1 050 bp,开放阅读框为1 026 bp,推测编码342个氨基酸残基,该序列的核苷酸、氨基酸与五加科植物有同源性;用在线数据软件进行分析,推测该蛋白可能存在于细胞质之中,定位在细胞膜外,FPS蛋白的相对分子质量为39 735.7;该蛋白含有2个天冬氨酸保守结构域,其二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主;双子叶植物系统进化树分析结果表明,洋常春藤的FPS与刺五加、人参、三七、西洋参、辽东楤木的FPS亲缘关系最近,这一结果符合传统的分类法规则。     

甜荞FaeseuFUL基因的克隆和序列结构分析

利用基因同源克隆技术结合3' RACE和5' RACE基因克隆技术,从甜荞(Fagopyrum esculentum)花芽中克隆到1个与花序分生组织发育和果实发育等过程中起到重要作用的euFUL基因的同源基因FaeseuFUL(GenBank登录号为KM386626).序列分析表明,其cDNA全长1060bp,包括38bp的5'-UTR、1个编码231个氨基酸的696bp的完整开放阅读框以及326bp的3’-UTR.蛋白质分子序列比对和分子系统进化分析表明,FaeseuFUL基因是MIKC-type MADS-box基因,属于AP1/ SQUA亚家族的euFUL进化系,与拟南芥的AGL8/FUL的同源基因相似性达到81.4％,其编码区的C末端含有euFUL进化系的FUL基序和paleoAP1基序.     

陆地棉GhWOX4转录因子的克隆与生物信息学分析

采用反转录PCR(简称RT-PCR)技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中克隆获得1个WOX基因,命名为Gh WOX4(NCBI登录号:KX900572)。序列分析显示,Gh WOX4的开放阅读框为657 bp,编码含218个氨基酸残基的蛋白,具有典型高度保守的同源异型HD结构域,属于WOX转录因子家族。生物信息学分析表明,该基因蛋白相对分子量为25.19 ku,等电点为10.04,为不稳定蛋白。二级结构以无规则卷曲为蛋白最大量的结构元件。与其他植物同源基因序列比对显示,其同源区域主要集中在同源异型HD结构域。系统进化树分析表明,Gh WOX4属于Ⅰ类家族成员,与陆地棉Gh_D01G1055、拟南芥At WOX4和可可树Tc WOX4等亲缘关系最近,处于同一个进化分支,推测其可能与之前报道的拟南芥WOX基因类似,参与植物维管束及花器官发育。     

洋葱AcPME基因的克隆及序列分析

以洋葱花蕾为试材,通过RACE试验获得了Ac PME基因的全长c DNA序列,Gen Bank登录号为JF913196.1。该基因DNA序列包含2 786个碱基,4个外显子,3个内含子,c DNA序列长度为2 228 bp,编码序列长度为2 001 bp,编码666个氨基酸。生物信息学分析显示Ac PME蛋白存在明显的信号肽和跨膜区域(SP/TM)、PMEI结构域和PME结构域,在PME家族分类中属于第Ⅰ类,即含有一个长的N末端前区域(PRO-region)。氨基酸同源比对与系统进化分析表明,Ac PME蛋白与水稻、玉米、高粱等单子叶植物的同源蛋白具有较高的一致性。三维结构模式图显示该蛋白具有一个明显的凹沟,4个果胶结合位点氨基酸残基(T423、Q453、R565和W567),2个活性位点氨基酸残基(D476和D497)。本研究为洋葱Ac PME基因的结构域蛋白互作及功能研究奠定了基础。     

沙柳SpsLAZY1a和SpsLAZY1b基因克隆及生物信息学分析

LAZY1基因对于植物分枝角度、分枝方向具有重要影响。以沙柳为试验材料克隆LAZY1基因,利用生物信息学软件分析LAZY1基因序列、构建进化树,并预测蛋白结构。结果表明,SpsLAZY1a和SpsLAZY1b的CDS全长分别为1 161、1 143bp,分别编码386和380个氨基酸。生物信息学分析表明SpsLAZY1a、SpsLAZY1b2种蛋白均为亲水性蛋白,均无信号肽区域。氨基酸序列具有IGT基因家族典型结构域,并且其C端有LAZY1蛋白的典型EAR结构。系统发育树将18个LAZY1蛋白家族聚为2个大类,SpsLAZY1a和SpsLAZY1b属于其中第1类,均为双子叶植物,并与其他植物具有较高相似性。氨基酸同源结构比对发现这些植物间既有相似同源区域,也存在一定差异区域。单子叶比双子叶植物缺少某些同源区域,草本比木本植物又缺少某些同源区域。LAZY1基因在沙柳进化过程中发生基因重复,本研究由沙柳中成功克隆SpsLAZY1a、SpsLAZY1b基因,隶属IGT基因家族,并初步揭示LAZY基因的系统进化关系。     

植物GGPPS基因研究进展

香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)是植物萜类物质合成的一个重要调节靶点。目前已经在多种植物中开展了该基因的克隆和功能分析。对GGPPS基因及蛋白结构和生物学功能的最新研究进展进行了综述,为其在植物遗传育种方面的应用提供参考。     

甘蓝型油菜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因BnNHX2的电子克隆与序列分析

盐胁迫是造成油菜产量下降的重要环境因子之一。Na^＋／H^＋逆向转运蛋白（Na^＋／H^＋ antiporter,NHX）基因是目前世界植物耐盐性研究领域中最热门的基因,油菜NHX基因的克隆对提高油菜耐盐性的转基因育种意义重大。本研究利用电子克隆的方法,获得1个新的甘蓝型油菜NHX基因BnNHX2的全长cDNA,含有一个长为1629bp的开放阅读框架,编码542个氨基酸,分子质量约59．9ku。生物信息学分析表明,BnNHX2蛋白属于跨膜蛋白,有12个跨膜区,是植物NHX超家族中的一员。通过同源比对和进化分析发现,BnNHX2基因与盐生植物盐芥ThNHXI基因高度同源,表明BnNHX2可能是油菜抵御盐胁迫的关键基因。     

光皮桦成花相关MADS-box基因BlMADS1的克隆与表达

MADS-box家族基因广泛分布于植物中,在花发育过程中起着重要调控作用。采用同源克隆结合c DNA末端快速扩增技术(RACE)在光皮桦Betula luminifera中克隆到1个MADS-box基因,命名为Bl MADS1。该基因可能存在2个不同的转录本Bl MADS1S和Bl MADS1L:前者为1 150 bp,编码254个氨基酸,具有MADS-box基因的典型结构,与欧洲白桦Betula pendula的同源基因相似性最高(97%);后者长1 312 bp,但仅含有690 bp的开放阅读框(ORF),编码229个氨基酸,缺失MADS-box蛋白的C端。这种缺失可能由内含子可变剪切造成。同源比对和系统进化分析表明:Bl MADS1属于AP1/SQUA亚家族的AGL79这一分支。定量聚合酶链式反应(PCR)表达分析表明:Bl MADS1基因在根、茎、叶和花器官中均有表达,但Bl MADS1S和Bl MADS1L这2个转录本表达模式存在差异。雄花序发育过程中,Bl MADS1的2个转录本的表达峰值均在萌动雄花序时期;而在雌花序发育过程中,Bl MADS1L和Bl MADS1S表达水平的峰值分别出现在初生雌花芽和萌动雌花序。图6表1参27     

花生AhNCED1基因的克隆、序列分析与载体构建

脱落酸(ABA)在植物生长发育中起着重要的作用,9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因(NCED)是其合成途径中的关键基因。采用逆转录PCR(RT-PCR)技术在花生种子中克隆到其同源基因AhNCED1,预测该基因开放阅读框为1 806 bp,编码601个氨基酸,蛋白质的分子质量为66.8 ku,等电点为8.49。通过生物信息学分析表明,该基因含有2种跨膜区,但均不明显;由17个丝氨酸、8个苏氨酸、5个酪氨酸参与磷酸化过程;同源比较发现,该基因与来自拟南芥、柱花草等的NCED具有较高的同源性,进化分析表明该基因与柱花草NCED的亲缘关系最近。笔者成功构建了该基因的亚细胞定位载体AhNCED1-GFP和超表达载体p Cambia2300EC-AhNCED1,为进一步研究花生中AhNCED1基因的功能奠定了基础。     

毛竹PePsbS1基因的分子特征及其原核表达

PsbS蛋白在植物非光化学淬灭(NPQ)中发挥着重要作用。采用同源比对方法从毛竹(Phyllostachys edulis)全长cDNA文库中得到1个PsbS同源基因序列(FP091683),命名为PePsbS1。该基因全长1 069 bp,具有多种光应答元件和参与光应答的顺式作用元件。PePsbS1的开放阅读框为807 bp,编码一个268 aa的蛋白。蛋白结构分析表明,该蛋白由转导肽(53 aa)和成熟蛋白(215 aa)组成,成熟蛋白包含1个叶绿素a/b结合蛋白功能域、4个跨膜区;疏水性分析表明该蛋白组成氨基酸以疏水性氨基酸为主,占42.5%;Blastp分析发现该蛋白与玉米的一致性最高,达80.3%。构建含有PePsbS1编码成熟蛋白序列的原核表达载体pET23a-PePsbS1-mature,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明,分离纯化获得目的蛋白的分子量约为28 kD,与预测PePsbS1编码成熟蛋白的大小相符。这将有助于对竹子PsbS蛋白结构与功能的深入研究。