红掌花青素合成相关基因的研究进展

红掌是仅次于兰花的第二大热带观赏植物.佛焰苞颜色是红掌育种的主要目标性状,与其所含的花色素种类和含量密切相关.研究表明,花青素是影响红掌花色的主要色素之一,其生物合成受结构基因和调节基因的共同调控.综述了红掌佛焰苞中花青素生物合成相关结构以及调节基因克隆和功能研究进展,为红掌花色的分子育种提供指导.     

Ca2+抑制红掌佛焰苞季节性“绿耳”的生理效应

为抑制海南地区红掌季节性佛焰苞耳部变绿(俗称“绿耳”)的发生,以盆栽品种‘大哥大’(‘Dakota')为试验材料,研究不同Ca2+浓度处理对红掌佛焰苞季节性“绿耳”的生理效应.结果表明:随着Ca2+处理浓度增加,佛焰苞的“绿耳”发生率降低,且耳部色相a*值和彩度C*值均显著提高,佛焰苞中总花青素苷含量显著增加,叶绿素含量显著降低.增施Ca2+还有利于促进佛焰苞中可溶性糖和可溶性蛋白的积累.综合以上研究结果可知,从7月份开始增施浓度在8～10 mmol/L范围内的Ca2+,可使佛焰苞“绿耳”现象得到较好的改善.     

辣椒绿茎突变体gh1转录组及候选基因表达分析

以EMS诱变的辣椒绿茎突变体gh1和紫茎野生型樟树港辣椒(ST–8)为材料，测定茎中花青素含量；采用转录组测序技术(RNA–seq)和实时荧光定量PCR(qRT–PCR)分析与辣椒茎中花青素生物合成相关基因的表达水平。结果表明：突变体gh1茎中的花青素含量极显著低于ST–8茎中的花青素含量；与ST–8相比，gh1共获得1794个差异表达基因，包括1003个上调表达基因，791个下调表达基因；与花青素生物合成途径相关的基因包括9个结构基因(DFR、UF3GT、F3H、ANS、CHI、CHS、C4H、PAL、4CL)和3个转录因子(TT8、AN1、TTG1)；对与花青素合成相关的差异表达基因进行转录组表达量分析和qRT–PCR分析，筛选出4个结构基因(CHS、CHI、DFR、UF3GT)和1个转录因子(AN1)，推测这5个基因可能在辣椒茎中花青素生物合成途径中起重要作用。     

荷花转录组测序及花青素苷合成相关基因表达分析

以荷花不同花色品种‘青玉'和‘白洋淀红莲'为研究对象,运用高通量测序技术,对松蕾期的花瓣进行转录组测序,并对2个测序文库进行差异表达及实时荧光定量PCR分析。结果表明:共获得1 142条差异表达基因。筛选出与花青素苷合成相关的关键基因ANS、CHS、DFR、UF3GT。4个基因在两种荷花花瓣不同时期中的表达量存在显著差异,在松蕾期或初花期的表达量最高。     

红掌突变体花青素含量的测定与比较

[目的]为在分子水平研究突变体的形成及调控机制提供理论基础。[方法]以红掌品种阿里巴巴的野生型及突变体为试材,对绿色突变体与野生型进行外部形态的观察。通过高效液相色谱（HPLC）测定了2种材料各部位的花青素种类和含量。[结果]突变体与野生型红掌花青素含量显著不同。在野生型的佛焰苞、叶片、叶柄中含有3种花色苷：花青素-芸香糖苷、花葵素-芸香糖苷、甲基花青素-芸香糖苷;而在突变体中,除了在叶柄中检测到花青素-芸香糖苷一种花色苷外,佛焰苞的叶片中检测不到任何花青素成分。[结论]突变体中可能出现了不可恢复的突变,造成花青素在合成与积累过程中出现问题,导致无法呈现正常的颜色。     

贵紫麦1号籽粒色素形成相关基因的差异表达

【目的】探明贵紫麦1号小麦灌浆期变紫后和变紫前2个时期籽粒的转录组差异,发掘影响贵紫麦1号花青素合成的关键基因和关键酶,丰富小麦籽粒色素转录组数据信息,为转录因子的克隆及表达提供参考。【方法】利用Illumina Hiseq 2000TM高通量测序技术对贵紫麦1号籽粒变紫前和变紫后2个时期进行转录组测序、文库构建及建库质量评估,对测序结果进行信息学分析。采用TTM对read count数据进行标准化处理,随后用DEGseq进行差异分析,设定q-value＜0.005且|log2 (fold change)|＞1为阈值。通过筛选分析,获得两者间差异表达基因,按照无参转录组分析方法,对差异表达基因进行BLAST搜索,Nr数据库比对,GO功能富集及KEGG pathway分析,找出与花青素相关的关键基因和关键酶,并结合qRT-PCR验证所找到的关键基因及关键酶在不同时期的表达水平,掌握这些关键基因的信息。【结果】测序结果表明,贵紫麦1号变紫后和变紫前分别获得13.36 G和12.69 G的clean bases,clean reads为106 906 108条和101 547 534条,占原始序列的93.73%和94.90%。通过Trinity软件对所得clean reads进行拼接,共获得170 396条转录本,长度为119 020 625。拼接clean reads后获得119 572条Unigenes。在BLAST搜索中,119 572个高质量独特序列中有86 004条（71.92%）Unigenes与现有基因模型具有至少1个显著匹配。在Nr数据库比对结果鉴定了至少5种具有与来自节节麦、乌拉尔图小麦、二穗短柄草、大麦、小麦等已知基因同一性且序列相似性高的Unigenes。KOG数据库比对结果显示,注释成功的基因按KOG的26个group进行分类,注释在一般功能基因,蛋白质翻译后修饰与转运、分子伴侣及翻译、核糖体结构与生物合成等类别基因所占比重较大,分别为15.79%、14.51%和10.54%。643个差异基因中,236个呈上调趋势,407个呈下调趋势。GO注释表明,按照基因参与的生物过程、所处的细胞组分、具有的分子功能下一层级分类,共44个分类,差异基因显著富集在碳水化合物代谢过程（GO:0005975,16.03%）、应激反应(GO:0006950,10.83%)和水解酶活性分子功能(GO:0016787,34.84%)等类别中。KEGG pathway富集分析可知,353个差异基因富集到153条相关通路上,其中淀粉与蔗糖代谢、苯丙素生物合成、类黄酮生物合成等通路富集显著。类黄酮生物合成途径相关基因共66个,2条相关上调表达Unigenes,涉及查尔酮酶、隐色花色素双加氧酶2个关键酶基因,log2(fold change)分别为3.4164和2.1258。对所得关键基因进行qRT-PCR验证,证实查尔酮酶、隐色花色素双加氧酶在贵紫麦中1号中表达量呈明显上调趋势,与转录组测序分析结果一致,测序结果可靠度高。【结论】比较分析贵紫麦1号籽粒变紫后和变紫前2个时期转录组测序结果,获得大量Unigenes数据及差异表达基因相关信息,明确类黄酮代谢途径中2个关键酶基因（CHS和ANS）在调控贵紫麦1号籽粒花青素合成过程中作用显著。     

红掌种质资源表型性状的遗传多样性研究

[目的]研究红掌种质资源的遗传多样性,为红掌的种质创新和杂交育种提供依据。[方法]利用形态学标记对46个红掌种质资源的36个形态学性状进行研究。[结果]46个红掌品种的遗传多样性丰富,遗传变异系数为0.24~0.36,遗传多样性指数为0.343 8~2.111 9。其中,佛焰苞长的变异系数最大,为0.36;佛焰苞颜色遗传多样性指数最大,为2.111 9。UPGMA聚类分析表明,这46个红掌品种可划分为4大类,包括3个较小的类群和1个较大的类群。[结论]该研究中应用的一些形态学标记对于红掌品种鉴定、遗传多样性分析和杂交育种具有重要的应用价值。     

菌糠添加对连栋温室红掌成品生长指标的影响

为了寻找可替代泥炭土栽培红掌的有机原料,研究以香菇、平菇、双孢菇菌糠为材料,按比例分别与泥炭土混合栽培红掌中苗,通过成品株高、冠幅、叶片数和佛焰苞数及其大小等表观生长指标衡量菌糠替代泥炭土的栽培效果。结果表明,3种菌糠栽培的红掌都可完成其生活史,而且适量的添加可以增加红掌的佛焰苞数量,但添加菌糠后成品的株高、冠幅、叶片数、叶片横纵径、佛焰苞横纵径均显著降低。3种菌糠相比,红掌冠幅差别不大;株高差别较大,表现为添加香菇菌糠后红掌株高降低最多,添加平菇菌糠后株高降低最少。不同添加比例间相比,株高和冠幅均随菌糠添加量的增加而降低。香菇、平菇、双孢菇菌糠与泥炭土混合都可以栽培红掌,但25%的平菇菌糠的替代效果较好。     

黑果枸杞花青素生物合成关键基因的生物信息学分析与克隆

黑果枸杞(Lycium ruthenicum)是我国西北地区特有的道地药材,是迄今为止发现花青素含量最高的天然野生植物之一。为深入了解黑果枸杞的花青素生物合成机制,利用转录组测序方法,从黑果枸杞果皮中鉴定了参与花青素生物合成的7类关键基因,即查尔酮合酶基因、查尔酮异构酶基因、黄烷酮-3-羟化酶基因、类黄酮-3′-羟化酶基因、类黄酮-3′5′-羟化酶基因、二羟黄酮醇-4-还原酶基因和花青素合酶基因,对其进行相应核苷酸序列、氨基酸序列以及蛋白质(酶)结构特征等生物信息学分析;然后根据转录本拼接序列,利用PCR方法对该7个基因进行了全长克隆和测序验证。为黑果枸杞的遗传改良及花青素基因的利用奠定了分子基础。     

全缘叶绿绒蒿黄色花形成关键基因的挖掘

为挖掘全缘叶绿绒蒿黄色花形成的关键基因,探讨其花色形成在转录水平上的调控机制,选取全缘叶绿绒蒿3个花发育时期的花瓣组织进行转录组测序,并对盛花期花瓣组织的黄酮类化合物进行了绝对定量。结果表明：(1)LC-MS/MS共检测到38种黄酮类化合物,其中以槲皮素及其衍生物为主,其含量超过黄酮类化合物总含量的80%;(2)转录组测序共获得171 902条单基因,筛选后得到14 906个差异表达基因,这些差异基因在48条KEGG通路中显著富集(P<0.05),其中苯丙烷生物合成通路与类黄酮生物合成通路在3个花发育时期都显著富集(P<0.05);(3)同时还发现与黄酮类化合物合成相关的基因在3个花发育时期中差异表达,同一时期MiFLSs(Cluster-28469.86、Cluster-28469.89、Cluster-28469.91)的表达量是MiDFR(Cluster-49617.1)的1.2～4.7倍;与槲皮素衍生物合成相关的MiFG3(Cluster-15071.0)呈现逐渐上调的表达趋势;转录因子MiMYB4表达量也逐渐上升,且与MiMYB38、MiMYB39、MiDFR(C...     

刺五加葡萄糖基转移酶基因的克隆与表达分析

刺五加是中国的珍贵药用植物,UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase,GT)是催化其三萜皂苷类成分生物合成的关键酶。利用RT-PCR和RACE技术,从该植物中分离出全长为1 959bp的GT基因cDNA序列,该基因开放阅读框为1 827bp,编码一个含608个氨基酸的蛋白质,分子量为6.672 3×104ku。生物信息学分析结果显示,该蛋白包含GT家族的标志性序列,不存在跨膜区域,定位于细胞质中,属于参与植物次生代谢的GT-B型。表达分析的结果表明,刺五加GT基因在各生长时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P0.05)。最大表达量出现在盛花期,为最低表达量(叶片衰老期)的1.81倍。各器官中,叶片的表达量最高,是最低量幼茎的1.64倍。     

红掌基因组DNA提取试验

采用改良CTAB法,对红掌(Anthurium adndraeanum)同一品种4个不同生长时期(芽期、幼苗期、中苗期、成品期)的嫩叶和同一植株5个部位(嫩叶、老叶、佛焰苞、花序、根)进行基因组DNA的提取,利用核酸蛋白测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。结果表明,红掌成品期嫩叶的DNA提取从纯度和提取率均优于其他各生长时期;花序DNA提取有少量的杂质污染,老叶有少量RNA残留,其他部位均适合DNA提取,其中嫩叶提取率最高。     

苹果梨MYB108基因的克隆与序列分析

MYB家族是调节花青素合成最为关键的转录因子成员,通过前期转录组测序发现,影响花青素的MYB转录因子中MYB108基因在不同时期表达具有差异,其对花青素生物合成调节作用未见报道。本研究成功克隆了MYB108基因,鉴定其ORF为891 bp,含有296个氨基酸,理论等电点(pI)为6.30,属不稳定蛋白,具有SANT/Myb结构域,鉴定是MYB转录因子家族基因。红皮梨色泽受到花青素含量的影响,本研究意在为今后验证其基因与花青素之间的关系提供先决条件。     

苦荞全生育期芦丁积累与其生物合成途径相关基因表达分析

【目的】探究苦荞全生育期芦丁含量变化与其合成途径关键酶基因和调控因子MYB基因表达量之间的相关性,以期进一步明确苦荞植株体内芦丁生物合成的分子机制。【方法】以九江苦荞为试验材料,整个生育期分别在萌发期、子叶期、真叶期、盛叶期、现蕾期、盛花期、灌浆期和籽粒成熟期共8个时期取材(S1—S8)。采用RT-PCR方法,克隆获得与黄酮类代谢相关的MYB类转录因子基因。采用T-coffee软件进行氨基酸同源序列比对及保守结构域分析。与拟南芥黄酮类代谢相关的MYB转录因子及荞麦同源MYB转录因子序列比对,基于邻近法构建系统进化树;实时荧光定量PCR技术分析芦丁合成途径中5个关键酶Ft CHS、Ft F3H、Ft4CL、Ft FLS-like和Ft UFGT及上述克隆到的MYB转录因子在不同组织中的表达模式。基于高效液相色谱法(HPLC)测定全生育期取材组织的芦丁含量。同时采用相关性分析方法分析不同组织中芦丁含量变化与基因表达模式的相关性。转换上述数据为矩阵,采用欧式距离法构建共表达层次聚类图谱。【结果】克隆到2个MYB类转录因子,即Ft MYB7和Ft MYB9,其核酸序列长度分别为876和912 bp,分别编码291和303个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比对分析结果表明,二者均具有典型的R2R3保守结构域,为R2R3类型的MYB转录因子。结合Nr数据库中17个苦荞和3个拟南芥黄酮类代谢相关MYB转录因子同源氨基酸序列构建系统进化树,结果表明这22个基因分成6大类群,其中Ft MYB7属于第II类群,Ft MYB9属于第IV类群,二者分属于不同类群,暗示这2个MYB转录因子可能涉及调控植物生长发育过程中不同功能类型。荧光定量结果显示,Ft MYB7在S3(真叶期)和S5(现蕾期)基因相对表达量最高,达到501和867倍;Ft MYB9在S1(萌发期)和S2(子叶期)相对表达量最高,分别为34和72倍。上述基因表达量与芦丁含量变化模式相关性分析表明,8个生长时期中,Ft4CL、Ft CHS、Ft F3H、Ft UFGT和Ft MYB7相对表达模式与芦丁含量变化幅度呈正相关,其相关系数分别为0.748、0.683、0.704、0.890和0.862。而Ft FLS-like和Ft MYB9与芦丁含量的变化幅度呈负相关,其相关系数分别为-0.442和-0.501。【结论】Ft MYB7和Ft MYB9转录因子在整个生育时期中表达模式存在明显差异。其中Ft MYB7可能在苦荞芦丁积累的过程中起到正调控作用,而Ft MYB9则为负调控作用。     

镁对红掌植株形态及生理特性的影响

以红掌Pink Champion品种为材料,采用盆栽试验,研究不同浓度Mg2+对红掌植株形态和生理性状的影响,找出适合红掌生长和改善质量的最佳Mg2+浓度。结果表明,当营养液中Mg2+浓度为0.5 mmol/L时,植株最高、冠幅最大、叶片和佛焰苞最大、花梗和花序最长。该浓度下苗期、初花期和盛花期叶片的叶绿素和总氮含量显著高于对照;而在盛花期,2mmol/L Mg2+处理有利于提高红掌花青素含量。     

蓝果忍冬果实花青素含量及合成相关基因表达分析

[目的]分析蓝果忍冬果实花青素含量及其合成相关调控基因表达情况,为蓝果忍冬种质的挖掘、利用及花青素的合成调控研究提供参考依据.[方法]利用高效液相色谱检测技术定性定量分析不同蓝果忍冬品种(蓓蕾、HSY-4和日本-5)果实花青素成分及含量,并以实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对3个品种不同成熟期花青素合成相关基因及转录因子的表达量进行分析.[结果]在525 nm波长下,从成熟蓝果忍冬果实中检测出8种花青素,含量最高的花青素是矢车菊3-葡萄糖,占总花青素含量的76.61%~86.67%,其中蓓蕾的花青素含量最高,达500.14 mg/100 gFW,日本-5最低,为162.79 mg/100 gFW.半转色期花青素合成相关基因表达量最高,与花青素积累情况相符;PAL、ANS和bHLH基因的表达量随花青素合成积累量增加呈先升高后降低的变化趋势.[结论]蓝果忍冬果实含8种花青素,以矢车菊为苷元的花青素种类最多,其合成相关基因中PAL、ANS和bHLH基因在花青素合成过程中起调控作用.蓓蕾、HSY-4和日本-5的花青素合成相关基因表达情况相似,但品种间存在差异.     

陆地棉突变体腺体形成时期的基因表达谱

为了解棉花腺体形成时期相关基因的表达谱,分别抽提陆地棉湘棉-18和N5在腺体形成时期的RNA,采用Affymetrix芯片,扫描采集数据后进行分析。结果显示,在腺体形成时期有明显差异表达的基因共有514条,包括209条上调基因和305条下调基因;在514条差异表达基因中有275条(53.5%)与GenBank中已知的基因具有较高的相似性,这些基因主要涉及防御反应及异戊二烯生物合成等,有239条(46.5%)在GenBank中无任何注释。KOBAS分析结果显示,这些差异基因在KEGG数据库上涉及19条生化途径。说明,腺体形成过程是一个复杂的基因网络调控过程,涉及多条萜类化合物生物合成途径及其他与防御基因相关的途径。     

凤丹牡丹二氢黄酮醇-4-还原酶基因克隆及表达特性分析

以凤丹种皮为材料,克隆花青素生物合成中的关键基因DFR,并进行功能验证。结果表明,凤丹DFR基因含有长度为1 092 bp的开放阅读框(ORF),共编码364个氨基酸。其中,凤丹DFR蛋白的相对分子量为40 796.17 u,理论等电点(PI)为5.76。实时荧光定量分析凤丹牡丹种子4个发育阶段的PoDFR基因表达水平,结果表明,在凤丹种子发育过程中,PoDFR基因的表达水平先增加后减少,在S2时期达到最高。构建PoDFR基因的原核表达载体并在大肠杆菌中表达以获得PoDFR的原核表达蛋白。体外酶促反应和高效液相色谱法表明,PoDFR蛋白可以催化二氢槲皮素合成无色花青素,通过与PoANS蛋白结合合成花青素,证明PoDFR基因具有相应的功能活性。     

灯盏花中灯盏乙素生物合成相关基因转录组分析

【目的】通过转录组测序(RNAseq)筛选灯盏乙素生物合成相关基因,为筛选灯盏花优质种质资源提供理论基础。【方法】通过HPLC测定灯盏花叶片中灯盏乙素含量,筛选其中有显著差异的4份样品,以1份低灯盏乙素含量叶片样品作为对照(CK)与3份高灯盏乙素含量样品同时进行RNAseq。测序完成后分析筛选差异表达基因(Differential expressed genes, DEGs),并对DEGs进行Gene Ontology (GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)功能富集分析。再选择表达量较高的参与类黄酮生物合成途径的DEGs进行qRT-PCR验证其表达模式。【结果】样品S3和S5灯盏乙素含量极显著高于样品S4(CK),样品S6灯盏乙素含量显著高于样品S4(CK)。高灯盏乙素样品S3、S5、S6与低灯盏乙素样品S4(CK),两两比较分别鉴定出2143个、1968个和1801个DEGs。3组差异比较组合的交集有490个共同基因,其中277个在高灯盏乙素含量样品中上调表达,另外213个在低灯盏乙素含量样品中上调表达,差异表达基因KEG...     

栽培黑果枸杞活性成分生物合成关键基因克隆及表达分析

[目的]本文旨在对不同生长期花色苷和原花青素含量及关键酶基因表达分析,为从分子生物学水平确定黑果枸杞最佳采收期提供理论依据,同时对生物合成途径中关键酶基因进行克隆,为揭示黑果枸杞花色苷和原花青素的生物合成机制以及利用基因工程技术进行黑果枸杞靶向育种奠定基础。[方法]分别利用pH示差法和香草醛-盐酸法测定不同时期黑果枸杞花色苷和原花青素含量;通过RT-PCR技术扩增4种关键酶基因LrDFR、LrANS、LrLAR和LrANR的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR分析关键酶基因在黑果枸杞果实不同发育时期的表达情况。[结果]黑果枸杞果实花色苷在黑果成熟期含量最高(6. 08 mg·g~(-1)DW),原花青素在半紫半黑果期含量最高(22. 3 mg·g~(-1)DW);克隆得到4种关键酶基因的序列全长分别为1 140 bp、1 251 bp、1 002 bp和1 017 bp,分别编码379、416、333和338 aa的蛋白质,序列分析表明4种基因所编码氨基酸均具有所属蛋白家族的典型特征。[结论]花色苷在黑果成熟期含量最高,原花青素在半紫半黑果期含量最高,且随着果实发育和花色苷含量的增加,LrDFR和LrANS表达水平也逐渐上升,而LrLAR和LrANR则呈先上升后下降的表达模式;当黑果枸杞用于原花青素提取时,可适当提前采收期;研究结果为从分子生物学水平确定黑果枸杞最佳采收期提供理论依据,也为黑果枸杞花色苷与原花青素生物合成机制的揭示奠定基础。