猪瘟胶体金快速诊断试纸条的研制

采用柠檬酸钠还原法制备胶体颗粒,用猪瘟(CSF)抗体标记纯化,并包被在玻璃纤维膜上,另外将纯化的CSF抗体和羊抗鼠抗体包被在硝酸纤维膜上,组装成CSF快速检测条,对猪瘟病毒进行检测.结果表明:使用所研制的CSF快速检测条检测收集的70份待检样品,共检出猪瘟阳性病例26例,而经病毒分离鉴定阳性病例有28例,阳性符合率达92.8%;将5份阳性猪瘟病毒稀释后用试纸条和ELISA方法进行敏感性实验,结果表明,诊断试纸条的敏感性较高,用试纸条对鸽新城疫病毒、鸡减蛋综合症病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒进行检测,无交叉反应.     

气肿疽梭菌菌体抗原分析

[目的]了解气肿疽梭菌的抗原特性。[方法]对气肿疽梭菌标准菌株(C54-1)的菌体抗原进行提纯过柱,通过制备小鼠免疫血清及免疫印迹技术进行了反应原性试验。[结果]气肿疽梭菌的菌体抗原有8条蛋白带,电泳图谱上分别出现了与之相对应的条带,分子质量分别为93、72、56、46、38、26、15、11 kD,其中第2(72 kD)、5(38 kD)、6(26 kD)峰的抗原表现出明显的特异性。用酶联免疫印迹技术分析气肿疽梭菌分泌蛋白的抗原组分,气肿疽梭菌感染小鼠的血清能与抗原组分蛋白发生反应,其中72、38、26 kD蛋白带显色最深。[结论]为气肿疽梭菌的深入研究提供了理论依据。     

五氯酚钠胶体金快速检测试纸条的研制

[目的]研制五氯酚钠胶体金快速检测试纸条。[方法]利用胶体金免疫层析技术,研制一种快速检测猪肉、鸡肉、鱼、虾、水质中五氯酚钠的试纸条。[结果]经测试,该试纸条对猪肉、鸡肉、鱼、虾的检测限为1μg/kg,对水质的检测限为2μg/kg,检测时间为15 min,假阳性率和假阴性率均为0。[结论]该方法准确、可靠,使用简便,适合大量样品的现场检测。     

魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制

【目的】研制魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,为魏氏梭菌病的快速诊断提供新方法。【方法】采用分子生物学方法制备魏氏梭菌α毒素,将其免疫家兔制备多克隆抗体。用制备的抗魏氏梭菌α毒素多克隆抗体作为胶体金标记抗体和检测线上的捕获抗体,制备魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测,比较其检测结果与PCR检测结果的符合率。【结果】成功制备了魏氏梭菌α毒素多克隆抗体。成功研制了α毒素快速诊断金标试纸条,其检测线上抗体的最适包被质量浓度为0.06 μg/mL。研制的试纸条仅与魏氏梭菌α毒素发生反应,且不同批次的试纸条重复检测结果无差异,表明试纸条具有较高的特异性和重复性;该试纸条最低可检测1.40 mg/mL的毒素量,与PCR方法测得结果符合率为80.77%,基本能满足实际应用要求。【结论】成功研制了魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,该试纸条具有快速、特异、敏感、稳定等优点,适用于对魏氏梭菌病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

气肿疽梭菌鞭毛基因克隆载体的构建

根据GenBank中发表的气肿疽鞭毛蛋白的结构基因FliA(C)的序列,从中截取抗原表位部分基因序列,设计合成1对引物,引物的5`和3`端分别加入了BamHⅠ和XhoⅠ2个酶切位点。通过降落PCR法扩增合成长度为429bp的目的基因片段。将PCR产物克隆于pMD18-T simple载体,之后将其转入大肠杆菌DH 5α感受态细胞筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD18-T-FliA(C)并进行PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定。结果表明:扩增的目的基因与GenBank登录的ATCC10092菌株序列同源性为99%,4个碱基不同,仅有1个氨基酸不同。测出的基因序列发表于GenBank,登录号为KF712490。试验证明用降落PCR方法能方便、快速、准确的获得目的基因片段。本试验成功构建了重组克隆载体pMD18-T-FliA(C),为气肿疽鞭毛蛋白的表达载体构建及鞭毛蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

气肿疽梭菌PCR检测方法的建立

为建立气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)的快速检测方法,根据Gen Bank中气肿疽梭菌细胞毒素Cct A基因序列(登录号:JQ692583.1)设计了1对引物,以气肿疽梭菌标准株C54-1全基因组DNA为模板,建立了牛气肿疽梭菌的PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性试验。结果表明,建立的气肿疽梭菌PCR检测方法扩增出的片段大小为501 bp,与Gen Bank上气肿疽梭菌的同源性达99.4%,且该方法与D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌和巴氏杆菌等病原体无交叉反应,最低检测浓度为12.30 fg/μL。结果表明,建立的PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点,与其他诊断方法相比更适用于气肿疽梭菌的诊断。     

莴苣花叶病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

为建立莴苣花叶病毒的现场快速检测方法,采用胶体金标记莴苣花叶病毒的兔多克隆抗体,在硝酸纤维素膜上喷涂检测T线和质控C线,制作胶体金免疫层析试纸条。该试纸条检测莴苣花叶病毒提纯病毒的灵敏度为1μg·mL-1,检测昆诺阿藜病汁液可稀释1 000倍(重量/体积)。试纸条可特异性检测到莴苣花叶病毒的3个分离物,与马铃薯X等8种病毒无交叉反应。田间采集的莴苣样品试纸条和酶联检测的结果一致。该试纸条适用于疑似莴苣花叶病毒感染的莴苣叶片的快速诊断,并在10min内获得检测结果。     

快速检测联苯菊酯的胶体金层析试纸条研制

[目的]采用免疫胶体金技术,建立一种快速检测联苯菊酯的试纸条方法。[方法]利用有机合成方法制备了联苯菊酯半抗原,并与载体蛋白偶联得到免疫抗原,利用人工免疫的方法获得其单克隆抗体,通过酶联免疫法对制备的单克隆抗体的性能进行了验证。联苯菊酯胶体金层析试纸条是利用单克隆抗体标记胶体金,并将联苯菊酯抗原与羊抗鼠Ig G分别喷制到硝酸纤维膜上,与样品垫、吸水垫组装在PVC衬板上制备而成。[结果]联苯菊酯胶体金层析试纸条检测限为500~800μg/kg,具有速度快、简单等优点。此外,该试纸条与大部分的拟除虫菊酯没有明显的交叉反应,利用该试纸条可实现对苋菜中联苯菊酯添加试验的准确判定。[结论]胶体金试纸条方法具有前处理简单、检测速度快、可以肉眼判断结果等优点,该试纸条有望实现对果蔬中联苯菊酯残留的快速筛查。     

汞离子胶体金免疫层析试纸条的研制

基于特异性识别汞离子的单克隆抗体,以胶体金标记抗体作为检测探针,样品中的汞离子和检测线上的包被抗原竞争与免疫探针结合,建立了一种快速测定水样中汞离子的胶体金免疫层析试纸条方法.在最优实验条件下,试纸条对汞离子的检出限为100μg/L,与其他金属离子没有交叉反应,样品的加标回收实验结果与酶联免疫吸附分析方法(ELISA)有很好的相关性.整个分析过程在10min内可以完成,表明该方法可以快速直接检测汞离子,不需要复杂的样品预处理过程.     

莱克多巴胺胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

应用胶体金免疫层析技术建立了一种快速检测莱克多巴胺的方法.采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,标记莱克多巴胺单克隆抗体并喷于玻璃纤维上,莱克多巴胺偶联OVA抗原和羊抗鼠IgG分别结合于硝酸纤维膜上,依次将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装切割成莱兜多巴胺胶体金免疫层析快速检测试纸条.试验结果表明,陔快速检测试纸条的灵敏度为5 ng/mL,检测时间为5 min,批内和批问重复性为100%,假阳性率和假阴性宰均为0.     

莴苣丛枝植原体胶体金免疫层析试纸条的初步研制

采用柠檬酸三钠还原法制备25 nm粒径胶体金颗粒,在pH 8.5的条件下与21μg/m L兔抗莴苣丛枝植原体(Le WB)免疫膜蛋白(Imp)多克隆抗体形成稳定的胶体金蛋白复合物,将兔抗莴苣丛枝植原体免疫膜蛋白IgG与羊抗兔IgG分别点在硝酸纤维素膜上作为检测线(T)和质控线(C),组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明:该试纸条除可以检测莴苣丛枝植原体外,还能检测与其具有相同免疫膜蛋白特性且隶属16SrⅡ-A亚组的其他植原体株系,如菊苣丛枝植原体(Ch WB)、扁豆花变绿植原体(Le VP)、蕹菜丛枝植原体(WSWB)、银胶菊花变绿植原体(Pa VP)等。试纸条可特异检测16SrⅡ-A亚组植原体株系,对莴苣丛枝植原体阳性材料的检测灵敏度为稀释100倍。     

气肿疽梭菌不同靶基因检测方法的比较

为检测牛、羊等反刍动物的气肿疽梭菌,筛选出更为特异、敏感的PCR检测方法,分别以fli A(C)、nan A、cct A为靶基因进行PCR检测,并对其敏感性、特异性等方面进行比较。结果表明,以cct A为靶基因的PCR检测方法敏感性最高,最小检测DNA量为12.30×10~(-5)pg/μL;以fli A(C)、nan A为靶基因的PCR检测方法敏感性较低,最小检测DNA量为0.123 ng/μL;3种靶基因引物菌未扩增出D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌等基因片段,具有较好的特异性。本试验为气肿疽的快速诊断提供了更为敏感、特异的检测技术。     

应用胶体金试纸条诊断方法检测牛结核病的试验

采用牛结核MPB70/83抗体检测胶体金试验方法对贵阳周边及某县奶牛场共309头奶牛进行牛结核病检测,同时采用结核菌素(PPD)皮试进行对比试验,结果显示,该病的感染率为4.48%~6.47%,胶体金试纸条试验与PPD反应具有一定的符合率[75%(15/20)],采用生物统计分析,进行χ2检验,计算得χ2c=0.703,χc2<χ20.05,显示两种试验差异极不显著。同时试验还证明了牛结核MPB70/83抗体检测胶体金试纸条试验方法具有快速、简便、特异、敏感的特点,并且可作为PPD反应的辅助诊断方法。因此,该方法具有良好的应用前景。     

检测猪瘟病毒胶体金和量子点试纸条的初步研制

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)抗体的方法,本研究采用胶体金和量子点免疫层析技术,将纯化的重组CSFV E2蛋白作为捕捉抗原,以纯化的抗CSFV E2蛋白多克隆抗体和HRP兔抗猪IgG分别包被于硝酸纤维素膜上,作为质控线(C线)和检测线(T线),优化反应条件,制备免疫层析试纸条,用于临床检测。结果表明,制备的2种试纸条都可用于检测CSFV标准阳性血清,使用不同批次试纸条进行检测,结果无差异。2种试纸条与CSFV阳性血清反应呈阳性,与伪狂犬病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和圆环病毒2型(PCV2)反应呈阴性;胶体金试纸条在临床样品中阳性检出率为84.38%(81/96),与CSFV抗体检测ELISA试剂盒检测阳性符合率为92.05%(81/88);量子点试纸条阳性检出率为87.50%(84/96),与ELISA试剂盒检测阳性符合率为95.45%(84/88)。本研究制备的2种试纸条都具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。     

单抗标记检测新城疫病毒免疫胶体金试纸条的研制

利用柠檬酸钠还原氯金酸,形成胶体金颗粒,选择直径20 nm的胶体金颗粒标记单克隆抗体4E8,用兔抗鼠二抗喷洒在硝酸纤维素膜上作为对照线,用另一株单抗5E6作为检测线,制备成胶体金试纸条。用试纸条检测120份泄殖腔样品,结果与病毒增殖后HA法测得的结果符合率为95.8%,HA效价在1∶2以上,试纸条均能检测为阳性,与其他病毒的阳性血清没有交叉反应,且室温下可有效保存6个月。试纸条应用方便、快速,适合临床推广以及流行病学调查。     

广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金检测试纸条的研制及应用

为建立一种在生产应用中快速简便的CMV检测方法,应用胶体金标记技术和免疫层析原理,研制出一种针对广东烟区黄瓜花叶病毒病的快速检测试纸条。检测结果表明,该试纸条检测病毒的灵敏度为1 g/103 m L。对烟草上危害严重的其他4种病毒均无特异性反应。用试纸条对育苗棚烟株进行随机检测,结果与RT-PCR检测结果相符率为90%。     

延边株气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因克隆及生物信息学分析

根据气肿疽鞭毛基因(GenBank登录号:AB058932)的参考序列,PCR扩增并克隆延边株气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因。成功克隆后测序,并采用生物信息学方法对鞭毛蛋白FliA基因的蛋白质二级结构、结构功能域、三级结构及抗原表位等重要参数进行了预测和分析。结果表明:与AB058932序列相比,存在38处突变,核苷酸序列的同源性和氨基酸序列的同源性均为97%;FliA蛋白的理论等电点为6.99,不存在跨膜区和信号肽序列,二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,主要有15个潜在B细胞抗原表位区,17个限制性CTL抗原表位区。本试验为延边株气肿疽FliA蛋白功能的深入研究奠定了基础。     

一种苯醚氰菊酯胶体金免疫快速检测试纸条的研制

通过制备苯醚氰菊酯半抗原,研制出一种能够检测蔬菜、水果中苯醚氰菊酯的胶体金免疫层析试纸条,检测限为1μg/kg,检测时间仅为15 min,假阳性率和假阴性率均为0,符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求,该试纸条能够应用到基层实验室的大批量样本检测,具有实际意义。     

抗微囊藻毒素胶体金检测试纸条研究

用自制的微囊藻毒素(Microcystin-LR,MC-LR)单克隆抗体与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联物为胶体金标记底物研究MC-LR胶体金免疫检测技术。制备各种粒径的胶体金,最终确定粒径30nm的胶体金作为标记抗MC-LR单克隆抗体效果最佳;制备半抗原MC-LR与KLH的偶联物;在硝酸纤维素膜上包被MC-LR与KLH的偶联物作为检测带、包被羊抗鼠IgG作为质控带,建立快速检测MC-LR的免疫层析试纸条方法,该方法在3~5min即可目测判断结果,灵敏度为2ng·mL-1;依据工艺流程,发明制备了微囊藻毒素MC-LR的免疫层析快速检测卡,该卡检测样本中的微囊藻毒素MC-LR含量阈值为2ng·mL-1。     

气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank中气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因的参考序列,采用PCR方法扩增细胞毒素CctA基因。在将该基因进行克隆和测序后利用生物信息学方法,对细胞毒素CctA蛋白的理化性质、结构功能域、蛋白质二级结构和三级结构及抗原表位等重要参数进行了预测和分析。结果表明:与参考序列(JQ692583)相比,存在3处突变,核苷酸序列的同源性和氨基酸序列的同源性均为99.4%;CctA蛋白的理论等电点为8.00,不存在跨膜区和信号肽序列,二级结构以β-折叠和无规则卷曲为主,主要有4个抗原表位区域。本研究为CctA蛋白功能的深入研究提供了参考,并为气肿疽梭菌单克隆抗体的制备及合成肽疫苗的研发奠定了基础。