猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

目的建立可以同时检测猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速而可靠的PCR检测方法。方法和结果根据胸膜肺炎放线杆菌的Apx-VIA基因序列、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的16SrRNA基因序列设计5条引物。猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌模板的PCR扩增产物大小分别为342bp,485bp和1258bp。复合PCR对1～12型猪胸膜肺炎放线杆菌标准株,6株多杀性巴氏杆菌标准株,1～15型副猪嗜血杆菌以及25株经生化鉴定确认为上述三种细菌的分离株的基因组DNA作为模板进行检测,均获得预期大小的扩增产物。以猪放线杆菌、吲哚放线杆菌等14种常见细菌作为阴性对照进行PCR检测,结果仅有支气管败血波氏杆菌产生了可以和上述三个特异性条带明显区分的PCR产物。复合PCR针对胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的敏感性分别为14pg、34pg和37pg。结论本研究建立的复合PCR特异性好,敏感性高,可以用于猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速检测。     

猪胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

在已经建立的猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪多杀性巴氏杆菌(PM)、副猪嗜血杆菌(HPS)的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件的筛选,成功地建立了APP、PM、HPS复合PCR诊断方法,并应用于临床。利用一次PCR反应,即可同时扩增APP的342bp、PM的457bp和HPS的821bp的特异性片段。该方法的建立对临床上进行这3种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌三重PCR检测方法的建立

为建立简便、快速及灵敏度高的同时对猪肺炎支原体(Mh)、多杀性巴氏杆菌(PM)和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(App)三重PCR的检测方法,本研究针对这3种病原的基因分别设计3对特异性引物,通过PCR方法分别扩增出116bp(Mh)、253bp(PM)和473bp(App)的目的片段,其最低检出量为4个拷贝;而对肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌的PCR扩增则结果均呈阴性。表明该方法具有很好的敏感性和特异性。利用该检测方法对某屠宰场472头猪肺组织病料进行检测,其结果显示:Mh、PM和App的阳性检出率分别为19.27%、5.5%和2.75%;而ELISA检测的阳性检出率分别为18%、5.08%和1.9%。这两种方法对阳性的样品检测的平均符合率为90%;此外,多重PCR与病原分离培养方法的符合率为100%。     

猪的胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

在已经建立猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪多杀性巴氏杆菌(PM)、副猪嗜血杆菌(HPS)的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件的优化,成功地建立了APP、PM、HPS的复合PCR实验室诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增出APP的342bp、PM的457bp和HPS的821bp的特异性片段。该复合PCR能同时检测到100个每种细菌或50pg的APP或HPS的DNA和500pg的PM的DNA。该三重复合PCR的敏感性同已报道的单PCR一致。该方法的建立对临床上进行这3种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

在已建立的副猪嗜血杆菌(HPS)、多杀性巴氏杆菌(Pm)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)的单重PCR检测方法的基础上,通过对扩增条件的优化,利用一次PCR反应可同时扩增出APP的256 bp、Pm的457 bp、HPS的822 bp的特异性片段,建立了HPS、Pm、APP的多重PCR实验室诊断方法。该复合PCR可检测60 pg的HPS、120 pg的Pm、50 pg的APP。利用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性猪体内分离到的39株细菌,结果显示HPS、Pm、APP分别为12、16、2株,对39份病料的检测与常规细菌分离鉴定结果一致,可见该方法适用于HPS、APP、Pm的临床快速检测。     

二联PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌和猪巴氏杆菌

猪胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(App)引起的一种急性传染病;猪肺疫是由多杀性巴氏杆菌(PM)引起的一种危害严重的疾病。App和PM都是引起猪呼吸道综合征的主要细菌性病原,临床上混合感染的现象常有报道。由于这两种细菌均能引起呼吸道疾病症状,但只根据临床症状很难进行鉴别诊断。目前对于这两种菌的研究多为将两种菌分别在不同反应条件下进行PCR扩增,实际操作起来比较繁琐,成本也相对较高。试验旨在建立App和PM的二联PCR方法,即在同一PCR管中,能同时进行这两种细菌各自的特异基因片段的扩增,以达到简化诊断程序、快速确诊和降低诊断成本的目的,使之更好地应用到实际的诊断工作中。     

猪多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的建立及应用

设计了一对用以检测猪多杀性巴氏杆菌的引物。对临床送检的有肺炎症状或萎缩性鼻炎症状的发病猪的病料进行细菌培养，然后挑菌做PCR，同时对可疑菌落纯化培养后做生化鉴定。结果，从不同省(市)送检的病料中分离鉴定出66株多杀性巴氏杆菌，PCR检测结果与生化鉴定结果完全符合；该引物对其他6种猪的常见呼吸道病原菌扩增均为阴性；该PCR检测方法能检测出cfu为10^3的巴氏杆菌模板。     

抗菌药物对多杀性巴氏杆菌、猪链球菌及胸膜肺炎放线杆菌的敏感性调查

本试验调查了头孢噻呋、青霉素、恩诺沙址、氟笨尼考、心环素、替米考星及泰拉菌素等抗生素对2001-2010年间从美国与加拿大患有呼吸道疾病的患猪体内分离的病原菌（多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌）的敏感性，本研究是一个持续进行的兽医抗生素敏感性长期监测项目的一部分。     

山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌双重 PCR 检测方法的建立

为建立一种能够同时检测山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌的双重 PCR 方法，本研究采用2对特异性引物，对退火温度和引物浓度比进行了优化，成功建立了一种能同时检测上述两种病原的双重 PCR 方法。结果显示，该方法具有很好的特异性，仅对山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌有扩增，而对其他常见的羊呼吸道病原无扩增；该方法对两种病原的检测限分别为32 pg 和50 pg，与单独 PCR相同；26份临床样品中山羊支原体山羊肺炎亚种的检出率为23．1％，多杀性巴氏杆菌的检出率为26．9％。所建立的双重 PCR 具有特异性好、灵敏度高的特点，为临床上这两种病原感染的快速诊断和流行病学调查等提供了更为有用的手段。     

猪肺炎支原体检测芯片的研制及初步应用

本研究探索建立一种新的基因芯片方法检测和鉴定猪肺炎支原体。在猪肺炎支原体的16SrRNA、P36和P463个基因内设计3个靶基因片段,用PCR标记Cy3探针,建立了用于检测和鉴定猪肺炎支原体的检测芯片。试验结果显示,猪肺炎支原体与检测芯片的3个靶基因（Mhp-16S、Mhp-P46和Mhp-P36）杂交呈阳性,猪鼻支原体只与Mhp-16S靶基因杂交呈阳性,其它所测细菌和病毒不与检测芯片的靶基因杂交。检测芯片的检测灵敏度和PCR相同,能达到10pg基因组DNA／50μL标记体系或反应体系。用检测芯片鉴定了3株疑似猪肺炎支原体临床分离株,结果有2株为猪肺炎支原体,1株为其它猪支原体。用检测芯片、P36-PCR和分离鉴定分别对45头病猪临床样品选择混合培养物中的猪肺炎支原体进行了检测,结果它们的检出率分别为20％（9／45）、22．2％（10／45）和8．9％（4／45）。检测芯片还检出有26．7％（12／45）的病猪感染了其它猪支原体。试验结果表明,所建立的检测芯片是一种快速检测和鉴定猪肺炎支原体的敏感特异性方法。     

丝状支原体簇和多杀性巴氏杆菌双重PCR方法的建立及应用

本研究旨在建立丝状支原体簇和多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,从而为临床上同时检测这2类病原的感染提供一种更方便、快捷、准确的工具。本研究采用2对特异性检测丝状支原体簇和多杀性巴氏杆菌的引物,对PCR反应体系和反应条件进行了优化,并对双重PCR的特异性及敏感性进行了评价,随后采用该方法对52份临床样本进行了检测。结果显示,所建立的双重PCR方法能同时扩增丝状支原体簇成员和多杀性巴氏杆菌的DNA,而对来源于其他常见病原的DNA均无扩增;对丝状支原体簇和多杀性巴氏杆菌的最低检测限分别为24.8和28.9 pg;能成功地从临床样本中检测丝状支原体簇成员和多杀性巴氏杆菌。结果表明,本研究所建立的双重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,为临床丝状支原体簇和多杀性巴氏杆菌感染的快速诊断、病原鉴定及流行病学调查提供了有效的方法。     

猪肺炎支原体显色原位杂交研究方法的建立

为建立猪肺炎支原体(Mhp)显色原位杂交(CISH)定位检测方法,本研究利用地高辛标记的Mhp P36核酸探针和DAB/H2O2显色系统,对人工Mhp感染组、自然感染组和健康对照组的实验猪肺组织样品和临床样品进行显色原位杂交检测.结果显示,设计的地高辛标记探针针对Mhp具有特异性,而与其他的猪病原菌无交叉反应;检测结果可以通过显微镜观测到Mhp定位在支气管/细支气管黏膜表面.人工感染组、自然感染组和健康对照组的CISH结果与PCR检测结果一致,临床样品的CISH检测结果低于PCR检测结果.本研究建立的Mhp显色原位杂交法是一种集直观和敏感为一体的检测方法,可以用于Mhp的定位检测和致病机理研究.     

Antibody response in sows and piglets following vaccination against Mycoplasma hyopneumoniae, toxigenic Pasteurella multocida, and Actinobacillus pleuropneumoniae

The aim of the experimental study was to compare the humoral immune response and occurrence of adverse effects following single or multiple simultaneous vaccination of sows against Mycoplasma hyopneumonia, toxigenic Pasteurella multocida, and Actinobacillus pleuropneumoniae. In addition, passively transferred antibodies to piglets were studied until weaning at 3 weeks of age. Fever was seen in a few sows within the first 12 hours after the 1st and 2nd vaccination. No difference in the occurrence of other adverse effects was observed between groups. Antibody levels were significantly higher in vaccinated sows and their offspring compared with the control group. This was found to be independent of single or simultaneous vaccinations with the 3 vaccines. In conclusion, applying multiple vaccines simultaneously to sows appeared not to influence the occurrence of adverse effects or the sow’s serum levels of antibodies at the time of farrowing, nor the offspring’s serum levels up to 3 weeks of age.     

Treatment of pigs experimentally infected with Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella multocida, and Actinobacillus pleuropneumoniae with various antibiotics.

The authors have performed a comparative study of the efficacy of various in-feed medications for the treatment of 5- to 6-week-old specific pathogen-free (SPF) piglets experimentally infected on day 1 with Mycoplasma hyopneumoniae, on day 8 with Pasteurella multocida (serotype A), and on day 15 with Actinobacillus pleuropneumoniae (serotype 2). The treatment started on day 9 and continued for 12 consecutive days, then the piglets were euthanized for examination of macroscopic, histologic, and pathologic lesions and for the presence of mycoplasmas and bacteria in the lungs. Based on the results of clinical observations (respiratory signs, rectal temperature, body weight gain, and feed conversion efficiency), macroscopic and histologic lesions of the lungs, and microbiologic findings, the best results were obtained by treatment of pigs with Econor + chlortetracycline, followed by Tetramutin, Pulmotil, Cyfac, and lincomycin + chlortetracycline.     

Evaluation of serovar-independent ELISA antigens of Actinobacillus pleuropneumoniae in pigs, following experimental challenge with A. pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae and Pasteurella multocida

Objective To compare the sensitivity and specificity of six serological enzyme‐linked immunosorbent assays (ELISAs) based on serovar‐independent antigens of Actinobacillus pleuropneumoniae (App) and investigate cross‐reactivity in disease‐free pigs challenged with Mycoplasma hyopneumoniae and Pasteurella multocida. Design Five experimental pig trials using direct challenge with App serovars 1, 7 or 15 or direct challenge with M. hyopneumoniae and/or various dose rates of P. multocida. Procedure A 39‐kDa outer membrane protein antigen and five recombinant antigens from the apxIVA gene of App were evaluated. The latter were derived from the ApxIVA N‐terminus (ApxIVA‐N, ApxIVA‐NP, ApxIVA‐NPS) or C‐terminus (ApxIVA‐C, ApxIVA‐CP). Pigs were sampled after challenge and clinical and necropsy findings evaluated. Results The 39‐kDa ELISA had high sensitivity but lacked specificity, with significantly increased cross‐reactivity following P. multocida challenge. ELISAs based on ApxIVA N‐terminus antigens were significantly more sensitive than C‐terminus antigens for the detection of App‐induced disease. Although ApxIVA‐N and ApxIVA‐NP ELISAs had increased reactivity following P. multocida challenge, they retained high specificity for App‐induced disease (90–93%). Affinity purified ApxIVA‐NP antigen had marginally better specificity than ApxIVA‐N, without reduced sensitivity. Mycoplasma hyopneumoniae did not affect serological cross‐reactivity. In disease‐free pigs, the specificity of the ApxIVA‐NPS ELISA may be adversely affected by nasal carriage of apparently low‐virulence App strains. Conclusions ApxIVA‐N‐based ELISAs can be used for evaluating App status in commercial herds, but some appear limited by high carriage rates of low‐virulence App. The 39‐kDa antigen is only of merit in exclusion of App disease by negative serology.