结球甘蓝叶片卷曲过程中6个生长素相关基因的克隆与表达分析

生长素在结球甘蓝球叶向上、向内自然卷曲的过程中发挥着重要的调控作用。为挖掘重要的影响结球甘蓝叶片卷曲的生长素相关基因,通过对结球甘蓝莲座期叶片与结球期叶片的转录组进行对比分析,筛选出6个显著差异表达的生长素相关基因,分别为调控生长素动态平衡的Bo ILL6、Bo ASA1基因,控制极性运输的Bo SF21、Bo PIN4基因,参与信号转导的Bo ARF8、Bo GH3.5基因。对上述6个基因进行同源克隆,分别获得全长c DNA序列,序列分析发现6个基因均含有生长素相关的结构域。分子进化树分析发现各基因与芜菁的对应基因遗传关系最近,拟南芥次之。荧光定量PCR检测结果显示,Bo ILL6、Bo ASA1与Bo SF21的表达量变化最为显著,结球期叶片相对莲座期叶片的表达量差异均高达12倍以上,变化趋势与转录组数据分析结果基本一致,说明这3个基因可能与结球甘蓝叶片的卷曲发育密切相关。     

百合肌动蛋白基因lilyActin 的克隆与表达分析

 为了在百合功能基因表达研究中选择一个理想内参基因,依据岷江百合cDNA 文库所获得的百合肌动蛋白（Actin）基因的EST 序列,采用RACE 技术进行该基因cDNA 全长克隆,并利用实时荧光定量PCR 分析其在不同组织中的表达模式,获得百合肌动蛋白基因cDNA 全长序列（GenBank 登录号：JX826390）,命名为lilyActin。该基因cDNA 全长1 367 bp,其中,5′非编码区91 bp,3′非编码区233 bp,开放读码框1 134 bp,编码377 个氨基酸。序列比对发现,该基因与其它15 种植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性达98%。进化分析显示,百合肌动蛋白与郁金香肌动蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR 结果显示,该基因在百合的花蕾、叶片和鳞片组织中恒定表达,表明相对于其他物种的内参基因,lilyActin 更适宜作为百合属植物的内参基因。     

辣椒细胞质雄性不育相关基因的克隆与表达分析

以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应保持系21B为试材,根据辣椒细胞质雄性不育相关基因orf456序列设计特异引物,对21A及21B的基因组DNA进行特异性扩增,获得了不育系特有的目的条带,克隆测序表明其大小为292bp,命名为CMS292。采用QRT-PCR方法,研究了CMS292分别在蕾期、盛花期对根、茎、叶和花蕾中的表达水平的影响,以期探索雄性不育相关基因的表达机制。结果表明:该基因只在不育系中表达,并且在所检测的组织中都有表达;蕾期根和花蕾中的表达量明显高于茎和叶,盛花期根和叶中的表达量高于茎和花蕾;从蕾期到盛花期根、茎和花蕾中的表达量呈下降趋势,而叶中的表达量呈上升趋势,推测CMS292控制辣椒花药中蛋白的表达,引起小孢子败育,进而导致雄性不育。     

菊花抗白色锈病相关基因CmDREBa-2的克隆及表达分析

以菊花（Chrysanthemum morifolium）免疫白色锈病品种‘C029’为试验材料,基于白色锈病病原菌诱导的菊花转录组数据库,采用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）方法克隆得到菊花DREB（Dehydration responsive element binding protein）基因,命名为CmDREBa-2。对其进行生物信息学分析和表达分析,结果表明：CmDREBa-2开放阅读框（ORF）全长291 bp,编码96个氨基酸;预测CmDREBa-2蛋白相对分子质量为11 159.04,pI为11.34,是一个定位于细胞核、亲水的不稳定蛋白;氨基酸序列和结构分析显示该蛋白含有1个由49个氨基酸残基组成的AP2保守结构域,所以该蛋白属于AP2/EREBP家族;进化树分析表明CmDREBa-2属于DREB家族的A-1组,CmDREBa-2蛋白与菊花的其他两个DREB类蛋白CmDREBa和CmDREBb的同源性较高;菊花‘C029’接种白色锈病病原菌6 h后,CmDREBa-2表达量达到最高,约为未接菌对照的34倍;用水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和乙烯利（ETH）处理‘C029’菊花叶片,结果表明CmDREBa-2受3种激素的诱导表达。     

扁桃AcSFB基因的克隆与原核表达分析

 利用RT-PCR和RACE技术, 从新疆栽培扁桃‘鹰嘴’花药中获得了一个全长的SFB ( S-hap-lotype-specific F-box gene) 基因(GenBank登录号为FJ362525) , 命名为AcSFBd。该基因全长1 125 bp, 编码374个氨基酸, 在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F2box基序, 含有两个高变区(Hva和Hvb)和两个可变区(V1和V2) 。生物信息学的方法成功预测了AcSFBd蛋白分子质量为43 kD, 为亲水性、非分泌型蛋白, 在基质内起连接酶(EC6. - . - . -) 的作用。成功构建了原核表达载体, 并转化大肠杆菌BL21 (DE3) , SDS2PAGE检测结果显示表达了一个约60 kD的蛋白。     

花椰菜BoPGIP2基因的克隆与表达水平分析

以3个品系花椰菜为试材,采用同源克隆的方法,克隆了花椰菜BoPGIP2基因,并对表达水平进行分析。结果表明:该基因与油菜的PGIP2基因序列有较高的相似性;ExPASy分析发现BoPGIP2理论分子量为37.02kDa,等电点为8.51,分子式为C_(1672)H_(2604)N_(436O487)S_(13),不稳定系数为34.95,为稳定蛋白,脂肪族指数为92.48,GRAVY值为-0.096,表明其在一级结构上的亲水性、疏水性差异不显著。亚细胞定位预测分析表明,此蛋白属于分泌途径信号肽蛋白;qRTPCR分析发现BoPGIP2基因在花椰菜高抗菌核病品系、中抗菌核病品系中均是茎和叶中相对表达量较高,而在易感菌核病品系中则是根中相对表达量最高,叶和茎中相对表达量较低,这与抗菌核病强弱具有一致性,推测此基因很可能在调节花椰菜的抗菌核病中起着重要作用。     

乙烯利诱导菠萝成花过程中FT基因的克隆与表达分析

【目的】克隆菠萝AcFT基因并研究其表达模式,为深入研究该基因在乙烯利诱导菠萝成花中的功能奠定基础。【方法】从菠萝基因组数据库中获得AcFT基因全长序列,设计全长引物,克隆两个AcFT基因,分别命名为AcFT1和AcFT2,对基因序列进行生物信息学分析;通过qRT-PCR探究乙烯利处理后菠萝AcFT基因在不同组织、时间下的表达模式。【结果】AcFT1和AcFT2分别编码178和177个氨基酸,两者均含有PBP结构域,具有PEBP家族典型结构特征。实时荧光定量PCR分析结果显示,AcFT1和AcFT2都具有组织表达特异性,在茎和叶中相对表达量较高;乙烯利处理后,AcFT1和AcFT2在茎和叶中的表达具有相反的趋势,其中AcFT2明显受到乙烯利上调,呈现先上升后下降趋势,AcFT1则显示为先下降后上升。乙烯利处理后1 d,茎尖组织AcFT2的表达水平显著上升,相对表达量约为对照的178倍,而AcFT1则明显下调;乙烯利处理后31 d,AcFT2在茎尖中的表达水平达到最大值,约为对照的408倍,但AcFT1却处于极低水平。【结论】克隆得到2个AcFT基因,AcFT2基因在乙烯利处理后1 d及随后的花芽分化时期高度表达,表明AcFT2在响应外源乙烯利信号诱导菠萝成花过程中发挥重要作用。     

核桃FRUITFULL(JrFUL)基因的克隆及表达分析

【目的】研究核桃JrFUL基因的序列特征及在核桃雌雄异熟开花机制中的作用。【方法】以核桃雌先型品种‘极早丰’及雄先型品种‘新早丰’的雌雄花芽为材料,外部形态测量确定不同品种核桃雌雄花芽形态分化差异。通过qRTPCR技术,分析核桃JrFUL、JrAP1、JrLFY及JrSOC1基因在两个核桃品种不同发育时期的雌、雄花芽中的表达模式。克隆核桃JrFUL基因CDS序列,对其结构进行分析。【结果】春季萌芽期后,2月26日雌、雄花芽的横、纵径逐渐开始出现显著差异。不同核桃品种同一时期的雌、雄花芽的几个基因表达量有所差异。克隆得到的核桃JrFUL基因CDS编码区的全长序列长度为747 bp,命名为JrFUL,编码248个氨基酸。NCBI数据库Blast比对表明核桃JrFUL基因与其他植物物种FUL同源基因的相似性较高。系统进化分析发现核桃JrFUL与连香树及葡萄的FUL亲缘关系最近。【结论】JrFUL基因可能在核桃开花进程中起到关键作用,可能对雄花的开放有促进作用。JrLFY与JrSOC1基因可能一定程度上促进核桃开花,JrAP1基因可能一定程度上抑制核桃开花。     

辣椒CaCOI1 基因的克隆、表达及其序列分析

 利用RT-PCR技术从辣椒中克隆到基因CaCOI1,该基因编码的蛋白质由603个氨基酸残基组成,蛋白质的分子量为68.35 kD,等电点是6.32。在蛋白质N–端有1个F-box结构域,C–端有6个富含亮氨酸结构域。二级结构分析表明,CaCOI1蛋白分子中,α–螺旋、β–折叠、β–转角和不规则卷曲分别为51.41%、13.76%、5.80%和29.03%。CaCOI1蛋白的平均亲水系数为–0.143,为亲水蛋白。蛋白质序列比对和进化树分析表明,CaCOI1与番茄LeCOI1蛋白的一致性最高（94%）,进化距离最近。实时定量RT-PCR分析表明,CaCOI1在辣椒的根、茎、幼叶、成熟叶、花、青熟期果实、成熟红果等不同生长发育时期的组织中都能表达,在花中表达水平最高,是其他组织的2.8 ~ 5.4倍,表明CaCOI1在花的发育过程中起重要作用。     

桃生长素反应因子和生长素/吲哚乙酸蛋白家族基因的克隆及表达分析

生长素对果实发育起着重要的调控作用。生长素反应因子（auxin response factor,ARF）和生长素/吲哚乙酸蛋白（auxin/indoleacetic acids protein,Aux/IAA）是生长素信号转导系统中的两个关键因子,在转录水平上对生长素参与的生理活动进行调控。为探索生长素调控桃果实发育的机制,选取ARF家族的1 个基因PpARF1,Aux/IAA 家族的5 个基因PpIAA3、PpIAA9、PpIAA17、PpIAA26 和PpIAA29,克隆其全长cDNA 序列并进行生物信息学分析,对它们在桃果实不同发育时期中果皮和种子的表达进行qRT-PCR 检测。序列分析表明：这6 个基因的编码区全长分别为2 037、594、1 194、618、384 和723 bp,分别编码678、197、397、205、127 和240 个氨基酸;氨基酸序列比对分析显示桃PpARF1 蛋白序列和草莓的FvARF1（XP_004300014.1）同源性最高,达到90.56%,PpIAA 家族的5 个蛋白同源性很低,只有23.77%;荧光定量PCR 结果显示,在花后52 d（果实发育硬核期）,PpIAA3 和PpIAA17 在中果皮中的表达量显著升高;PpIAA26、PpIAA29 和PpARF1 在种子中的表达量显著升高。预示生长素可能在桃果实发育硬核期发挥着重要的调控作用。     

梨PbChiⅡ基因的克隆及荧光定量表达分析

以鸭梨为试材,采用qRT-PCR技术克隆鸭梨果实几丁质酶基因PbChi Ⅱ,并对几丁质酶氨基酸序列进行聚类分析;同时采用荧光定量PCR的方法对鸭梨植株不同器官及水杨酸(salicylic acid,SA)和梨轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana de.Not.f.sp.piricola(Nose)Koganecawa et.Sokwwa)处理后几丁质酶基因的表达量进行了分析,以期为该基因的进一步研究与利用提供参考依据。结果表明:PbChi Ⅱ基因长度为969bp,核苷酸序列及推导的氨基酸序列与沙梨的同源性均达到100%,该基因属于第Ⅱ类几丁质酶基因;PbChi Ⅱ在根和果实中表达量较大。在鸭梨果实中,SA和病原菌可诱导该基因表达,且表达量在48h达到最高,初步推测PbChi Ⅱ可能参与SA介导的植物抗病防卫反应的信号通路及轮纹病菌引起的防卫反应。     

辣椒花器官发育MADS-box基因的克隆与表达分析

采用RACE技术从辣椒（Capsicum annuum L.）花药中获得了一个控制辣椒花器官发育的MADS-box基因,命名为PPI（GenBank登录号：GU812276）。该基因全长952 bp,编码215个氨基酸,具有典型的MADS结构域和K结构域,与番茄花器官发育MADS-box基因TPI高度同源,同源性达88%。系统进化树分析表明,PPI基因属于花器官发育B类基因。RT-PCR表达分析表明,该基因在辣椒花瓣中的表达高于在花药、萼片以及子房等花器官中的表达,在营养器官叶片中没有表达。     

茶树LEAFY基因的克隆和表达分析

以茶树（Camellia sinensis）大叶且无蕾不开花的突变体‘大叶龙’及其母株为材料,通过同源克隆结合RACE-PCR方法,克隆了LEAFY（LFY）同源基因的全长cDNA序列,两种序列分别命名为CsLFL1和CsLFL2,其cDNA全长分别为1 448和1 466 bp,各自包含1 191和1 197 bp的完整开放阅读框,编码396和398个氨基酸。它们与漆树科、无患子科以及壳斗目（山毛榉目）一些物种的LFY同源序列具有77% ~ 79%的一致性,具有植物LFY成员作为转录因子的脯氨酸富集区、亮氨酸重复、酸性和碱性结构域以及保守的C–端等典型结构特征。系统发育分析表明,它们属于双子叶植物LEAFY分支,并且亲缘关系最近,说明两者的形成是发生在茶树物种进化过程中较晚期的复制事件。两种序列在正常开花母株及‘大叶龙’中没有区别,在母株花芽中强烈表达,在母株和‘大叶龙’叶芽中有微弱表达。这些结果说明CsLFL1和CsLFL2代表了茶树中LFY的同源基因,并且可能参与茶树的成花启动过程。     

甘蓝自交不亲和性相关基因BoPLL的克隆、定位与表达分析

对高度自交不亲和甘蓝柱头进行自花授粉和异花授粉处理后,取柱头进行蛋白质表达谱的比较研究,获得一种受自花授粉诱导下调表达,异花授粉诱导上调表达的蛋白,命名为BoPLL。进一步分析转录组数据发现,BoPLL在自花授粉0 ~ 30 min上调表达,30 ~ 60 min下调表达,而在异花授粉0 ~ 60 min一直上调表达。克隆获得cDNA为1 212 bp,编码含403个氨基酸残基的蛋白质BoPLL。序列分析发现BoPLL含有高度保守的PASTA结构域和CMM-10结构域、中度保守的PbH1结构域、低度保守的HYDRO结构域,说明该蛋白是典型的PLL家族蛋白。染色体定位结果表明,该基因与自交不亲和性相关基因不连锁。进化分析表明,甘蓝BoPLL与拟南芥AtPLL亲缘关系最近,与苜蓿MtPLL亲缘关系较远。RT-PCR发现,BoPLL在甘蓝花粉和柱头中表达,且柱头中的表达量明显低于花粉,在叶片、花蕾、萼片和花瓣中均没有检测到表达信号。荧光定量PCR结果显示,BoPLL在自花授粉和异花授粉15 ~ 60 min的表达变化趋势与转录组分析结果基本一致。根据上述结果推测BoPLL可能是一种参与甘蓝自交不亲和反应过程的基因。     

香石竹水孔蛋白基因的克隆及表达分析

以香石竹(Dianthus caryophyllus)‘马斯特’为试验材料,在分析香石竹和石竹转录组数据的基础上克隆得到10个水孔蛋白(AQP)基因,7个属于PIP亚家族,3个属于TIP亚家族;其中DcaAQP1、DcaAQP2、DcaAQP3、DcaAQP4、DcaAQP6、DcaAQP8和DcaAQP10在萼片中优势表达,DcaAQP5在茎和花瓣中优势表达,DcaAQP7在叶中优势表达,DcaAQP9在各个组织中表达均比较低;在切花开放萎蔫过程中,DcaAQP1、DcaAQP3和DcaAQP6的表达量从花蕾期开始升高,半开期达到最高,DcaAQP4、DcaAQP7、DcaAQP9和DcaAQP10在盛开期表达量达到最高;DcaAQP2在花蕾期表达量最高,DcaAQP5在开始萎蔫期表达量达到最高,表明多个AQP基因协同作用来维持切花开放萎蔫过程中花瓣细胞水分吸收和营养物质转运。     

洋葱开花相关基因AcLFY 的克隆与表达分析

 以洋葱（Allium cepa L.）品系‘1007’为试材,采用同源基因克隆及RACE-PCR 的方法, 获得植物开花调控关键基因LEAFY 的同源基因的cDNA 序列,命名为AcLFY,GenBank 登录号为 JX275962。序列分析表明,该基因包含1 个1 119 bp 的开放阅读框,编码372 个氨基酸,该氨基酸序列 含有5′-N 端脯氨酸富集区,亮氨酸拉链结构和中央酸性区,具有LEAFY（FLO）家族的典型结构特征。 同源分析表明,该氨基酸序列与水仙的同源性接近70%,与其他高等植物LEAFY 类蛋白的同源性均在 50%以上。进化树分析表明AcLFY 与单子叶植物的亲缘关系高于双子叶植物。荧光定量结果显示,AcLFY 在洋葱抽薹开花的整个过程中都有表达,在抽薹初期的花序分生组织中表达量最高,在花器官中只有微 量表达,花器官形成后,主要在叶片中表达。     

西瓜抗根结线虫相关基因的克隆与表达分析

【目的】筛选西瓜(Citrullus lanatus)抗根结线虫相关基因,克隆其全长CDS序列,检测根结线虫接种后其在抗病材料和感病材料中的表达特征,分析其与西瓜根结线虫抗性的关系。【方法】以抗根结线虫的野生西瓜‘09005’和易感根结线虫的栽培西瓜‘ZDPI0006’为试材,用已知的植物抗线虫基因在葫芦科基因组数据库中比对,从结果中筛选到西瓜的相关基因Cla006580,与甜菜抗孢囊线虫基因Hs1~(pro-1)同源性达到65%,命名为Cla Hs1~(pro-1)。克隆Cla Hs1~(pro-1)基因的CDS区序列并进行生物信息预测分析,在根结线虫接种处理和CK处理72 h内利用q RT-PCR技术检测不同抗性的西瓜根系中Cla Hs1~(pro-1)的表达特征。【结果】从野生抗病西瓜‘09005’和栽培易感西瓜‘ZDPI0006’中均克隆得到Cla Hs1~(pro-1)基因,CDS区序列全长1 434 bp,编码478个氨基酸,含有Hs1pro-1_N和Hs1pro-1_C两个蛋白保守结构域,抗、感材料之间存在4个SNP位点。RT-PCR分析显示‘09005’在接种根结线虫后Cla Hs1~(pro-1)表达趋势呈先抑后扬,而在CK中呈先扬后抑,二者相反;‘ZDPI0006’在接种根结线虫后Cla Hs1~(pro-1)表达趋势呈先上扬后抑制再上扬,与CK中表达趋势一致。【结论】西瓜Cla Hs1~(pro-1)基因在抗病材料中表达特征与根结线虫接种密切相关,而在感病材料中与根结线虫接种无明显相关性,是西瓜抗根结线虫可能的候选基因。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

据《园艺学报》2014年第2期《草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析》（作者张勇等）报道，以“丰香”草莓为试材进行基因克隆，并通过SON—PCR结合RT—PCR技术检测了该基因在低温胁迫和其他环境胁迫下的诱导表达特性。     

苹果梨果皮花色素苷合成相关基因PyANS的克隆与表达分析

以延边地区苹果梨为试材,采用同源克隆及实时荧光定量PCR的试验方法,研究PyANS基因在苹果梨解袋前后果实着色过程中的表达特性及与花青苷积累的关系。结果表明:PyANS的全长cDNA为1 075bp,其开放阅读框(ORF)编码358个氨基酸,分子量约为40kDa,理论等电点pI为5.38。同源性分析表明与同属的砂梨相似性高达99%,实时荧光定量PCR分析表明PyANS基因受到光诱导表达量迅速上升,去袋1d后表达量迅速增加,第10天时达到最大值,随后迅速下降,最终稳定在同一表达水平,与果实着色和花色苷含量测定的结果相对应,表明PyANS基因对果实花色素苷积累有一定的促进作用。     

枸杞酸性转化酶基因的克隆及组织表达分析

以"宁杞1号"枸杞为试材,通过RT-PCR及RACE技术进行枸杞酸性转化酶基因的克隆及组织表达分析,并运用MEGA 5.0软件对植物转化酶基因进行了系统树分析。结果表明:扩增获得2 193bp的枸杞酸性转化酶基因,命名为LbSAI(GenBank:KC776575),该基因推导氨基酸序列与马铃薯、番茄、梨等酸性转化酶基因氨基酸序列同源性为68%~100%;LbSAI编码的蛋白质属于液泡酸性转化酶;Real-time PCR表达分析显示,LbSAI基因在枸杞花中表达量最高,在根中表达水平较低。