仔猪腹泻致病性大肠杆菌分型鉴定及耐药性分析

为了解贵州省规模化养猪场腹泻仔猪致病性大肠杆菌流行情况及耐药性变化,本研究运用凝集试验、PCR和药敏纸片琼脂扩散法等方法对分离的78株致病性大肠杆菌进行血清型、毒力基因及耐药性分析。结果显示,78株致病性大肠杆菌以O138、O87血清型为主,占定型菌株的60.8%;其中62株致病性大肠杆菌检出毒力基因,检出率为79.5%,可分为8种毒力基因类型,分属肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)和肠聚集性大肠杆菌(EAEC),毒力基因eaeA、elt和escV检出率较高,分别为38.5%、28.2%和21.8%;分离到的致病性大肠杆菌对β-内酰胺类药物高度耐药,均为多重耐药株,耐药种类可达8种以上。结果表明,当前贵州省规模化养猪场腹泻仔猪致病性大肠杆菌的毒力基因检出率较高且基因型复杂,耐药性严重。本试验结果可为规模化养猪场防控仔猪腹泻提供基础资料及理论依据。     

上海地区猪源大肠杆菌血清型及其毒力因子分布调查

对上海地区分离的199株猪源大肠杆菌分离株进行血清型鉴定和毒力因子检测,使用大肠杆菌标准抗O因子血清进行玻片凝集试验;采用普通和多重PCR方法,对分离株进行STa、STb、LT、Stx2e等4种肠毒素和K88、K99、987P、F18、F41等5种黏附素检测。结果:199株猪源大肠杆菌分离株有110株鉴定出血清型,占检测菌株的55.28%,覆盖了30种血清型,优势血清型为O8、O45、O64、O78、O138、O157、O163、O7+O8,占定型菌株的60%。共有32株大肠杆菌检测到毒力因子,阳性率为16.08%,检测出9种毒力因子。其中有21株单独检测到肠毒素,占65.63%,STa和STb+LT阳性的菌株分别为14和4;6株单独检测到黏附素,3株菌株K99阳性;5株同时检测到肠毒素和黏附素。在32株毒力基因阳性的大肠杆菌中,有15株血清型定型,覆盖7种血清型,其中O138、O7+O8与肠毒素STa相关,O8、O45与STb+LT相关。研究表明,上海地区猪源大肠杆菌分离株优势血清型至少覆盖了包括O8、O45、O64、O78、O138、O163等在内的8种血清型;大肠杆菌分离株以产肠毒素为主,主要毒力因子包括黏附素K99和肠毒素STa、STb+LT等。     

新疆地区腹泻仔猪源大肠杆菌的分群、血清型鉴定及耐药性分析

旨在了解新疆地区腹泻仔猪源大肠杆菌的系统进化分群、血清型及耐药性。本研究对154份腹泻仔猪粪便样品进行大肠杆菌的分离鉴定,采用多重PCR方法对分离株进行系统进化分群和O血清型鉴定,通过K-B纸片法对其进行药物敏感性检测并通过PCR方法进行耐药基因检测。结果显示：共分离到154株大肠杆菌,包括ETEC(n=24)、STEC(n=21)、EPEC(n=1)、EPEC/STEC(n=2)、ETEC/STEC(n=1)和ETEC/EPEC(n=1),其他104株。系统进化分群显示,多数菌株属于B1(37%)和A群(31%)。定型菌株44株,分别属于10种血清型,以O154、O12、O8、O141和O175为主要流行血清型。151株(98%)为多重耐药菌,对复方新诺明、四环素、氨苄西林、链霉素和氯霉素的耐药率为81%～100%,对阿莫西林/克拉维酸、头孢噻肟、庆大霉素、头孢曲松、环丙沙星和阿米卡星的耐药率为31%～66%,对左氧氟沙星、多黏菌素B、头孢他啶、头孢吡肟、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦和亚胺培南的耐药率为1%～19%。耐药基因tetA(88%)、tetG(60%)和cmlA(4...     

鸡源大肠杆菌OMP和OmpT基因与血清型相关性

为了解禽致病性大肠杆菌分离株OMP、OmpT基因与血清型相关性,对6种血清型(O78、O38、O9、O91、O11、O157)的7株鸡源大肠杆菌菌株进行了外膜蛋白(OMP)和外膜蛋白酶T(OmpT)基因的研究.用N-十二烷酰肌氨酸法提取其外膜蛋白,经SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色,对鸡源大肠杆菌菌株进行了外膜蛋白分型;用PCR和生物信息学的方法对OmpT基因进行检测与分析.7株大肠杆菌共有3个OMP型,其中,分离株5,32,9主要由相对分子质量接近的2条带组成,为OMP-1型;分离株11主要由相对分子质量接近的3条带组成,为OMP-2型;分离株14,7主要由相对分子质量接近的1条带组成,为OMP-3型.这表明同一血清型的菌株可能属于不同的OMP型,而血清型不同的分离株之间却可具有相同的OMP型.PCR检测结果显示7株鸡源大肠杆菌均携带OmpT基因,与GenBank登录的序列比较发现其同源性为91.9％～100.0％,不同血清型菌株间的同源性为91.9％～98.0％.该试验证实了同一血清型分离株之间可发生遗传分化,而不同血清型分离株之间也可具有不同程度的遗传相关性;不同血清型分离株间的OmpT基因的同源性存在一定的差异.     

安徽部分地区猪场产肠毒素大肠杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析

产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是猪场仔猪黄白痢的重要病原之一。为调查安徽省猪场中ETEC的感染情况,在2018年对该省6个地区的17个规模化猪场的仔猪黄白痢样品进行了ETEC的分离鉴定。结果:经PCR鉴定,在479份病料中分离出110株ETEC菌株。对这些菌株进行血清型、耐药性和致病力分析表明,该110株ETEC菌株共鉴定出13种血清型,以O8、O20、O128为优势血清型。110株ETEC菌株表现出高耐药性,对强力霉素的耐药率高达100%(110/110);对新霉素、红霉素、庆大霉素、阿莫西林、四环素等抗生素的耐药率均高达70%以上,且多数菌株表现出多重耐药,其中9、10重耐药菌株数最多。分别将优势血清型O8、O20、O128菌株对小鼠进行攻毒,结果同一血清型中强毒株数量分别占该血清型菌株总数的50%(55/110)、72.7%(8/11)和66.7%(4/6),表明这些优势血清型菌株的毒力普遍较高。本研究为猪场ETEC引起的仔猪黄白痢的流行病学研究及防控提供一定的参考。     

泰安地区鸡源致病性大肠杆菌流行病学调查与耐药性分析

正本调查对鸡场采集的疑似鸡大肠杆菌病例的相关病料进行大肠杆菌的分离鉴定,共分离鉴定出14株鸡源大肠杆菌,以微量平板凝集试验鉴定分离菌株的O抗原血清型,分别属于O78、O2和O1等3个血清型,其中O78(6/14)、O2(6/14)为主要流行血清型,占分离菌株总数的85.71%。选取了20种常用治疗肠杆菌病的抗生素对14株鸡源大肠杆菌分离株进行药敏试验,对14株大肠杆菌     

仔猪腹泻致病性大肠杆菌分型鉴定及耐药性分析

为了解贵州省规模化养猪场腹泻仔猪致病性大肠杆菌流行情况及耐药性变化,本研究运用凝集试验、PCR和药敏纸片琼脂扩散法等方法对分离的78株致病性大肠杆菌进行血清型、毒力基因及耐药性分析。结果显示,78株致病性大肠杆菌以O138、O87血清型为主,占定型菌株的60.8%;其中62株致病性大肠杆菌检出毒力基因,检出率为79.5%,可分为8种毒力基因类型,分属肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）和肠聚集性大肠杆菌（EAEC）,毒力基因eaeA、elt和escV检出率较高,分别为38.5%、28.2%和21.8%;分离到的致病性大肠杆菌对β-内酰胺类药物高度耐药,均为多重耐药株,耐药种类可达8种以上。结果表明,当前贵州省规模化养猪场腹泻仔猪致病性大肠杆菌的毒力基因检出率较高且基因型复杂,耐药性严重。本试验结果可为规模化养猪场防控仔猪腹泻提供基础资料及理论依据。     

福建省龙岩市禽致病性大肠杆菌的血清型、毒力因子及耐药研究

本研究对2015年分离自福建省龙岩市的139株禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的血清型、毒力因子分布及耐药性等进行检测,并对血清型与耐药性、毒力因子分布和耐药性之间的相关性进行分析,以期为APEC的防控提供参考。对139株分离菌株的血清型检测结果表明,O1血清型(11株)、O2血清型(14株)和O78血清型(14株)占全部菌株的28%;对分离菌株毒力基因检测结果表明,4%和7.1%的菌株检测到papC基因和vat基因,14.3%和19.3%的菌株检测到aat A基因和cva/cvi基因。而iuc D(82%)、tsh(59%)、iss(55%)和irp2(44.6%)基因在分离菌株中具有较高的检出率;药敏实验结果表明,分离株存在多重耐药性,99%以上分离菌株对红霉素、克林霉素和利福平耐受,86%的分离菌株对10种以上抗生素耐受,57.3%的菌株对13种药物都耐受;对血清型、耐药性与致病性之间的分析结果表明,分离的O1、O2和O78血清型的菌株,其中50%的菌株是含有5种以上毒力基因的强毒株,且在分离的含有5种以上毒力基因的强毒株中,50%的菌株对13种抗生素耐受,90%的菌株对10种以上药物耐受。     

新疆克拉玛依地区奶牛源致病性大肠杆菌的血清型、系统进化群及MLST分析

试验对新疆克拉玛地区106头健康成年荷斯坦奶牛的新鲜粪便进行了致病性大肠杆菌的分离鉴定、分型及遗传进化分析,初步掌握了调查地区奶牛致病性大肠杆菌的流行情况。参考USDA检测法,对106份粪便样品选择性增菌,分别利用麦康凯和伊红美蓝琼脂培养基对大肠杆菌进行分离纯化鉴别,通过PCR方法鉴定,获得55株大肠杆菌分离株,对这些分离株进行致病性大肠杆菌血清型鉴定、系统进化群及多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）分析,利用goeBURST和Mega 7.0生物学软件进行聚类和进化研究,并进行流行病学分析。结果显示,106头健康荷斯坦奶牛的新鲜粪便中大肠杆菌的检出率为51.89%,55株大肠杆菌分离株共鉴定出9种与致病性相关的血清型,检出率为54.55%,其中肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）和肠产毒性大肠杆菌（ETEC）血清型检出率分别为21.82%、18.81%和14.55%,优势血清型为O142∶K86（B）和O124∶K72（均为10.91%）,前者属于肠致病性大肠杆菌,后者属于肠侵袭性大肠杆菌,而肠出血性大肠杆菌（EHEC）血清型检出率为0;系统发育群结果表明,55株大肠杆菌中B1群所占比例最高,为70.91%,其次为A群,占21.82%,D群所占比例较少,占7.27%,B2群未检测出;MLST分析可知,分离株中存在24个ST型,其中优势ST型为ST154（18.18%）;进化树分析显示有7个进化分支。结果表明,新疆克拉玛依地区健康成年奶牛粪便大肠杆菌多样性丰富,不仅存在多种致病性大肠杆菌,而且大肠杆菌菌株之间还存在一定的进化关系。因此,健康成年奶牛粪便也具有潜在的安全风险,应加强对奶牛粪便致病性大肠杆菌的检测和监控。     

致狐狸肺炎大肠杆菌血清鉴定与毒力基因检测

为了确定狐狸肺炎源致病性大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)流行血清型与毒力基因的携带情况并分析其相关性,2016—2017年采集河北省部分地区患肺炎死亡的狐狸的肺脏、心血等组织142份中分离到了105株E.coli,且RT-PCR检测犬瘟热病毒为阴性,人工感染小鼠致病性试验结果显示105株分离菌株中77株为致病性E.coli。采用玻片凝集试验和PCR方法分别检测77株致病性E.coli血清型和毒力基因,结果显示:77株致病性E.coli有9种血清型,其中以O1、O8、O78、O12为流行的优势致病血清型,77株致病性E.coli携带14种不同毒力基因,以irp2、fyuA、papC、fimC、iucD^a、colv、hlyF、ompT 8种毒力基因检出率较高,在32.5%～98.7%之间,其余毒力基因检出率较低。狐狸肺炎源致病性E.coli的优势血清型携带的毒力基因较多,至少携带9种毒力基因,流行的优势血清型与毒力基因之间具有一定的相关性。狐狸肺炎源E.coli流行血清型代表株TS(O1)1、QH(O8)2、QH(O78)3、TS(O12)4均对狐狸很强的致病性。本试验为狐狸肺炎源致病性E.coli防控提供了参考依据。     

动物性食品源大肠杆菌O血清型鉴定及其K88菌毛基因检测

本研究对河北省冀东地区农贸市场和超市采集的生猪肉、生鸡蛋和生羊肉等分离得到的20株大肠杆菌进行大肠杆菌血清型鉴定;并检测不同血清型大肠杆菌的K88菌毛基因。采用常规方法进行大肠杆菌的O血清型鉴定,用PCR方法检测K88菌毛基因。分离鉴定的20株大肠杆菌有7种血清型,包括O38、O78、O88、O11、O107、O91、O9,其中O38、O78为优势血清型菌,均占分离菌株的25%(5/20)。在分离的动物性食品源大肠杆菌中有30%(6/20)的菌株K88菌毛基因扩增呈阳性。结果表明,O78、O38为冀东地区动物性食品源大肠杆菌常见血清型,30%(6/20)的菌株K88菌毛基因扩增阳性。     

陕西省部分禽源性大肠杆菌的外膜蛋白型

从陕西省部分优势血清型的禽源性大肠杆菌中提取外膜蛋白 (outer membrane protein,OMP) ,用 SDS- PAGE进行 OMP分型。 18株菌共产生了 3种 OMP型 ,其中 4株 O1菌株 ,4株 O2菌株 ,4株 O78菌株和 3株 O89菌株各属2个 OMP型 (OMP- 1,2型 ) ;3株 O75菌株属 3个 OMP型 (OMP- 1,2 ,3型 )。结果表明 ,陕西省分离的优势血清型禽源大肠杆菌具有多样性的 OMP型 ,且多种血清型间具有共同的 OMP型。     

牛源肠出血性大肠埃希菌的分离鉴定及进化分析

在牛群中分离肠出血性大肠埃希菌(EHEC),并将分离菌株与国际上流行的EHEC株之间的亲缘关系进行比较。应用PCR方法结合头孢克肟-亚碲酸钾山梨醇麦康凯琼脂(CT-SMAC)平板分离法对采集的565份样本(牛粪便397份,牛奶99份,奶牛场环境中的水样69份)进行EHEC分离和鉴定,在此基础上,对分离的菌株进行EHEC相关毒力基因的检测及致Vero细胞毒性研究。根据大肠埃希菌MLST数据库(http://mlst.ucc.ie/mlst/mlst/dbs/E.coli)提供的多位点序列分型(MLST)方案,利用MEGA 5.0软件分别对分离菌株进行分子分型及遗传进化分析。结果从565份样本中共分离到EHEC 40株,占分离样本总数的7.1%(40/565)。40株EHEC涵盖了17种血清型,以O157(4/40)、O26(4/40)、O91(7/40)、O100(4/40)、O97(6/40)、O92(2/40)为优势血清型。对40株EHEC进行相关毒力基因的检测发现,stx1、stx2、ehxA、saa基因检出率分别为82.5%(33/40)、75%(30/40)、90%(36/40)和27.5%(11/40),远高于eae(5%,2/40)、wzxO157(10%,4/40)基因检出率。38株携带stx1/stx2基因的EHEC均能产生志贺毒素,且能致Vero细胞产生病变。MLST分析表明,40株EHEC共有7个序列型(ST),其中ST297为优势序列型,占57.5%(23/40)。遗传进化分析表明,ST297型与国际上流行的EHEC具有较近的亲缘关系。本次分离的40株EHEC之间具有一定的分子多态性,与国际上流行的EHEC具有较近的亲缘关系。除了O157EHEC外,非O157EHEC对人类公共卫生安全也可构成一定威胁,因此,我国应加强对这一类菌株的监测与检测。     

2019—2020年河北部分地区鸡源致病性大肠杆菌的血清型及毒力基因分布

为确定河北部分地区鸡源致病性大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)的流行血清型及毒力基因变迁情况,本研究对2019—2020年来自河北部分地区的225份病死鸡组织样品,通过细菌分离纯化、PCR法共分离鉴定出181株致病性E.coli(2019年105株、2020年76株)。采用玻板凝集试验、PCR法对其进行血清型及毒力基因的研究,结果显示分离的菌株属于18种血清型,以O78(14.92%)、O1(14.36%)、O2(11.60%)、O18(10.50%)、O26(10.50%)为主要流行的血清型,其中2019年以O26、O1、O18、O78、O2血清型为主,检出率为7.62%～18.10%;2020年以O1、O2、O6、O9、O12血清型为主,检出率为7.89%～22.37%。分离菌株携带16种不同的毒力基因,未检测到Ler、eaeA、papC、sfa 4种毒力基因。其中2019年iutA毒力基因检出率最高,为96.19%(101/105);Vat、iutB、fyuA等9种毒力基因检出率为7.62%～76.19%;2020年的hlyF毒力基因检出率最高为100%;...     

禽病原性大肠杆菌1型菌毛主要亚单位结构基因的克隆、测序与表达

从禽源大肠杆菌037(O78)、166(O78)、120(O18)分离株和猪源大肠杆菌107／86分离株分别提取基因组DNA，并以此为聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)的模板，扩增上述分离株的1型菌毛主要亚单位结构基因pilA，通过其编码的主要菌毛亚单位FimA蛋白氨基酸的序列比较发现：3个禽源株间FimA的同源性为94．3％至99．0％；禽源株和猪源株间FimA的同源性为89．6％至91．1％。通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS-PAGE电泳分析及Western blot分析，禽源大肠杆菌O78 037株、O18 120株出现了一致的强反应，O78 166株反应较弱，而猪源大肠杆菌107／86株反应最弱。这些结果表明：禽源大肠杆菌与猪源大肠杆菌1型菌毛间存在抗原多样性，这种多样性甚至出现在禽病原性大肠杆菌同一血清型的2个不同分离株之间，如O78 037株O78 166株之间，尽管其FimA氨基酸的同源性很高，为99．0％。     

枣庄地区仔猪腹泻大肠杆菌O抗原血清型调查

为掌握枣庄地区致仔猪腹泻大肠杆菌的流行情况,阐明O抗原血清型分布,在枣庄市下属各县(市、区)部分养猪场采集病料,进行了大肠杆菌的分离培养、生化试验、O-抗原血清型鉴定、毒力试验及致病性回归试验等相关研究。结果表明:分离株分属于16个血清型:O15、O25、O27、O44、O45、O63、O78、O85、O125、O126、O127、O128、O142、O143、O152、O158,其中O15(10株)、O44(14株)、O45(11株)、O63(20株)、O78(8株)、O126(15株)血清型菌株占到总量的67.2%;毒力试验结果显示O44、O45、O126三种血清型致病力最强。说明枣庄地区致仔猪腹泻大肠杆菌有独特的血清型构成,在疾病防治过程中应引起重视。     

禽源和猪源大肠杆菌1型菌毛主要亚单位抗原多样性分子基础的初步研究

从禽源大肠杆菌037(O78)、166(O78)、120(O18)分离株和猪源大肠杆菌107/86分离株分别提取基因组DNA,并以此为聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)的模板,扩增上述分离株的1型菌毛主要亚单位结构基因pilA,得到了大小约570bp的扩增产物,将此扩增产物克隆于T载体,通过内切酶酶切分析得到4个阳性重组质粒;对上述4个大肠杆菌分离株的pilA基因进行序列测定,通过其编码的主要菌毛亚单位FimA蛋白氨基酸的序列比较发现:3个禽源株间FimA的同源性为94.3%至99.0%;禽源株和猪源株间FimA的同源性为89.6%至91.1%。在pilA开放性阅读框所编码的FimA182个氨基酸序列中,禽源大肠杆菌O78血清型的2个分离株037株和166株间只有2个氨基酸不同,其同源性为99.0%。     

江苏泰州某鸡场禽源性大肠杆菌的分离鉴定及生物学特征研究

为确定江苏泰州某鸡场疑似禽大肠杆菌病的病原,通过病理剖检了解组织器官病变情况,采集患病鸡的肝脏、心脏等脏器进行细菌分离培养,并测定分离株生化特性和血清型;采用PCR鉴定分离株及其携带毒力基因(iut A、iss、tsh、iro N、irp-2、cva C)的数量,经动物感染试验确定其致病力;通过药敏试验测定分离株对14种抗生素的耐药性。结果显示:共鉴定出4株禽源性大肠杆菌,其血清型分别为O78、O24、O88和O13,其中O78株(携带iut A~+、iss~+、iro N~+、irp-2~+、cva C~+)和O24株(携带iut A+、iss+、iro N+、cva C+)为强毒力菌株,O88株(携带iutA~+、iss~+、cvaC~+)和O13株(携带iss~+、cva C~+)为弱毒力菌株;4株禽源性大肠杆菌呈现多重耐药,对氨苄青霉素、四环素、强力霉素、先锋Ⅳ、磺胺异噁唑普遍耐药。研究表明,临床分离的禽源性大肠杆菌具有不同程度的致病性,且耐药严重,提示禽大肠杆菌病的防控难度增大。     

临沂市鸡源致病性大肠杆菌的优势血清型监测及其致病性试验

为了查清我市禽大肠杆菌的血清型及其致病性,对我市不同区域的23个规模化养鸡场及60个养鸡户的412份疑似大肠杆菌病病例进行了细菌分离,并对其进行了生化试验、致病性试验、血清学鉴定。结果:(1)412份病料中分离出了362株大肠杆菌,分离率为87.9%;⑵不同区域的鸡场流行的血清型有较大差异,在362个分离株中,除了27株未能定型、12株自凝外,共鉴定出323个分离株的O型血清型,占分离株的89.2%,这些定型菌株覆盖了36个血清型;(3)优势血清型为O1、O78、O18、O11、O88、O24,这6种血清型共占定型菌株的56.3%;⑷6种优势血清型均具有致病性,其中O1、O78、O18、O11、O24为高致病性菌株,O88为中致病性菌株。     

西藏藏猪源大肠杆菌毒力基因检测与分型

为研究西藏地区藏猪源肠产毒性大肠杆菌(ETEC)毒力分型情况,为用药方案提供科学依据,对西藏6个不同地、市200株藏猪源大肠杆菌进行了肠产毒性大肠杆菌毒力基因的PCR检测。结果显示:藏猪源肠产毒性大肠杆菌22对毒力基因中,只检出STp以及CS8基因,检出率为8%。对检测到的16株藏猪源肠产毒性大肠杆菌进行克隆测序,经系统发育分析发现藏猪源肠产毒性大肠杆菌菌株内同源性达到99.9%左右,与Genbank中所录其他菌株的同源性达到95%~100%。按照系统发育进化分型的方法,对16株大肠杆菌的检测结果显示有3株属于D群,其余均属于A群,P27、P28和P32有可能是一种具有致病性的大肠杆菌。上述结果说明藏猪源肠产毒性大肠杆菌基因确实存在,应引起重视,提示西藏地区要根据各地实际情况需要加强监测ETEC引起的腹泻,建立流行毒株预警机制,并合理用药。