猪血小板中蛋白激酶CK2的天然底物

目的：寻找猪血小板中蛋白激酶ＣＫ２可能的天然底物。方法：以［γ－＾３２Ｐ］ＧＴＰ为磷酸供体,用精胺激活蛋白激酶ＣＫ２和用肝素抑制蛋白激酶ＣＫ２活性,然后用放射自显影的方法检测底物蛋白磷酸化。结果：精胺可增加１７．４ｋＤ蛋白磷酸化;肝素能完全抑制４３ｋＤ和６６ｋＤ底物蛋白磷酸化,肝素还增加３９．４ｋＤ底物磷酸化。结果：猪血小板中１７．４ｋＤ、４３ｋＤ和６６ｋＤ的蛋白质可能是蛋白激酶ＣＫ２的天然底物。     

蛋白激酶CK2结构与功能研究进展

蛋白激酶 CK2 ,曾称为酪蛋白激酶 (casein kinase ) ,是一种在真核细胞中普通存在的高度保守的丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 ,是由两个催化亚基 (α和 /或α′)和两个调节亚基β构成的不均一四聚体[1 ] 。蛋白激酶 CK2底物众多 ,迄今发现有 2 0 0多种[2 ] ,这些底物在细胞功能的许多方面起重要作用 ,而且有些还是细胞复杂的信号加工系统的重要组成部分[2 ,3] 。许多研究表明 CK2α或 α′基因是潜在的癌基因 ,最近有研究表明 :CK2与 HIV- 1的关系非常密切 ,在 HIV- 1的复制、转录及裂解细胞等功能的调控中起着重要作用 ,CK2抑制剂具有抗…     

大豆黄酮对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学分析

目的：体外观察大豆黄酮对重组人蛋白激酶CK2的抑制效果及酶动力学分析以确定其抑制作用类型。方法：利用基因工程技术进行克隆、表达和纯化．获得重组人CK2的α^ 及β亚基在体外等摩尔混合构成CK2全酶．并测定大豆黄酮对酶的抑制作用及采用IC50结果的回归方程分析其动力学。结果：大豆黄酮能显著抑制重组人蛋白激酶CK2的活性(IS50=2．38μmol／L),抑制作用明显强于已知的CK2抑制剂5,6-二氯-1-β-D-呋哺核糖苯并咪唑(DRB)和N-(2-氨乙基)-5-氯萘-1-硫胺(A3)。酶动力学分析表明,大豆黄酮与ATP(Ki=3．02μmol／L)及酪蛋白(Ki=2．22μmol／L)均呈混合型抑制CK2的活性。结论：大豆黄酮是一种较强的体外蛋白激酶CK2的抑制剂。     

人早幼粒白血病HL-60细胞蛋白激酶CK2的研究

研究人早幼粒白血病ＨＬ－６０细胞蛋白激酶ＣＫ２的性质。方法经二次ＤＥ－５２离子交换纤维素柱,一次肝素－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４８亲和层析柱纯化后的ＣＫ２,以「γ－＾３２Ｐ」ＡＴＰ和「γ＾－３２Ｐ」ＧＴＰ为磷酸供体,以去磷酸化酷蛋白为底物,对其性质刊物研究。结果：Ｃａ＾２＋、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ等第二信使对ＩＬ－６０细胞的ＣＫ２活性无显著影响。肝素抑制ＣＫ２活性,而精胺激活ＣＫ２,肝素与精胺对ＣＫ２的作用     

小鼠蛋白激酶CK2α亚基cDNA的克隆与测序

有研究表明 :蛋白激酶 CK2的 α和 α′基因是原癌基因 ,CK2可能是肿瘤和艾滋病治疗的重要靶分子之一 ,其特异性抑制剂具有潜在的临床应用价值。克隆表达蛋白激酶 CK2的各亚基是深入研究的基础 ,鉴于目前还没有克隆表达小鼠蛋白激酶CK2 α亚基的报道 ,我们在已克隆表达人蛋白激酶 CK2 α和 β亚基的基础上 ,拟克隆和表达人 CK2 α′及小鼠 CK2 α、α′和 β亚基 ,为今后系统研究人及小鼠蛋白激酶 CK2各亚基和全酶的结构与功能打下基础。现将笔者构建的小鼠 CK2α亚基 c DNA重组质粒和进行 DNA测序的结果简报如下 :首先根据已发表…     

小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与序列分析

目的：构建小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA重组表达质粒，以便深入进行CK2结构与功能的研究。方法：通过反转录PCR从NIH3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA，PCR扩增酶为高保真DNA聚合酶。将NdeⅠ/HindⅢ彻底双酶切PCR产物定向连接到牛小肠碱性磷酸酶去5′端磷酸的同样彻底NdeⅠ/HindⅢ双酶切的表达载体pT7—7中，转化感受态大肠杆菌DH5α获得转化子，用0．8％琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化予，将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选两个阳性克隆进行DNA测序。结果：转化子的阳性筛选率为100％，限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质拉的大小与理论推测值相符。DNA测序结果表明：两个重组小鼠CK2β亚基克隆中的插入片段序列均与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异，但我们报道的这2个差异碱基与大鼠、兔、猪和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列一致。结论：本实验克隆的小鼠蛋白温酶CK2β亚基cDNA编码区序列可能是正确的序列。     

运用ABIPRISM310型基因分析仪测定重组人蛋白激酶CK2α和β …

目的：测定重组质粒中编码人蛋激酶ＣＫ２α和β亚基ｃＤＮＡ序列，筛选含完全正确插入片段的重组质粒。方法：随机选择人蛋白激酶ＣＫ２α和β重组质粒各四个阳性克隆。使用二氯罗丹明荧光标记徙氏物循环测序试剂盒，分别加入首尾正反或／或中段正反引物，运用ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０型基因分析仪ＤＮＡ测序，结果：在ＣＫα和β一克隆各有两个完全正确的插入片的重组质粒，其他２各两个重组质粒的插入片段中均对少一个碱基突变，２     

人蛋白激酶CK2 α亚基cDNA重组质粒的构建与测序

蛋白激酶ＣＫ２是真核细胞中普遍存在的一种ｃＡＭＰ非依赖性丝／苏氨酸蛋白激酶。它是由两个催化亚基（α或α′）和两个调节亚基（β）组成的不均一四聚体。ＣＫ２α基因具有癌基因作用。ＣＫ２可能是重要的药理靶点，其特异性抑制剂具有潜在的临床治疗价值。目前该酶的...     

针对人蛋白激酶CK2α亚基的shRNA表达质粒的构建与鉴定

目的:构建针对人蛋白激酶CK 2α亚基的shRNA表达质粒。方法:以mU 6pro为载体,化学合成shRNA表达模板,并定向克隆到载体的U 6启动子下游,琼脂糖凝胶电泳法筛选阳性克隆,基因测序法检测插入模板序列的正确性。结果:获得了正确的重组质粒,插入的转录模板序列完全正确。结论:成功构建了针对人蛋白激酶CK 2α亚基的RNA i体系。     

酵母穿梭表达质粒pGBKT7-hCK2α＇的构建

目的：用人蛋白激酶CK2α’(hCK2α’)cDNA片段构建酵母双杂交体系中“诱饵”载体。方法；通过PCR扩增已构建成功的重组质粒pThCKA’获得人CK2α’亚基编码区cDNA，将PstⅠ／NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样酶切的“诱饵”载体pGBKT7，转化感受态细胞DH5α获得转化子．琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子，将阳性克隆进行限制性内切酶酶切与DNA测序的方法鉴定。将DNA测序验证的pGBKT7-hCK2α’转染感受态酵母株AH109．Westernblot签定hCK2α’蛋白表达．检测表达产物对报道基因的激活作用及对酵母株AH109的毒性。结果：限制性酶切结果表明，插入片段和重组质粒的大小与理论值推测值相符。重组质粒pGBKT7-hCK2α’转染的酵母株AH109中能够表达hCK2α’蛋白，pGBKT7-hCK2α’无自主激活报道基因的能力及对酵母的生长无毒性。结论：pGBKT7-hCK2α’酵母双杂“诱饵”载体构建获得成功，可应用于酵母双杂交体系。     

MicroRNA-370-5p inhibits pigmentation and cell proliferation by downregulating mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 expression in sheep melanocytes

In mammals, microRNAs (miRNAs) play key roles in multiple biological processes by regulating the expression of target genes.  Studies have found that the levels of miR-370-5p expression differ significantly in the skins of sheep with different hair colors; however, its function remains unclear.  In this study, we investigated the roles of miR-370-5p in sheep melanocytes and found that the overexpression of miR-370-5p significantly inhibited cell proliferation (P<0.01), tyrosinase activity (P=0.001) and significantly reduced (P<0.001) melanin production.  Functional prediction revealed that the 3´-untranslated region (UTR) of MAP3K8 has a putative miR-370-5p binding site, and the interaction between these two molecules was confirmed using luciferase reporter assays.  In situ hybridization assays revealed that MAP3K8 is expressed in the cytoplasm of melanocytes.  The results of quantitative RT-PCR and Western blotting analyses revealed that overexpression of miR-370-5p in melanocytes significantly inhibits (P<0.01) MAP3K8 expression via direct targeting of its 3´ UTR.  Inhibition of MAP3K8 expression by siRNA-MAP3K8 transfection induced a significant inhibition (P<0.01) of melanocyte proliferation and significant reduction (P<0.001) in melanin production, which is consistent with our observations for miR-370-5p.  Target gene rescue experiments indicated that the expression of MAP3K8 in melanocytes co-transfected with miR-370-5p and MAP3K8-cDNA (containing sites for the targeted binding to miR-370-5p) was significantly rescued (P≤0.001), which subsequently promoted significant increases in cell proliferation (P<0.001) and melanin production (P<0.01).  Collectively, these findings indicate that miR-370-5p plays a functional role in inhibiting sheep melanocyte proliferation and melanogenesis by downregulating the expression of MAP3K8.       

甘蔗钙依赖蛋白激酶基因克隆与序列分析

[目的]克隆甘蔗钙依赖蛋白激酶基因(ScCDPK1),为其功能解析和育种利用打下基础.[方法]根据甘蔗cDNA文库中的CDPK基因序列信息设计引物,利用RT-PCR克隆ScCDPK1基因,并采用在线生物信息学分析软件对其推导蛋白的理化性质、跨膜结构、信号肽及保守结构域等进行预测分析.[结果]克隆获得的ScCDPK1基因完整编码区大小1650 bp,编码549个氨基酸,相对分子量61.971 kD,等电点(pI)6.78,不稳定指数35.63.同源性和遗传进化树分析结果显示,ScCDPK1基因与小麦TaCPK7基因亲缘关系最近,同源性达88%;ScCDPK1蛋白与其他已知CDPK蛋白一致,具有CDPKs家族特有的4个保守区域(可变区、蛋白激酶区、自抑制区和钙离子结合区),其二级结构主要由α螺旋(42.80%)和无规则卷曲(32.97%)构成;蛋白功能分类预测结果显示,ScCDPK1蛋白是一种阳离子通道蛋白,可能参与植物胁迫应答、信号转导和翻译调控等生物反应.[结论]ScCDPK1基因编码的蛋白与其他已知CDPK蛋白一致,具有CDPKs家族特有的4个保守区域,是一种阳离子通道蛋白.     

运用ABI PRISM 310型基因分析仪测定重组人蛋白激酶CK2 α和β亚基cDNA序列

目的：测定重组质粒中编码人蛋白激酶ＣＫ２α和β亚基ｃＤＮＡ序列，筛选含完全正确插入片段的重组质粒。方法：随机选择人蛋白激酶ＣＫ２α和β重组质粒各四个阳性克隆。使用二氯罗丹明荧光标记终止底物循环测序试剂盒，分别加入首尾正反或／和中段正反引物，运用ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０型基因分析仪进行ＤＮＡ测序。结果：在ＣＫ２α和β阳性克隆中各有两个含完全正确的插入片段的重组质粒，其他各两个重组质粒的插入片段中均存在至少一个碱基突变。２４个测序反应的平均精确度为（９８．７±０．４）％；Ｎ平均出现率为（１．４±０．４）％。结论：通过ＤＮＡ测序筛选到了含完全正确的人蛋白激酶ＣＫ２α和β亚基ｃＤＮＡ序列的重组质粒     

玉米大斑病菌NAD(H)激酶蛋白的鉴定及分析

NAD(H)激酶是NADP(H)从头合成途径的关键物质,对生物体的生长、发育具有重要作用。本研究以稻瘟病菌中3个NAD(H)激酶蛋白为查询序列,搜索玉米大斑病菌蛋白质组序列库,结果发现在玉米大班病菌中均有同源序列,分别为127652、103052和163223。利用生物信息学的方法对3个基因的结构进行分析,结果表明只有163223为断裂基因,包含5个外显子和4个内含子,127652和103052为单外显子;163223和103052呈现酸性,而127652则呈现碱性;103052为稳定蛋白,而另两者为不稳定蛋白;通过高级结构分析发现这3种蛋白在N端一侧α螺旋较多,C端一侧延伸链和β转角较多,并且这3种蛋白质有2个在结构和功能上的相似的结构域。     

人蛋白激酶CK2 3个亚基cDNA的克隆与测序

目的构建人蛋白激酶CK2 α、α′和β亚基cDNA重组表达质粒深入进行CK2结构与功能的研究.方法利用RT-PCR、定向克隆和DNA测序等进行本实验.结果通过反转录PCR从HL-60细胞中获得了人蛋白激酶CK2 α、α′和β亚基编码区cDNA,将Nde I /HindⅢ双酶切的3种PCR产物分别与同样双酶切的表达载体pT7-7进行定向连接.CaCl2法分别转化DH5 α获转化子,快速提取质粒DNA进行电泳初筛得到阳性克隆.限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符.每种CK2亚基都各随机挑选4个阳性克隆,PEG法进行纯化.采用PE ABI的Big Dye荧光标记的终止底物循环测序试剂盒,使用各种引物进行正反向DNA测序.通过测序分别在每种CK2 α、α′和β亚基的4个阳性克隆中筛选到2个、1个和2个含完全正确的人CK2 α、α′和β亚基cDAN的重组质粒克隆,其余的克隆均存在1～2个碱基突变.我们将这种含正确序列的重组质粒分别命名为pTCKA、pTCKA′和pTCKB.结论CK2全套3个亚基重组质粒克隆的成功,将为在原核细胞中表达人CK2 α、α′和β亚基以及利用人CK2 α、α′和β cDNA作为探针进行深入研究打下基础.