应用三重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡３种病毒性呼吸道传染病的研究

根据鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）和鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）的基因文库，设计了３对分别与ＮＤＶ、ＩＢＶ和ＩＬＴＶ某段基因序列互补的引物。用这３对引物对同一样品中的ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ核酸模板进行三重ＰＣＲ扩增，结果均同时得到了３条与设计相符的３１０bp（ＮＤＶ）、１７２０bp(ＩＢＶ）和６４７bp(ＩＬＴＶ）三重ＰＣＲ扩增带，而对其他６种禽病病原的ＰＣＲ扩增结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该三重ＰＣＲ技术能检出１０pg的ＩＢＶ、１pg的ＮＤＶ ＲＮＡ模板和１０pg的ＩＬＴＶ ＤＮＡ模板。     

采用二温式聚合酶链反应扩增鸡喉气管炎病毒TK基因的研究

建立了检测鸡喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）的二温式聚合酶链反应（二温式ＰＣＲ）,根据已报道的ＩＬＴＶ ＴＫ基因的序列,设计并合成了１对引物,用二温式ＰＣＲ对５株不同ＩＬＴＶ ＤＮＡ进行扩增。该对引物对５株ＩＬＴＶ ＤＮＡ均扩增出与预期大小相一致的６４７ｂｐ的扩增产物,而对新城疫病毒（ＮＤＶ）、传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）、禽沙门氏菌、鸡毒霉形体和禽巴氏杆菌等６种禽病病原体的扩增,     

应用多重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡新需疫病毒,鸡传染性支气管炎病毒,鸡

本文建立了一种同时检测ＤＮＶ、ＩＢＶ、和ＭＧ４种病原体的多重ＰＣＲ技术。根据ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ和ＭＧ的基因文库,设计了４对分别与ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ和ＭＧ某段基因序列互补的引物,用这４对引物对同一样品中的ＮＤＶ、ＩＢＶ、ＩＬＴＶ、ＭＧＲＶＡ和ＤＮＡ模板进行多重ＰＣＲ扩增,结果均同时得到了４条特异性大小与实验设计相符的３１０ｂｐ（ＮＤＶ）、１７２０ｂｐ（ＩＢＶ）、６４７ｂｐ（ＩＬＴＶ）和７３２ｂｐ（ＭＧ）多重ＰＣＲ扩增带,而对其他６种禽病病原的ＰＣＲ扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重ＰＣＲ技术难检出１０ｐｇ的ＩＢＶ、１ｂｇ的ＮＤＶ ＲＮＡ模板和ＩＬＴＶ、１ｐｇ的ＭＧ ＤＮＡ模板。     

用PCR检查鸡传染性喉气管炎病毒感染

以鸡传染性喉气管炎病毒的ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，扩增片段经电泳及酶切分析证明大小及ＥＣｏＲＩ位点的位置均与设计结果相符，可以确定为ＩＬＴＶ ＴＫ基因片段，用此法检测５只发病鸡的气管拭子，气管和血清样品，均扩增出ＩＬＴＶ ＴＫ基因特异－７１３ｂｐ片断，证实为ＩＬＴＶ感染，该方法敏感、特异、快速、是禽病病原诊断中一种很有发展前途的方法。     

鸡传染性喉气管炎病毒中国王岗株gX基因的克隆及鉴定

以ｐＵＣ１９质粒为载体克隆鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）中国王岗株的ＤＮＡ，构建了鸡传染性喉气管炎病毒ＤＮＡ的ＫｐｎⅠＤＮＡ文库。参考ＩＬＴＶ－ＳＡ２株ｇＸ基因的核酸序列，设计并合成了分别为１２ｂｐ和１３ｂｐ的１对引物。以ＩＬＴＶ中国王岗株ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ方法特异性地扩增出０．８４ｋｂ的ＩＬＴＶ－ｇＸ基因片段。以地高辛标记该０．８４ｋｂ的片段为探针，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交从ＩＬＴＶ中国王岗株ＫｐｎⅠＤＮＡ文库中筛选出３个含５．２ｋｂ外源ＩＬＴＶＤＮＡ片段的ｇＸ基因阳性重组子。经酶切分析、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、ＰＣＲ检测和该片段部分酶谱分析表明，ＩＬＴＶ中国王岗株ＤＮＡ５．２ｋｂ的ＫｐｎⅠ片段无论是片段大小还是酶切图谱均与ＩＬＴＶ－ＳＡ２株完全相同，而且Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＰＣＲ检测均为ｇＸ阳性，证明其中含有完整的ｇＸ基因     

牛传染性支气管炎病毒PCR诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）ｇＢ基因序列,应用ｏｌｉｇｏ４．１程序设计一对引物ＰＢ１／ＰＢ２,分别对ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行ＰＣＲ扩增。结果显示７株ＩＢＲ病毒ＤＮＡ均有３９９ｂｐ的特异性片段。用此引物对其同属的伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、马立克氏病毒（ＭＤＶ）、鸡传染必喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）进行扩增。均未见特异性条带,证     

应用多重反转录—聚合酶链反应检测鸡新城疫病毒和传染？…

本文建立了一种同时检测ＮＤＶ和ＩＢＶ二种病原体的多重ＰＣＲ。根据ＮＤＶ和ＩＢＶ的基因文库，设计了两对分别与ＮＤＶ与ＩＢＶ某段基因序列互补的引物，用这两对引物对同一样品ＮＤＶ和ＩＢＶＲＮＡ模板进行多重ＲＴ－ＣＰＲ扩增，结果均得到了两条特异性大步与实验设计相符的３１０ｂｐ和１７２０ｂｐ多重的ＲＴ－ＣＰＲ扩增带，而对其他６种禽病病原的ＰＣＲ扩增结果均为阴性，敏感性测定结果表明，该多重ＲＴ－ＰＣＲ技术能同     

鸡传染性喉气管炎病毒王岗株gC和gD基因的克隆及序列分析

根据已发表的传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＳＡ－２株的核酸序列,设计了１对引物,以ＩＬＴＶ－中国王岗株ＤＮＡ为模板,ＰＣＲ法扩增出１条１．３９ｋｂ的基因片段,将扩增产物插入到真核表达质粒ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＤ,另将克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ质料中的ｇＣ基因酶毁后,插入到ｐＣＲ＾ＴＭ３－Ｕｎｉ载体,得到重组质粒ｐＴＡ－ｇＣ,经电泳分析、酶分、ＰＣＲ鉴定后,进行序列测     

传染性法氏囊病RT-PCR诊断方法研究

本文在研究传染性法氏囊病病毒的Ａ片断ｃＤＮＡ结构的基础上,用Ｐｒｉｍｅｒ　 Ｄｅｓｉｇｎ引物设计软件,在ＶＰ_５和ＶＰ_２的重叠基因区设计了一对引物,使用该引物对６种ＩＢＤＶ的标准毒株,１０例自然发病病鸡组织标本,８例ＩＢＤＶ Ｊ_１Ｃ_７Ｆ_３种毒株攻毒病理法氏囊组织标本,进行了ＲＴ－ＰＣＲ检测均得到了阳性的扩增结果。２种参考鸡病病毒和８例健康鸡的法氏囊组织在同样条件下进行扩增均为阴性结果。本法具有扩增方法简单,对各种病毒株的适应性广,特异性高,检测成本较低的特点。     

用反转录—聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型标准毒株的ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７的序列,设计合成了一对引物２６３７４ ＰＳ／２６３７５ＰＲ,用反转录－聚合酶链反应技术对６株ＰＲＲＳＶ北京分离株进行了检测。结果该引物对６株病毒均能扩增出与预期大小相符的ＲＴ－ＰＣＲ产物,并与ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２株扩增产物的大小相当,而欧洲型标准毒株未获扩增片段。     

番鸭细小病毒与鹅细小病毒的PCR鉴别诊断

通过比较基因ｂａｎｋ中番鸭细小病毒（ＭＤＰＶ）和鹅细小病毒（ＧＰＶ）的全基因序列,针对两种病毒非结构蛋白基因序列的相同区段,分别设计了两对ＰＣＲ引物ＬＨＭＰ／ＬＨＭＰ２和ＬＨＧＰ１／ＬＨＧＰ２,用这两对引物分别对ＭＤＰＶ和ＧＰＶ进行检测,其结果引物ＬＨＭＰ１／ＬＨＭＰ２只特异性地扩增ＭＤＰＶ,而引物ＬＨＧＰ１／ＬＨＧＰ２也只特异性地扩增ＧＰＶ,并且两对引物均扩增出约７２０ｂｐ的长度序列。     

从疑似猪瘟病料中检出牛病毒性腹泻病毒

根据牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）ＮＡＤＬ株和猪瘟病毒（ＨＣＶ）Ａｌｆｏｒｔ株的核苷酸序列，设计合成了１对ＢＶＤＶ引物和３对ＨＣＶ引物。以从吉林、长春、哲盟３个地区经临床及病理学诊断为猪瘟的病料中提取的ＲＮＡ为模板，采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），分别以ＢＶＤＶ和ＨＣＶ引物进行扩增。结果，用ＢＶＤＶ引物从哲盟地区的疑似猪瘟病料中扩增出大小约４００ｂｐ的片段，而用３对ＨＣＶ引物在不同的条件下均未从该病料中扩增出相应大小的ＨＣＶ基因片段。此外，用ＨＣＶ的ＰＥ０／ＰＥ４引物从吉林、长春的病料中扩增出了ＨＣＶ的基因片段，但用ＢＶＤＶ引物从这两个地区的病料中均未扩增出ＢＶＤＶ的基因片段。从哲盟疑似猪瘟病料中扩增出的片段经克隆、序列测定及计算机分析证实，该片段的核苷酸序列和氨基酸序列与ＢＶＤＶ的同源性明显高于与ＨＣＶ的同源性。将哲盟病料接种于ＭＤＢＫ传代细胞，出现典型而规律的ＢＶＤＶ样细胞病变。由此证明，从哲盟疑似猪瘟病料中检测出的是ＢＶＤＶ而不是ＨＣＶ     

抗原捕获聚合酶链式反应检测鸡传染性喉气管炎病毒

用针对传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）不同抗原表位的４株单抗（ＭｃＡｂ），混合包被Ｅｐｐｅｎ－ｄｏｒｆ管，捕捉ＩＬＴＶ，同时加入包含ＩＬＴＶＴＫ基因的两个引物，建立了能检测ＩＬＴＶ的抗原捕获聚合酶链式反应，得到了与预计大小一致的１２６２ｂｐ的ＰＣＲ产物，用ＴＫ基因内部酶切位点ＥｃｏＲＩ进行酶切，得到了预计大小为５９５ｂｐ和６６７ｂｐ的两个片段，证明了ＰＣＲ的产物的特异性，该方法的建立为传染性喉气管炎的快速确诊打下了基础，对于传染性喉气管炎的防制具有重要意义     

中药“双炎散”对ILTV和IBV人工感染鸡防治试验

应用中药“双炎散”对人工感染ＩＬＴＶ和ＩＢＶ强毒的鸡进行防治试验，结果表明该药对两种鸡病的预防保护率均为１００％，对鸡传染性喉气管炎（ＩＬＴ）和鸡传染性支气管炎（ＩＢ）的治愈率分别为１００％和９２．３０％。     

用反转录聚合酶链反应检测禽呼肠孤病毒的研究

本文报告了建立反转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ）检测禽呼肠孤病毒（ Ａ Ｒ Ｖ）的方法,根据禽呼肠孤病毒 Ｓ１１３３ 毒株 Ｓ１ 基因序列,设计合成两对引物,用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 技术对 ６ 株禽呼肠孤病毒国际标准株进进行了检测。结果两对引物对 ６ 株 Ａ Ｒ Ｖ 均可扩增出与预期大小相符 ５３２ｂｐ 和 ４３５ｂｐ 的 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 产物,而对其它 ６ 种禽病病原核酸的扩增结果均为阴性;该 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 可以检测出 １ｐｇ 的 Ａ Ｒ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ 模板。     

猪繁殖—呼吸道综合征病毒（PRRSV）CH—1a株基因型鉴定

根据猪繁殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲型毒株和欧洲型毒株的基因组序列设计合成了２对引物,即１００８ＰＳ／１００９ＰＲ和１０１０ＰＬＳ／１０１１ＰＬＲ。我国分离的ＣＨ－１ａ株用这２对引物均能扩增出与预期大小相符的ＲＴ－ＰＣＲ产物,分别与美洲型代表株（ＶＲ－２３３２）的ＲＴ－ＰＣＲ产物大小相当。特异性试验表明,这２对引物均不能扩增其他常见的繁殖障碍相关病毒的ＲＮＡ或ＤＮＡ以及未感染的ＭＡＲＣ－１４５细胞ＲＮＡ。间接免疫荧光试验也证明,ＣＨ－１ａ株与ＰＲＲＳＶ核衣壳蛋白特异性单克隆抗体以及美洲型毒株抗血清均呈阳性反应。因此初步证实ＣＨ－１ａ株为美洲型ＰＲＲＳＶ。     

鸡传染性喉气管炎病毒单克隆抗体的建立及其应用

应用鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）作免疫原建立了８株分泌抗ＩＬＴＶ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株。这８株ＭｃＡｂ均具有荧光抗体的特性，没有中和病毒的能力，分别属于ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ３和ＩｇＭ，应用异硫氰酸荧光素标记ＭｃＡｂ，建立了直接荧光抗体试验，用其检测ＩＬＴＶ抗原与分离病毒的符合率为９２．８％。     

猪丹毒丝菌PCR检测方法的建立

根据Genbank中猪丹毒丝菌的16S rRNA基因序列的差异设计特异性引物,对6株临床分离的丹毒丝菌菌株进行PCR扩增.结果显示,此引物对6株丹毒丝茵均扩增出与预期大小472 bp相一致的片段,而对多杀性巴氏杆茵、大肠杆菌等10种病原体的扩增结果均为阴性;PCR敏感性试验结果表明,该方法可以检测到186 CFU/μL...     

兽用干扰素诱生剂对人工感染IBDV和ILTV的临床防治效果

应用兽用干扰素诱生剂对人工感染ＩＢＤＶ和ＩＬＴＶ的雏鸡进行了防治试验。结果表明，预防组无一发病；治疗组对ＩＢＤ、ＩＬＴ的治愈率分别为９６９％和９５８％，明显高于同类药物对照组和感染不投药对照组。提示该药对ＩＢＤ和ＩＬＴ具有较好的防治效果     

多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的建立

为了研究多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法,试验采用特异性引物对32个经鉴定为巴氏杆菌的菌株以及其他5种常见的病原菌进行了扩增。结果表明:该引物对巴氏杆菌的检出率达到91%,对其他5种病原菌的检测结果均为阴性。说明试验所设计的引物可用于巴氏杆菌感染的诊断。