玉米泛素结合酶基因家族的生物信息学及表达分析

[目的]利用生物信息学分析玉米泛素结合酶(E2)基因家族的理化性质和功能,并研究低磷处理下泛素E2基因在玉米幼苗不同组织部位的表达情况,为深入研究泛素E2基因响应低磷胁迫的分子机制提供理论参考.[方法]以MEGA 6.0邻接法(NJ)构建拟南芥、水稻和玉米E2基因家族成员的系统发育进化树,利用生物信息学方法对75个玉米E2基因进行序列分析及理化性质预测.对玉米幼苗进行低磷处理,分别在0、1、6和24 h时采集其根部和叶片样品,并分别通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其E2亚家族XVIII成员基因即ZmUBC17、ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和ZmUBC58在玉米幼苗不同组织中的表达情况.[结果]拟南芥、水稻和玉米的E2基因可划分为18个亚家族,各亚家族间基因功能和进化关系较相近,但含有的E2基因数量差异明显,以亚家族VI的成员最多,亚家族X、XII和XV的成员数最少,均为3个,各亚家族中均分别含拟南芥、水稻和玉米E2基因各1个.玉米E2基因的编码区序列(CDS)长度为402~2616 bp,编码133~871个氨基酸,外显子数目数量存在明显差异,以4~6个居多,最少为1个,最多为12个.86.8%的玉米E2蛋白为不稳定蛋白.玉米E2亚家族XVIII成员中,ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和ZmUBC58蛋白UBC结构域序列具有高度相似性,但与ZmUBC17存在明显差异,且这4个基因在玉米根和叶中均有表达,基因表达模式相似,整体上在低磷处理6 h时的表达量最高;低磷处理下ZmUBC17基因在根中不同时间点的表达量变幅较小,但在叶0~24 h时的表达量呈逐渐升高的变化趋势,尤其是24 h时表达量达最高,表明ZmUBC17基因的响应部位是叶片.[结论]玉米泛素E2蛋白可能参与调控对磷元素的吸收,尤其是ZmUBC17基因具有组织表达特异性,在叶片中大量表达,推测ZmUBC17基因通过调控玉米对磷元素吸收和转运间接影响光合作用效率.     

柽柳rd22基因的序列分析及耐盐性研究

【目的】验证从抗逆植物柽柳中克隆得到的rd22基因的耐盐能力。【方法】采用根癌农杆菌介导法,对烟草进行rd22基因的遗传转化,将分子检测为阳性的6个转基因烟草株系和非转基因对照烟草的组培苗进行盐胁迫(NaCl浓度分别设为0(CK),110,220和330 mmol/L)试验,通过观察相对电导率、SOD活性和相对生长量的变化,研究rd22基因的耐盐能力。【结果】生物信息学分析表明,来自柽柳的rd22基因属于BURP蛋白家族。分子检测证明,该rd22基因已整合到烟草基因组中,并在mRNA水平上有不同程度的表达。相对电导率和SOD活性分析表明,随着盐胁迫浓度的增加,各转基因烟草株系的相对电导率均呈上升趋势,且均小于对照烟草,在盐胁迫浓度达到330mmol/L时,非转基因对照烟草的相对电导率高达16.49%,而各转基因烟草的相对电导率最大为14.91%。各转基因烟草株系的SOD活性也随着盐胁迫浓度的增加均呈上升趋势,且均大于对照烟草,在盐胁迫浓度达到330 mmol/L时,转基因烟草SOD活性是对照烟草的1.10~1.39倍。相对生长量分析表明,盐胁迫浓度达到110,220,330mmol/L时,各转基因烟草株系相对生长量均高于对照株系,非转基因烟草的相对生长量分别为59.92%,36.99%和12.72%,转基因烟草的相对生长量平均为67.00%,44.05%和17.47%。【结论】rd22基因的导入,提高了转基因烟草的耐盐性。     

烟草泛素激活酶E1生物信息学分析

为从生物信息的角度研究烟草泛素激活酶E1,使用Sopma、Swiss model和Meme工具分析烟草泛素激活酶E1序列的二级结构、空间结构和保守基序。结果表明:烟草泛素激活酶E1的各成员中,以NtUAE2的α-螺旋含量最大,空间结构较为稳定;烟草泛素激活酶E1空间结构的主体结构具有3个分支,功能域位于其间,NtUAE1和NtUAE2空间结构模板为6dc6.2.A;NtUAE3的模板为3cmm.2.A;烟草泛素激活酶E1的保守基序中,Motif 3和Motif 4为泛素激活酶的催化半胱氨酸结构域。     

翻译起始因子(eIF1A)基因的获得及抗旱性分析

从柽柳cDNA文库中测序得到一条长度为631bp,编码113个氨基酸的全长cDNA基因序列,利用生物信息学软件对该基因进行分析,确定其属于eIF1A家族。采用农杆菌介导法进行烟草的遗传转化,通过分子检测证明eIF1A基因已经整合到烟草基因组中,并且在mRNA水平上得到不同程度的表达。对各转基因烟草及非转基因对照烟草进行旱胁迫处理,测定抗逆生理指标、生长量大小。结果证明,柽柳的eIF1A基因具有提高烟草的抗干旱能力。     

柽柳dir基因的克隆及序列分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了dir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长为724bp,其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸.基因编码蛋白的分子量为19·69kD,理论等电点为6·96·疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的.dir基因编码的蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因)和ABE73781(蛋白).     

烟草泛素激活酶E1蛋白序列的分析

采用SMART、TargetP和MrBayes工具对烟草泛素激活酶E1成员的结构域、亚细胞定位和进化树进行分析。结果显示,NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3均含有E1_FCCH、E1_4HB、UBA_e1_thiolCys、UBA_e1_C和ThiF结构域,且NtUAE2和NtUAE3含有信号肽;泛素激活酶E1各成员均定位于细胞质中发挥作用,其可靠性级别为1;烟草泛素激活酶E1的进化程度与葡萄、辣椒存在一定的差异。     

柽柳eIF1A基因耐重金属CdCl_2胁迫能力分析

通过实时荧光RT-PCR技术研究了CdCl2胁迫下不同时间点柽柳根、茎、叶中eIF1A基因的表达模式,结果表明:该基因受CdCl2胁迫诱导明显,可能参与柽柳的CdCl2胁迫应答。进一步对转柽柳eIF1A基因的T2代烟草进行CdCl2胁迫,测定各转基因株系及野生型烟草的MDA、POD、SOD、可溶性蛋白含量等各项抗逆生理指标,结果表明柽柳eIF1A基因具有提高烟草的耐CdCl2胁迫的能力。     

荔枝泛素结合酶基因(LcUBC12)的生物信息学及表达特性分析

[目的]分析荔枝泛素结合酶(E2)基因(LcUBC12)的生物学信息,并检测其组织表达特异性及烯效唑处理下花穗不同发育阶段中的表达情况,为研究E2响应烯效唑的作用机制及泛素化修饰在调控荔枝花穗发育中的功能提供理论依据.[方法]以从妃子笑荔枝花穗转录组(RNA-seq)数据中筛选出的LcUBC12基因为参考序列,利用本地BLAST从荔枝基因组中查找出该基因cDNA全长(Litchi_GLEAN_10004716),并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测LcUBC12基因在妃子笑荔枝不同组织及烯效唑处理下花穗不同发育阶段的表达情况.[结果]LcUBC12基因cDNA全长519 bp,编码172个氨基酸,其编码的蛋白分子量19.68 kD,等电点6.52,不稳定指数35.70,亲水性的平均值-0.734,为亲水稳定蛋白,定位于细胞核,不存在信号肽和跨膜结构,包含典型的UBC12保守结构域,属于Class I家族E2蛋白,二级结构以无规则卷曲为主.LcUBC12蛋白与向日葵(XP_022009656.1)、柑橘(XP_006466720.1)、草莓(XP_004300599.1)和萝卜(XP_018466680.1)等UBC12蛋白的氨基酸序列同源性较高,分别为70.11%、68.16%、67.76%和67.03%.LcUBC12蛋白与芸香科的柑橘UBC12亲缘关系最近,其次是与同属菊科的向日葵和莴苣UBC12蛋白亲缘关系较近.LcUBC12基因在不同组织中表达量排序为雌花>雄花>种子>果皮>叶>茎>根>果肉.烯效唑处理0~21 d LcUBC12基因在花穗中的表达量与对照无明显差异,烯效唑处理28 d其表达量明显低于对照,但烯效唑处理35 d其表达量上调,且较对照高.[结论]LcUBC12基因具有组织表达特异性,在妃子笑荔枝雌花、雄花和种子中高效表达,推测其主要在花穗发育和生殖生长过程中发挥重要调控作用,但烯效唑处理后LcUBC12基因对花穗发育发挥负调控作用.     

柽柳过氧化物酶基因的序列分析及山新杨遗传转化研究

对刚毛柽柳(Tamarix hispida)的过氧化物酶基因(ThPOD)全长序列进行分析,结果表明,该基因全长为1 376 bp,包含一个1 086 bp的开放阅读框,可编码361个氨基酸残基,蛋白分子质量为39.3 ku。根据ThPOD基因保守序列设计特异引物克隆该基因,并成功构建了pROKⅡ-ThPOD植物过表达载体,利用农杆菌介导法转化山新杨(Populus davidiana×P.bolleana),经PCR和Northern blot鉴定,初步证明外源基因ThPOD已整合到山新杨的基因组中并在转录水平上进行了表达。     

泛素结合酶RAD6的结构与功能研究进展

泛素复合体对蛋白的修饰可以改变蛋白定位、活性和稳定性.泛素结合酶E2在其中起关键作用.RAD6是典型的泛素结合酶,在泛素复合体组装、DNA损伤修复、调控基因表达和细胞周期等生理过程中具有重要作用.本文综述了RAD6蛋白的结构、与其互作的泛素蛋白连接酶E3及其功能研究进展,并展望其在作物研究中的应用.     

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及分析

应用生物信息学技术从柽柳cDNA文库中分离出了一种金属硫蛋白全长cDNA序列,去除PolyA后该基因全长517bp。其中,5′非翻译区31bp,3′非翻译区267bp,开放读码框(ORF)长219bp,编码72个氨基酸,含13个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈CXC形式排列,基因编码蛋白的分子量为7.1kD,等电点为4.71。疏水性分析表明,蛋白的30～50个氨基酸之间有较强的疏水性,经过Pfam15.0(St.Louis(USA))分析证明,为金属硫蛋白家族基因。金属硫蛋白基因参与了植物的发育、胚胎发生、抵抗逆境胁迫等多种生理过程,是一种重要的功能基因。此基因的Genbank登录号为AY620987(基因),AAT39518(蛋白)。     

柽柳、星星草金属硫蛋白基因双价植物表达载体的构建及其在烟草中的表达

将在柽柳(Tamarix and rossowii)和星星草(Puccinellia tenuiflora)cDNA文库中克隆到的金属硫蛋白基因PCR扩增后,连接到载体pROKII上,构建了分别由2×CaMV35S启动子调控的柽柳金属硫蛋白基因和星星草金属硫蛋白基因双价植物表达载体pRCXM,经PCR检测及酶切鉴定证实pRCXM构建成功。通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum Longjiang911),获得了抗卡那霉素的转基因植株。经初步检测结果显示,外源基因已整合进烟草基因组。重金属抗性结果证明:转基因烟草可以在CdCl2的浓度为300μmol/L的培养基中生长,而对照烟草只能在CdCl2的浓度为100μmol/L的培养基中生长。     

干旱与NaHCO3胁迫下柽柳基因表达的比较

用cDNA微阵列技术比较了NaHCO3及干旱胁迫下柽柳基因的表达异同。柽柳分别采用0.4mol/L的NaHCO3和干旱处理约30h后取材,分离总RNA,选用Cy3和Cy5进行标记,并与载有柽柳基因的cDNA微阵列杂交,比较了柽柳干旱胁迫的基因表达谱和NaHCO3胁迫的基因表达谱。结果显示,2种胁迫下,有14条基因共同下调表达,31条基因共同上调表达,说明柽柳的抗旱耐盐性状相似性较高。有1个基因在干旱胁迫下为上调表达,在NaHCO3胁迫下为下调表达。同时,和Lea蛋白、脱水诱导蛋白RD22同源的基因在干旱胁迫下表达量升高明显,但NaHCO3胁迫表达量上升不明显;NaHCO3胁迫使与SMDC基因和水通道蛋白同源的基因表达量明显上升,而干旱胁迫其表达量无明显升高,提示了柽柳的抗旱、耐盐性状也存在明显的差异。     

白花柽柳微小染色体维系蛋白3（TaMCM3）特异性识别 W-box 元件1）

真核生物翻译起始因子5A（eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A）是一个普遍存在于真核生物中高度保守的蛋白,参与多种生命活动。通过对已克隆得到的一个柽柳eIF5A基因（ TaeIF5A1）启动子分析发现,其-622～-627 bp区域存在W-box“CTGACT”元件,利用酵母单杂交技术筛选柽柳cDNA文库获得一个能够识别W-box的微小染色体维系蛋白3（minichromosome maintenance 3,MCM3）,命名为TaMCM3。进一步利用酵母单杂交验证发现,将W-box的核心序列“TGAC”中的“A”突变成“G”或者将“G”突变成“A”,TaMCM则不能识别这些序列,说明TaMCM3对W-box的识别具有特异性。 TaMCM能够结合含有W-box元件的TaeIF5A1启动子片段,但当W-box序列突变后则不能识别,说明TaMCM是通过与W-box相结合来与TaeIF5A1启动子相互作用的。研究表明,TaMCM能够特异性地识别W-box,并可能具有转录因子的功能。     

干旱胁迫下多枝柽柳正反向消减cDNA文库的构建

以干旱处理和生长在土壤水分充足的多枝柽柳的叶片为材料,利用抑制性消减杂交技术（SSH）成功地构建了干旱处理与对照之间的正反向消减cDNA文库。琼脂糖凝胶电泳分析表明,消减前后的PCR产物电泳谱带差异明显,说明消减成功。经检测,文库克隆的重组率为95％,插入片段多数集中在0．2～0．5kb之间。对正向文库邵分克隆进行测序发现,文库中含有Mn—SOD、钙调蛋白、钙依赖蛋白激酶、脱水诱导蛋白等大量的抗旱相关基因,说明干旱胁迫下多枝柽柳抑制性消减文库已经构建成功。     

柽柳THWRKY12基因的克隆及表达分析

[目的]克隆柽柳THWRKY12基因,并对其进行表达分析。[方法]分别用400 mmol/L NaCl溶液、20%PEG及100μmol/L ABA对柽柳幼苗进行胁迫处理后,用RT-PCR技术研究THWRKY12基因在各组织中的表达情况。[结果]在NaCl和PEG处理下,THWRKY12基因在柽柳幼苗各组织中表达总体呈上调趋势,表明该基因与柽柳的抗盐碱及抗旱过程有关;且ABA处理后THWRKY12基因的表达模式与前两者大致相同,表明该基因可能通过ABA调控的信号通路参与柽柳的抗盐碱及抗旱调控。[结论]该研究为研究WRKY基因在柽柳抗逆性中的作用奠定了基础。     

猪瘟病毒贵州株E2基因序列的分析

为研究猪瘟病毒贵州株变异情况及分子进化情况,对CSFV E2部分基因进行了扩增,应用分子克隆技术,将目的基因与pMD-18T克隆载体进行连接,转化至感受态大肠杆菌DH5α,经PCR与酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定,采用生物信息学软件对E2基因序列进行序列分析.结果,从疑似临床病料中扩增出与预期大小(508 bp)...