鸡原代输卵管上皮细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法,本研究分别对消化酶、消化时间、取材部位和表面包被物等条件进行比较和优化,筛选出鸡原代输卵管上皮细胞分离和纯化的最佳方法,并对培养细胞进行鉴定与传代。结果显示,取鸡输卵管漏斗部,0.25%胰酶+0.02%EDTA联合消化15min、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,在20%FBS包被的细胞培养瓶中可获得满意的输卵管上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好。培养的细胞在24h时成团贴壁,48~60h明显增殖,呈圆形或多角形"铺路石样"的单层细胞生长,72h后细胞增殖速度减慢,可以维持至10d以上,且传代后细胞贴壁生长良好,经姬姆萨染色和透射电镜观察鉴定为鸡输卵管上皮细胞。本研究建立的鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法可获得纯度较高的目的细胞,为研究鸭源鸡杆菌对鸡输卵管细胞的侵袭特性提供了良好的体外研究模型。     

鸡小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

选择组织块法分离培养鸡小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC),采用机械刮除法和相差消化－相差贴壁法纯化细胞,0.05%的Trypsin-EDTA对获得的IEC进行消化传代,免疫细胞化学法鉴定IEC。结果表明,组织块培养法可分离出活性较强的IEC,并获得纯化的上皮细胞;形态学和免疫细胞化学法检测显示获得的细胞表面抗原呈阳性,鉴定为IEC;纯化的IEC可在体外稳定传代。     

原代犬小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立原代犬小肠上皮细胞分离培养及纯化的方法,为犬肠道病毒性、细菌性及寄生虫相关疾病研究提供细胞材料。采用组织块培养法分离培养原代犬小肠上皮细胞,胰酶差速消化法进行纯化,利用细胞形态学、间接免疫荧光法鉴定上皮细胞特性,脂多糖(LPS)刺激原代上皮细胞,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测炎性因子转录水平,鉴定原代犬小肠上皮细胞的功能。结果显示：组织块培养法获得的原代犬小肠上皮细胞可在24 h内贴壁,第3天细胞开始增殖,第4天时达到增殖顶峰,第5～7天细胞活性逐渐降低,在体外连续传代可培养至第10代。经胰蛋白酶差速消化纯化后,获得铺路石样原代犬小肠上皮细胞,生长曲线类似“S”形,上皮细胞特异性细胞角蛋白18 (CK18)鉴定呈阳性,LPS可诱导犬小肠原代上皮细胞炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的转录水平在12 h(P<0.05)、24 h(P<0.01)表达量呈显著和极显著差异。研究表明,利用组织块培养法可成功分离获得数量较多、纯度较高且具有典型上皮细胞形态和功能的犬小肠上皮细...     

组织块法培养鸡胚肠黏膜上皮细胞

本试验采用组织块方法原代培养鸡胚肠黏膜上皮细胞,倒置显微镜下细胞呈圆形,透明状,成功培养原代鸡胚肠黏膜上皮细胞。试验表明,组织块法可用于鸡胚肠黏膜上皮细胞的原代培养,具有简便易行、培养周期短、纯度高等优点,是肠道疾病良好的体外研究模型。     

鹅小肠上皮细胞的分离培养研究

取29～30胚龄的鹅胚为试验材料,通过组织块种植法和酶消化法进行原代鹅小肠上皮的体外培养,采用刮除法、相差消化及相差贴壁法对上皮细胞进行纯化,用0.05%Trypsin-EDTA进行消化传代,通过形态学观察及免疫细胞化学法进行鉴定.结果表明:组织块种植法得到的鹅小肠上皮细胞生长状况良好,细胞活性较强,经过纯化,得到了纯度较高的鹅小肠上皮细胞.而联合使用浓度为300 U/mL的胶原酶(Ⅺ型)和0.1 mg/mL的中性蛋白酶(Ⅰ型)、多次(短时间)消化收获细胞法虽然可获得大量的健全肠绒毛隐窝单位,但传代后其增殖能力明显下降;形态学观察及免疫细胞化学法鉴定为阳性,证明分离出的细胞为小肠上皮细胞,从而为小肠上皮细胞的进一步研究奠定了基础.     

小肠上皮细胞的培养及在动物营养上的研究进展

小肠是动物消化吸收的主要场所,体外分离培养小肠黏膜上皮细胞(intestinal epithelial-cells,IEC)为研究小肠消化吸收、物质转运及肠道免疫等生物学功能提供了重要手段,文章综述了体外培养小肠上皮细胞的有关方法及鉴定,简要介绍了小肠上皮细胞培养在动物研究中的应用概况。     

新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定

为更快捷地进行猪肠道病毒性、细菌性疾病及细胞永生化的研究提供便利,本研究使用多种酶消化法及其他培养法尝试分离培养肠上皮细胞.结果,利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠上皮细胞株,获得的上皮细胞具有较强的增殖能力,22 h内贴壁并发生细胞分裂,6～7 d明显增殖,10～12d汇合成单层.连续传代培养至12代,细胞基本失去上皮样特征.倒置显微镜下观察,10代前培养细胞为多角状或卵圆形,单层生长不重叠,呈铺路石状排列,11～12代细胞发生变形,间隙增大.细胞角蛋白18鉴定二者均为阳性.电镜下,纹状缘整齐,紧密连接结构清晰可见.结果表明利用组织块培养法可以获得能够连续传代、活力较好的猪小肠上皮细胞.     

鸡小肠上皮细胞分离培养及NLRP3在该细胞中的表达

为了探明NLRP3在鸡小肠上皮细胞中表达情况,为鸡的NLRP3基因在小肠细胞中的功能研究奠定基础。采用18胚龄的鸡胚,分离培养鸡的小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC);采用免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)和反转录PCR(RT-PCR)方法,检测NLRP3基因在鸡小肠上皮细胞中的表达。结果表明:分离培养出活性较强的IEC;ICC检测显示获得的小肠上皮细胞表面NLRP3抗原阳性,RT-PCR法可扩增出520 bp的目的片段。表明成功分离培养出鸡小肠上皮细胞,并证明鸡NLRP3在鸡小肠上皮细胞中表达。     

鸡肠上皮细胞的分离及原代培养方法

取18日龄鸡胚，研究鸡肠上皮细胞（IEC）分离及原代培养的方法。结果表明：较好的分离条件是肠组织经0.1g／L中性蛋白酶和300U／mL胶原酶Ⅺ联合消化；较佳的培养条件是细胞在含2．5％～5％胎牛血清的DMEM培养基中，39℃、5％～7．5％CO2下培养，IEC可在1～2d贴壁，6～7d明显增殖，11～12d汇合成片。     

猪小肠粘膜上皮细胞的分离及体外原代培养模型的建立

用机械刮取小肠粘膜加胶原酶Ⅱ消化的方法,采用新生未吮乳仔猪小肠组织,成功地分离了猪小肠粘膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC)且在体外培养传代,并采用碱性磷酸酶和角蛋白免疫学试验鉴定,结果表明:体外培养的猪IEC在DMEM-F12培养基中,细胞在1~2d贴壁,5~6d形成细胞克隆,9~11d融合成片;碱性磷酸酶和生物素标记的细胞角蛋白抗体鉴定结果显示90%培养的细胞为阳性,分别从生化的角度证明和细胞生物学角度鉴定了所培养的细胞为IEC。     

小肠上皮细胞分离纯化方法的研究进展

小肠是消化吸收的重要部位,用获取的小肠上皮细胞来研究小肠功能、营养物质吸收机制等具有重要意义,而成功分离小肠上皮细胞则是前提,可以用组织块培养法、非酶学消化法、酶消化分离法等来分离小肠上皮细胞。本文就目前国内外分离小肠上皮细胞的方法进行了综述。     

鸡胚盲肠上皮细胞原代培养与鉴定

为研究鸡E.tenella的宿主细胞--盲肠上皮细胞体外培养技术,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型,分别用胰蛋白酶法、胶原酶Ⅰ法、嗜热菌蛋白酶法、嗜热菌蛋白酶+胶原酶Ⅰ法和中性蛋白酶Ⅰ+胶原酶Ⅺ法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定细胞活力、细胞团块比例、总细胞产量和细胞团块产量,筛选出鸡胚盲肠上皮细胞最佳分离方法,并进行了纯化和培养,对培养细胞进行了鉴定.结果表明:嗜热菌蛋白酶消化、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,为最佳分离和纯化盲肠上皮细胞的方法;分离纯化的细胞接种后分别于第3-5天、第10-11天进入对数生长期,可存活14 d以上;经形态学观察、碱性磷酸酶染色、扫描电镜鉴定为盲肠上皮细胞,所分离的细胞培养至第4、7、11天时上皮细胞比例分别为81.67%、84.33%和72.00%.用该法可获得纯度较高的原代鸡胚盲肠上皮细胞.     

哺乳动物乳腺上皮细胞体外培养研究进展

由于具有合成和分泌乳汁的特殊生理功能,哺乳动物乳腺上皮细胞是进行乳腺生物反应器研究的重要细胞模型。用乳腺上皮细胞建立的模型,能真实反映哺乳动物乳腺生长发育及泌乳的各项生物学机制,验证乳腺特异性表达载体的构建是否合理有效,涉及到细胞生物学、发育生物学、内分泌学、生物化学与分子生物学等多个领域,对于乳腺生物反应器、乳蛋白基因表达的研究有重要意义。作者主要从培养方法方面介绍了近年来哺乳动物乳腺上皮细胞体外培养方法。     

鸡精原细胞分离纯化与体外培养初探

本研究以组合酶分步消化法并利用Percoll梯度分离、贴壁纯化的方法，从不同时期的鸡睾丸组织中分离精原细胞。结果发现：①Percoll分离后，出壳6d雏鸡获得的细胞总数、精原细胞总数、精原细胞纯度分别为282．1、174．6、61．9％，其中精原细胞纯度比孵化15d、19d鸡胚和出壳后13d雏鸡分别高10．2％、5．7％和2．5％；②贴壁纯化后精原细胞纯度达到82％，比未经贴壁纯化的精原细胞纯度高出15．6％；③在无饲养层培养条件下，比较Percoll梯度分离前、后鸡精原细胞体外培养的情况，Percoll梯度分离前精原细胞贴壁在时间上比分离后较快，且分离前精原细胞体外存活时间亦比分离后长。     

小鼠小肠上皮细胞的分离培养研究

通过组织块培养法进行胎鼠原代细胞培养,采用刮除法和相差消化及相差贴壁法对细胞进行纯化,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代对小鼠小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定。结果表明:组织块培养法得到了小鼠生长状况良好的细胞,经过纯化,得到了较纯的小肠上皮细胞;形态学观察和免疫组化检测显示得到的细胞为小鼠上皮细胞。用组织块培养可以分离纯化出增殖能力较强的上皮细胞,并能进行传代纯化,通过免疫组化鉴定,证明分离出的小鼠IEC为阳性,即为小肠上皮细胞。     

新生牛生精上皮细胞体外培养的研究

两步酶消化法制备新生牛生精上皮细胞悬液,分离纯化、鉴定精原干细胞和支持细胞,冷冻保存支持细胞。以支持细胞为饲养层探索不同培养条件下精原干细胞的增殖情况,免疫组化鉴定。结果表明:10%DMSO与0.1mol/L的海藻糖组合作为冷冻保护剂,冷冻效果较好;血清浓度为2.5%、支持细胞密度为5×105个/mL时,新生牛精原干细胞较易形成集落;精原干细胞及其集落的AKP染色和C-kit免疫组化均呈阳性。     

鸡胚血液中PGCs的分离及原代培养

在鸡胚孵化48,50,54,56,60h的不同时期，分离血液中原始生殖细胞（PGCs)，分离前的浓度分别为0.011%,0.007%,0.006%,0.006%,0.004%,0.001%,分离后的浓度分别为0.245,1.21%,1.02%,0.64%,0.27%,孵化48－54h，血液中PGCs浓度差异不显著，但孵化48h的鸡胚液较少，PGCs绝对量较低。孵化52－54h的鸡胚血液量较大，获取PGCs的绝对值较高，故分离PGCs的时间以孵化52－54h为宜，鸡胚血液中PGCs在未中任何外源生长因子而含10％FCS的TCM－199培养基中体外培养，能够存活3－4d。     

哺乳动物肠上皮细胞的原代培养

肠上皮细胞是由多功能干细胞分化成的一个高度组织化系统.从离体的肠组织中分离的肠隐窝单位或肠上皮细胞可在数小时内保持高度活力,但要长期(达到10 d)原代培养肠上皮细胞仍然很困难.文章对肠上皮细胞的分离、鉴定、原代培养所需维持培养基和生长培养基的设计及培养条件等方面进行了综述.     

Isolation,Culture and Identification of Testis Sertoli Cells in Mongolian Horses in vitro

To study a simple and rapid separation of testis Sertoli cells in Mongolian horses and ensure their activity,the testis tissue of two-year-old Mongolian horses was mechanically isolated under a low temperature environment in this experiment,and 1-3 g of testis tissue was chopped,the free red blood cells and interstitial cells were removed by gravity precipitation method.0.1% collagenase Ⅳ and 0.25% trypsin-EDTA were used for tissue digestion, and cells were cultured in medium containing 10% fetal bovine serum.After inoculation,the purified Sertoli cells were isolated and purified by differential sticking method,and the impurity cells were removed by Tris-HCl infiltration method,and were identified by alkaline phosphatase (AKP) staining,HE staining and Real-time quantitative PCR.The results showed that most of the cells began to adhere to the wall after culture 24 h,and the shape of the cells was oval.After culture 48 h,the cytoplasm increased and the refraction became stronger.After culture 3-4 d,the cytoplasm of the cells expanded into tight junction.At this time,the cells were triangular with obvious nucleoli.After culture 6-7 d,the cells entered the stable phase.Real-time quantitative PCR results showed that the expression of GATA4 and GDNF genes were extremely significantly expressed in cultured cells (P<0.01).AKP staining supported the negative expression in Sertoli cells,indicating that the isolated cultured cells were indeed Sertoli cells.In this experiment,tissue was treated by mechanical separation and two-step enzyme digestion,and testicular support cells were obtained quickly and efficiently,the method of culturing Sertoli cells in Mongolian horses testis in vitro was successfully constructed.