内生解淀粉芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的克隆与表达及酶学特性分析

β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶普遍存在于植物内生芽胞杆菌中,为了探讨其功能,以内生解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TB2菌株基因组为模板,克隆了β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因(bglS).测序结果表明,该基因的ORF全长732 bp,编码一条243个氨基酸的蛋白,理论分子量约为27.33 kD,等电点约为6.89,其ORF序列已登录GenBank(Accession No.EU368224).Blast同源性分析结果表明,该基因的ORF序列与植物互作生防解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens FZB42,GenBank Accession No.CP000560)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因核苷酸序列的一致性达97.3%,氨基酸序列的一致性达97.1%.将β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因全长克隆至pUC18载体上,利用基因自身的启动子构建重组表达载体pUC-bglS,并导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达.SDS-PAGE分析表明,BL21::pUC-bglS菌株表达了27 kD左右的蛋白;该酶的最适反应温度为55℃,在50℃以下保温60 min后残余80%以上酶活;最适反应pH为6.2,在pH4.4～6.8 4℃保温30 min残余85%以上的酶活;Ca2+和Fe肛可提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性,而Cu2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+对其活性具有显著的抑制作用.实验结果为进一步研究植物内生解淀粉芽胞杆菌TB2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能和应用打下了基础.     

地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)基因组，通过PCR克隆了该菌的β-1，3-1，4．葡聚糖酶基因全长。该基因全长818bp,ORF为732bp,编码243个氨基酸，计算分子量为27.35kD，等电点为8．31。经Blast分析，该序列与短小芽孢杆菌(B．pumilus)同源性最高(99％)，而与基因库中地衣芽孢杆菌的同源性为94％，该基因已被GenBank接受(AY225317)。用BamHI和XhoⅠ双酶切目的片断和表达载体pET-30a( )后相连接，构建重组表达载体pET-lic，并导人大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达。酶学特性表明：SDS-PAGE电泳在27kD左右有表达蛋白带，该工程菌总酶活达67．34U／mL，是出发菌的60倍，最适温度在50℃左右，最适pH在5～6之间。该工程菌可作为材料构建耐热性好和酶活高的杂合基因工程菌。     

木霉β—1，3—1，4—葡聚糖酶性质及其cDNA片段克隆

本研究探讨了里氏木霉GXC的-1,3-1,4-葡聚糖酶特性，克隆和分析了酶基因片段。结果表明，粗酶液经硫酸铵沉淀、SephadexG-25、SephadexG-100和DEAE-SephadexA-50柱层析得到纯-1,3-1,4-葡聚糖酶；经12.5%SDS-PAGE凝胶电泳表明，该酶的分子量为35.21kD；酶最适反应pH5.0，最适反应温度为60℃；Michaelis-Menten动力学分析表明，-1,3-1,4-葡聚糖酶的Km和Vmax分别为10.86mg/mL和14286mol/(minmg)。通过RT-PCR方法扩增并克隆了-1,3-1,4-葡聚糖酶cDNA片段，测序表明,该片段长度为280bp；同源性分析显示，该cDNA片段与水解淀粉芽孢杆菌、厌氧真菌OrpinomycesstrainPC-2、枯草芽孢杆菌中的-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因片段有较高的同源性，分别为90%，79%，91%。     

不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

以不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)抗病自交系雪克青为实验材料,通过RACE技术,获得了不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA全长序列。序列分析发现,该基因全长1275bp,编码363个氨基酸,分子量40.66kD,等电点(pI)9.27。推导的氨基酸序列与芜菁bg1基因具有96%的同源性,与拟南芥bg2基因具有61%的同源性,与其它植物β-1,3-葡聚糖酶基因的同源性为49%￣57%。将该序列提交GenBank,登录号为AY836001。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于1个。半定量RT-PCR分析表明,该基因有低水平的组成型表达,在霜霉病菌(Peronosporaparasitica)诱导后24h其表达量达到高峰。     

土壤总DNA中草甘膦N-乙酰转移酶基因的克隆及酶学特性分析

实验通过PCR程序从提取的土壤总DNA中扩增出草甘膦N-乙酰转移酶基因(gat),酶解后插入大肠杆菌(Es-cherichia coli)表达载体pGEX-6p-1,获得克隆株。基因测序表明,与GenBank中的AX543338核苷酸序列有99.3%的同源性。将GAT经亲和层析纯化后,对该酶的酶学性质进行了初步分析,结果表明,该酶的最适温度为30℃,最适反应pH7。检测了6种金属离子对酶活性的影响,发现单价离子K 和Na 对GAT的激活作用高于双价离子Mg2 和Mn2 ,其中Na 的激活作用最强,而Ca2 有明显的抑制作用。     

源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的xynA在毕赤酵母中的高效表达及其酶学性质分析

β-D-1,4-内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanase,xynA,EC.3.2.1.8)简称β-木聚糖酶(β-xylanase),是木聚糖降解酶系中最重要的成员,广泛用于饲料、食品、造纸和生物能源等领域.厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 xynA具有潜在的开发价值,但是其异源表达的活性较低.本研究根据毕赤酵母(Pichia pastoris)对基因密码子偏好性,对厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的xynA进行密码子优化.通过全基因合成技术合成优化后的xynAm,并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点,构建重组质粒pPIC9K-xynAm,电击转化至毕赤酵母GS115菌株中,以29℃、0.5％甲醇诱导表达,获得重组xynA,并对该酶的酶学特性进行了研究.结果表明,在摇瓶水平条件下,诱导表达108 h时重组β-木聚糖酶活性达到最大值,为612 IU/mL.在10L发酵罐中诱导表达96 h后,xynA的活性为3 515 IU/mL,比活性为2 411 IU/mg;菌体培养湿重、干重和培养上清总蛋白质的浓度分别为324、156和2.25 g/L.非变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)凝胶电泳显示,重组木聚糖酶的分子量约为42.7 kD.酶学性质分析表明,重组β-木聚糖酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH 6.0,在温度为30～50℃、pH 4.0～10.6之间该酶具有较好的稳定性,其Km=27.86 mg/mL,Vmax=277.78 mg/(mL· min).底物特异性分析表明,重组xynA可水解低粘度阿拉伯木聚糖、高粘度阿拉伯木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖,但不降解大麦(Hordeum vulgare)β-葡聚糖和地衣多糖.10 mmol/L的Co2+和K+对该酶的活性略有激活作用,Mn2+、Fe2+和SDS对该酶活性有一定的抑制作用.本研究为进一步工业化应用来源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的β-内切木聚糖酶奠定了基础.     

基于易错PCR技术的中性内切葡聚糖酶基因的定向进化

纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制,为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,本研究利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis )C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,在酶分子水平上改造内切葡聚糖酶分子.实验获得了最佳突变株b-15和b-28,其内切葡聚糖酶活力比亲本酶分别提高了2.1和3.6倍.序列分析表明:突变体b-15有6个碱基发生了突变,分别是A360G、T402A、A419T、T648A、A1208G和A1397T,导致4个氨基酸突变,分别是N134K、Q140L、N403S和Q466L;b-28只有1个碱基发生了突变,导致了398位Lys突变为Arg.通过SWISS-MODEL服务器模拟酶的三维结构,分析表明,b-15改变的4个氨基酸分别位于催化结构域的第4和第5个α螺旋之间的转角和结合结构域的第5个β折叠及第9和第10个β折叠之间的转角;b-28的突变位于结合结构域的第4个β折叠.同时,对获得的两株突变株b-15和b-28用正交试验优化产酶条件,优化后的酶活分别达到4.542和5.136 U/mL,是优化前的2.2和1.5倍.实验获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料.     

产β-葡萄糖苷酶的菌种的筛选,鉴定及其酶学特性

β-葡萄糖苷酶来源广泛,几乎存在于所有的生物体中,而不同来源的β-葡萄糖苷酶其性质也各不同。本文利用七叶苷分离培养基从土样中分离筛选出产6种β-葡萄糖苷酶时间较快的菌种,其中发现菌种WGEA1酶活性较高,随后对菌种WGEA1进行初步的鉴定并且采用DNS法测该菌株所产粗酶液的酶学特性。酶学特性表明,WGEA1产的β-葡萄糖苷酶最适温度是在50～55℃之间,最适pH在6～7之间;在低于50℃条件下,pH为5～8时,酶活较稳定,同时在最适反应时间30min下,金属离子和有机溶剂都对酶活性影响很大,这些发现都为在非水相体系中酶法合成烷基糖苷奠定了一定的基础。     

β-葡聚糖酶的热稳定性改造及酶学性质分析

为了获得热稳定性有所提高的β-葡聚糖酶，本研究利用定向进化技术对β-葡聚糖酶基因进行改造，并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。结果获得了两株热稳定性有所提高的突变体，分别命名为EGs1和EGs2；酶学性质分析结果显示：与野生酶相比，EGs1和EGs2突变酶的Tm值分别提高了3℃和5℃，达到了65.5℃和67.5℃；突变酶的最适反应温度也提高了5℃，达到了60℃；两个突变酶对地衣多糖的水解能力分别被提高28％和降低21.6％；对地衣多糖的亲和力未见改变；野生酶和EGs1突变酶的最适pH值为6.5，而EGs2突变酶的最适pH值为7.0；野生型和突变型-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围，在pH 6.0-8.5的范围内放置48小时，仍保持80％以上的酶活力；遗传稳定性检验结果表明突变株的遗传稳定性良好。这一结果说明了定向进化在改善酶性质方面是比较有效的策略。     

一个新的内切葡聚糖酶基因umcel5K的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

从水牛瘤胃内容物的添加滤纸为碳源的富集培养物中提取未培养微生物的总DNA,以柯斯质粒为载体构建了1个含约8000个克隆的宏基因组文库,对文库进行活性筛选获得1个既表达CMCase活性又表达4-MUCase酶活性的克隆。亚克隆及测序分析发现1个潜在的可编码333个氨基酸的ORF(Open Reading Frame),其蛋白质产物与1个来源于未培养细菌的糖苷水解酶家族5的纤维素酶Cel A的同源性最高,两者的一致性为53%,相似性为68%。将PCR扩增的该基因完整的ORF克隆入表达载体pET30a(+),在大肠杆菌中得到其过量表达产物。经过Ni-NTA纯化后,该表达产物(Umcel5K)具有CMCase活性和4-MUCase酶活性,其最适pH是4.5~5.0,最适温度是50°C。pH耐受性检测表明,该酶在pH4~4.5比较稳定。温度耐受性实验表明该酶不耐高温,在55°C以下比较稳定。经过镍柱纯化的酶液比活为26.15 U/mg。部分金属离子如Fe3+、Cr2+或Cu2+会抑制该酶的酶活,而另外一些金属离子如K+、Li+等对Umcel5K的活性影响不大。     

绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因的定点突变及酶学性质的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅠ基因eg1亚克隆到表达载体pSE380,构建出重组质粒pSE380-eg1,转化到大肠杆菌JM109中表达,利用金属亲和层析对EGI进行纯化,纯化后的酶比活力达到3.8U/mg,其最适反应温度为48℃,最适pH为5.2。同时对EGⅠ的氨基酸残基G291位进行随机定点突变,筛选到一株突变酶G291S,其比活力为野生酶的2.2倍,Km值为野生酶的0.66倍,最适反应温度和最适反应pH值未发生改变。     

嗜麦芽窄食单胞菌角蛋白酶基因(KerF)的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为研究嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)降解羽毛的机理,本研究克隆了嗜麦芽窄食单胞菌角蛋白酶基因(KerF),并获得其全长基因序列1981 bp,含有1个1743 bp的开放阅读框,编码580个氨基酸(GeneBank登陆号HM590650),将角蛋白酶KerF基因连入表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28-KerF并转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),获得重组工程菌.采用金属Ni+螯和层析柱对所表达的角蛋白酶进行纯化,获得分子量为50 kD的重组角蛋白酶KerF.该酶的最适温度为50℃,最适pH值为9.0.金属离子Mn2+、Co2+、Mg2+、Ni+、Ba2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+及蛋白酶抑制剂二苯基甲基磺酰氟(PFSM)能强烈抑制该酶活性,乙胺四乙酸(EDTA)对该酶活具有促进作用.本研究结果表明,嗜麦芽窄单胞菌角蛋白酶基因在大肠杆菌中获得成功表达,重组角蛋白酶KerF为碱性丝氨酸蛋白酶.     

热稳定性β-葡聚糖酶菌种选育及产酶特性

从土壤中筛选到一株热稳定性β－1，3－1，4－葡聚糖产生菌ZJF－1，发酵60h酶活性为64U／mL，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)。紫外线和硫酸二己酯复合诱变，获得的突变株ZJF－1A5发酵60h酶活性达154．7U／mL，是出发菌株酶活性的2．42倍，对B.subtilis ZJF-1A5产酶特性的研究发现：大麦粉，糊精，可溶性淀粉等糖有利于β－1，3－1，4－葡聚糖酶的产生，葡萄糖，麦芽糖等单糖和双糖不利于菌体生长和产酶。B.subtilis ZJF-1A5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的产生与菌体生长部分相关，在细胞进入对数生长后期至稳定期，酶活性显著增加，且β－葡聚糖酶活性与菌体生物量密切相关，B.subtilis ZJF-1A5 α－淀粉酶的产生也与生长部分相关，细胞进入对数生长期，α－淀粉酶开始大量产生，而中性蛋白酶的产生与菌体生长同步。     

嗜水气单胞菌丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及酶学分析

以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）基因组DNA为模板,通过PCR方法首次克隆了该菌的丝氨酸羟甲基转移酶基因（glyA）。将该基因插入到表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α,获得含有重组质粒pGEX-glyA的重组菌株。核苷酸序列测定表明该基因（GenBank登录号：FJ797607）全长1254bp,编码417个氨基酸。重组菌株IPTG诱导表达后,经过GST-tag亲和层析纯化,得到约45kD的目的蛋白。对纯化的丝氨酸羟甲基转移酶进行酶学性质分析表明,该酶的最适反应为pH8.0,最适反应温度为20℃,Cu^2＋和Mn^2＋对该酶有激活作用,而Zn2＋和SDS对该酶有抑制作用。由于该酶的最适反应温度是20℃,使得它在工业上具有一定的应用价值,同时有助于对低温酶机制的研究。     

巴斯德毕赤酵母新型分泌表达载体构建

巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPICINU是利用来源于克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)的菊粉酶基因信号肽DNA序列（ISP）构建的。表达实验结果表明，带有分泌表达载体pPICINU的β-1，3－1，4葡聚糖酶基因重组菌，具有与带有表达载体pPIC9K(带有α因子信号肽）的β-1，3－1，4葡聚糖酶基因重组菌相同的分泌效率。     

基因工程菌EGs2产β-葡聚糖酶条件优化及产酶特性

摘要：用乳清粉作为主要培养基组成，采用正交试验对重组菌EGs2的发酵条件进行了优化，并对粗酶液的酶学性质进行了研究。重组菌EGs2的最佳发酵条件为：摇床转速170 r•min-1，接种量1 ％，发酵培养基初始pH值6.0，种龄12 h。重组菌EGs2β－葡聚糖酶的表达与菌体生长呈正相关，发酵14h后，菌体生物量最高可达1.71 g•L -1，β－葡聚糖酶活力最高可达321.56 U•ml-1。所得粗酶液的最适反应温度和pH值分别为60 ℃和6.0，在70 ℃以下保温20 min后，残余酶活力均在80 %以上。在pH 5.0-9.0 放置48 h后仍能保持均90 %以上的残余酶活力。     

硅对水稻几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的影响及其与抗纹枯病的关系

在溶液培养条件下,以水稻抗病品种91SP和感病品种Lemont为材料,研究施硅和接种纹枯病菌对水稻纹枯病发生情况、外切几丁质酶、内切几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的影响。结果表明,施硅能降低抗病品种91SP的纹枯病病级和病情指数,显著降低感病品种Lemont的病级和病情指数。在未接种纹枯病菌条件下,施硅增加了抗病品种几丁质酶活性,增加了感病品种的几丁质酶活性,但对β-1,3-葡聚糖酶活性影响不大。接种纹枯病菌后,水稻几丁质酶活性被迅速激活后又下降,施硅通过提高抗病品种91SP几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,以及通过提高感病品种Lemont几丁质酶活性来增强对纹枯病的抗性,但感病品种Lemont施硅处理的几丁质酶活性降低幅度小于抗病品种91SP。     

草酸青霉外切葡聚糖酶基因(cbh1)克隆及其在毕赤酵母中的表达和重组外切葡聚糖酶特性分析

木霉的纤维素酶系中通常缺少β-葡萄糖苷酶,导致了终产物抑制,木霉生长速度明显没有青霉快,因此,来源于青霉的纤维素酶受到了越来越多的重视.通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术从草酸青霉(Penicillium oxalicum)M菌株中克隆得到外切葡聚糖酶基因cbh1(GenBank登录号:HQ843504).该基因全长为1 641 bp,无内含子序列,编码547个氨基酸,具有Glu236,Asp238和Glu241典型催化残基,推测属于糖基水解酶第7家族.将cbh1克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建重组表达质粒pPIC9-cbh1,电击转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS 115菌株.阳性重组子经测序及活性分析表明,cbh1基因成功分泌表达,表明来源于草酸青霉的外切葡聚糖酶基因首次在毕赤酵母中获得成功表达.重组酶活性分析表明,其活性可达56IU/mg,最适反应pH、温度分别为6.0和55℃,且pH和温度稳定性均较好.研究结果认为,cbh1基因的克隆丰富了纤维素酶的基因资源,其在毕赤酵母中的成功表达也为该类纤维素酶基因高效工程菌株的构建提供了基础.     

融合基因umcel5N-CBM的构建、表达及融合酶性质分析

碳水化合物结合组件（carbohydrate—binding module,CBM）是一些糖基水解酶分子上的结构域,它在纤维素酶降解不可溶纤维素中起着重要的作用。本研究的目的是检测一个新的内切葡聚糖酶Umcel5N（GenBank登录号为ACH67609）加上一个碳水化合物结合组件后得到的融合酶是否获得降解结晶纤维素的能力。本文将编码内切葡聚糖酶Umcel5N的催化结构域（catalytic工能力domain,CD）的序列与编码Umcel6A的CBM序列通过接头序列进行基因融合,得到融合基因umCel5N-CBM,并实现了融合基因在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中的表达。研究结果表明,融合酶Umcel5N-CBM与结晶纤维素（avicel）以及滤纸粉末的结合能力比原始酶Umcel5N提高了约一倍,但未显示出降解结晶纤维素的新活性,说明在结晶纤维素的降解过程中,纤维素酶的催化功能域起到关键作用。     

内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达研究

在实现了内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达的基础上,对表达条件进行了优化研究.根据枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)内切葡聚糖酶基因序列设计引物.采用PCR扩增到获得去除信号肽后约1.4kb的内切葡聚糖酶基因片段.以此片段成功地构建了pPIC-End载体.并转化至巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GSl 15.经过MD和MM平板筛选和酶活性测定,获得了高效表达的转化子GSl15-pPIC-End I、GSl15-pPIC-EndⅧ和GSl15-pPIC-EndⅧ.在摇瓶培养条件下,酵母工程菌表达优化条件:在pH4～8条件下均能稳定表达,诱导起始OD600=5表达水平最高,甲醇诱导最佳浓度为0.5%～1.O%,于250mL以上摇瓶培养对表达有显著的促进作用.三种工程菌在优化条件后诱导培养,酶活性可达860.7、760.3和786.2 U,分别为原始菌株酶活(63.78 U)的13.5、11.9和12.3倍.SDS-PAGE分析表明.表达产物分子量约为79.82 kD,热稳定性分析表明该酶在65℃保温30 min,可保持最高酶活的80%以上.