西农538 LMW-GS基因的克隆、原核表达及功能鉴定

为了探索普通小麦品种西农538的LMW-GS对面粉加工品质的影响,根据NCBI中已公布的LMW-GS基因序列,设计了一对特异性引物,从西农538基因组DNA中克隆出LMW-GS基因后,对其进行原核表达及掺粉试验。序列分析表明,克隆得到的LMW-GS基因序列(GenBank登录号为KX452081)有单一完整的开放阅读框,编码区长915bp,无内含子。同源性比对及进化树分析发现,该基因属于Glu-D3、Type V(Group 10)、m型、C组LMW-GS基因。SDS-PAGE和Western blot分析表明,该基因原核表达成功。微量掺粉试验表明,诱导表达的蛋白对小麦面粉加工品质有负效应。     

节节麦pbf基因的克隆、序列分析及原核表达

醇溶蛋白盒结合因子(prolamin-box binding factor,PBF)通过调控籽粒蛋白的表达效率进而影响面粉的加工品质。为给深入研究小麦籽粒PBF对籽粒蛋白质表达调控的分子基础提供参考依据,进而为小麦面粉加工品质的改良提供候选基因资源,利用特异引物组合pbfF1/pbf R1分别从两份节节麦(AS90、AS2386)中克隆出pbf基因后进行序列分析,并进一步构建pbf基因的原核表达体系。结果表明,从两份节节麦中克隆得到了2个不同类型的pbf基因(GenBank登录号分别为KJ544771和KJ544772),其中来源于AS2386的KJ544772与来源于普通六倍体小麦的1个pbf基因序列完全相同。推导的氨基酸序列分析表明,KJ544771和KJ544772所编码的蛋白质均为弱碱性的亲水蛋白,具有典型的DOF蛋白结构域。与其他远缘物种来源的PBF比对结果表明,该类蛋白在NLS核心、DOF结构域及Ser铰链区相对保守,而在C-端调控区变异较大,说明PBF蛋白具有种属特异性。同时,系统演化树显示,来源于节节麦AS2386的pbf基因与迄今已知的全部普通小麦的pbf基因具有高度的相似性,因此推测该种类型的节节麦很可能参与了最初的普通六倍体小麦的形成。此外,本研究成功构建了pbf基因的原核表达体系,可为后续功能验证的开展奠定基础。     

小麦(牛龙)牛儿(牛龙)牛儿基脱氢酶基因的克隆及电子定位与表达分析

为更好地了解小麦维生素E的生物合成并将其应用于营养品质改良,以电子和实验克隆相结合的方法克隆分离了小麦(牛龙)牛儿(牛龙)牛儿基脱氢酶(GGH)基因的cDNA序列,序列号为DQ139268.序列分析结果表明,该cDNA序列舍有一个完整的开放读码框,编码462个氨基酸,含有保守的ChlP结构域,氮端有信号肽序列,定位于叶绿体中.氨基酸序列比对和系统发育分析结果显示,不同物种之间GGH基因编码的氨基酸序列同源性都较高.用生物信息学工具将该基因定位于小麦第六部分同源群的长臂上.RT-PCR和电子组织表达分析结果显示该基因在光合器官中表达量丰富,这可能与其亚细胞定位有关.     

HARDY基因的克隆、原核表达及其植物表达载体的构建

为了给转HARDY(HRD)基因小麦研究奠定基础,利用PCR技术从拟南芥中克隆HRD基因,进行生物信息学分析,预测其编码的蛋白质结构与功能,构建原核表达载体pET28a(+)-HRD,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白的表达,同时构建pBin-HRD植物表达载体。测序分析结果表明,克隆的HRD与NCBI发布的拟南芥核苷酸序列的同源性为99%,其开放阅读框长555bp,可编码184个氨基酸,具有许多重要功能位点;成功构建了原核表达载体pET28a(+)-HRD和植物表达载体pBin-HRD,诱导表达出大小约为23.3kD的蛋白,与理论值相近。     

小麦β-酮脂酰CoA合成酶基因KCS的克隆与酵母表达

超长链脂肪酸是生物体内众多重要物质的合成底物。KCS基因编码β-酮脂酰CoA合成酶,该酶具有底物特异性,参与超长链脂肪酸延伸的缩合反应,是超长链脂肪酸合成的限速步骤。为了探究小麦KCS基因在超长链脂肪酸合成中的功能,采用同源克隆的方法从小麦(Triticum aestivum L.)中克隆出KCS基因后,利用生物信息学对其编码序列进行分析,并在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中对其进行真核表达。结果表明,小麦TaKCS6基因的开放阅读框为1 287bp,编码428个氨基酸残基。结构域预测结果显示,TaKCS6蛋白含有III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶和C末端3-酰基ACP合酶III结构域,属于KCSs蛋白家族。序列比对分析结果显示,TaKCS6氨基酸序列与拟南芥及其他植物的KCS6氨基酸序列在两个功能结构域上和活性位点保守。酵母表达结果显示,TaKCS6基因编码的蛋白参与C24以上超长链脂肪酸的延伸。     

小麦磷脂酶Dδ基因的克隆及表达分析

磷脂酶D (Phospholipase D,PLD) 是植物体内重要的信号转导酶。为了深入了解小麦PLD基因功能,利用同源克隆的方法从普通小麦扬麦158中克隆出TaPLDδ基因后进行序列分析,同时对TaPLDδ基因在不同组织及不同胁迫条件下的表达模式进行分析。结果表明,TaPLDδ基因编码区长为2 589 bp,编码862个氨基酸,等电点为6.93,分子量约为97 kDa。氨基酸序列分析显示,TaPLDδ基因编码的氨基酸序列含有N端C2结构域及两个保守的HKD活性中心。预测分析表明,TaPLDδ蛋白属于亲水性稳定蛋白,在细胞质中合成后,不进行蛋白转运;其二级结构包含27.49%的α-螺旋、19.14%的延伸链、6.73%的β-转角和46.64%的不规则卷曲。不同物种间TaPLDδ蛋白的同源性分析比较表明,TaPLDδ与谷子、玉米和拟南芥的PLDδ氨基酸序列之间具有高度的保守性,且与乌拉尔图小麦、二穗短柄草和水稻PLDδ亲缘关系密切。此外,qRT-PCR分析表明,TaPLDδ在叶、根、茎、花和种子中均有不同程度表达,并受ABA、NaCl和PEG诱导表达增强,推测该基因参与小麦渗透胁迫应答。以上这些研究结果为进一步研究TaPLDδ的生物学功能奠定了基础。     

小麦CO-like基因TaCO9的克隆及分析

CO蛋白(CONSTANS)是光周期途径中重要的调控因子,为了从普通小麦中进一步挖掘COlike基因,利用同源克隆的方法得到与大麦HvCO9基因同源的小麦TaCO9基因。结果表明,在冬性品种西农889中,初步克隆得到TaCO9基因的三个同源序列,分别命名为TaCO9-1、TaCO9-2、TaCO9-3。其cDNA序列全长均为870bp,开放阅读框为1 977bp,编码289个氨基酸,含有CO-like蛋白家族典型的CCT结构域,但不含B-box结构域;而在春性品种中发现TaCO9-1序列的第二外显子区域有6个碱基的插入,利用中国春缺-四体材料将该序列定位于小麦的1A染色体,命名为TaCO9-1A。系统发育分析表明,TaCO9蛋白与水稻Ghd7及大麦HvCO9位于同一分支。空间结构分析表明,其CCT结构域的NF-YA2区域较为保守,而该区域与CCAAT box互作相关。本研究克隆得到的TaCO9基因可能是小麦CO-like基因家族的新成员,与大麦HvCO9基因的结构相似,可作为新的小麦光周期候选基因加以研究利用。     

小麦脱水素基因WDHN1-2的克隆及其表达分析

为进一步明确小麦脱水素基因WDHN1-2在逆境条件下的功能,以伞穗山羊草DHN1基因为探针,通过电子克隆及RT-PCR技术获得WDHN1-2基因后对其序列特征进行分析,同时利用基因表达综合数据库及半定量RT-PCR技术对该基因的表达模式进行解析。结果表明,WDHN1-2基因编码区(CDS)长为548bp,编码的氨基酸具有脱水素保守序列K、Y和S片段,与山羊草脱水素EMT25371亲缘关系最近。WDHN1-2蛋白属于稳定且高度亲水蛋白,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主;该蛋白在亚细胞中定位的可能性:过氧化物酶体细胞核线粒体基质,可能行使转录调控的功能。表达模式分析发现,WDHN1-2基因在小麦开花后22d的胚乳中表达量最高,在ABA、PEG、NaCl及4℃低温胁迫下表达量均先上升后下降。     

小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定

为了克隆小麦干旱应答基因,构建了干旱诱导的小麦cDNA文库,并从文库中分离了一个DREB类转录因子基因TaDREB6.序列分析表明,TaDREB6具有一个837bp的开放阅读框和242bp的3非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的AP2/EREBP结构域.采用该基因特异引物PCR技术对一套中国春缺体-四体材料进行扩增,将TaDREB6定位于3A染色体上.这是首次将一个小麦DREB基因定位在特定的染色体上.RT-PCR分析表明,TaDREB6基因受干旱胁迫诱导表达;亚细胞定位结果表明,TaDREB6-hGFP融合蛋白定位于细胞核中.上述结果说明,小麦TaDREB6基因编码的蛋白可能在细胞核内对干旱胁迫应答反应起调控作用.     

小麦品种"中国春"主要过敏原CM16基因的克隆及序列分析

为了给小麦主要过敏原CM16蛋白的重组表达和免疫活性鉴定等研究奠定基础,通过生物信息学方法设计并合成简并性引物,利用RT-PCR技术对小麦主要过敏原CM16基因进行克隆,并进行序列分析. 结果表明,克隆获得了小麦主要过敏原CM16基因.基因开放阅读框为432个碱基(包括终止密码子), 编码143个氨基酸.该序列编码的蛋白相对分子质量约为15 782,等电点为5.17.序列同源性分析发现其与国外报道的已知小麦CM16基因具有很高的同源性(同源性为99%),因此认为其系小麦过敏原基因,在GenBank数据库中的登录号为EU883599.     

小麦耐冷相关基因TaCTR的克隆及其表达特性分析

低温冷害是小麦生长发育过程中面临的重要非生物逆境因素。为了挖掘小麦耐冷功能基因,本研究采用同源克隆的方法从普通小麦品种小偃22中分离到一个耐冷相关基因TaCTR,该基因序列全长2 192 bp,含有12个外显子、11个内含子,编码区全长为1 407 bp,编码468个氨基酸,分子量约为53.43 kDa;系统进化树分析表明,该基因在进化关系上与山羊草最近;亚细胞定位结果显示,该基因编码的蛋白为膜蛋白;实时荧光定量PCR（RT-PCR）结果表明,TaCTR在不同品种、不同组织和不同发育阶段低温特异表达;在干旱、高盐及GA处理下,TaCTR的表达量显著上升,说明该基因可能参与调控小麦的抗逆反应。     

甘肃冬小麦品种(系)面粉品质性状相关基因分析

为了解甘肃省近20年育成的106份冬小麦品种(系)中加工品质性状相关基因分布情况,用22个分子标记对供试材料的HMW-GS、LMW-GS、面粉色泽及籽粒硬度等品质性状相关基因进行了分析。结果发现,供试品种(系)的HMW-GS相关基因中,在Glu-A1位点检测到34份品种(系)含有AxNull,频率为32.08%;在Glu-B1位点检测到Bx7+By8和Bx14+By15共2种基因组合,分别占17.92%和25.47%;在Glu-D1位点检测到11份品种(系)含有Dx5+Dy10,占10.38%。对LMW-GS鉴定结果显示,29份品种(系)含Glu-A3d基因,分布频率为27.36%。HMW-GS和LMW-GS亚基组合中,含有4个、3个和2个位点优质亚基基因组合的品种(系)分别占0.94%、8.49%和3.77%。对面粉色泽相关基因Ppo-A1、Ppo-D1、Psy-A1、Lox-B1和TaPod-A1位点的检测发现,优异等位变异占比分别为39.62%、50.94%、31.13%、30.19%和38.68%。对籽粒硬度相关基因检测发现,在Pina、Pinb和Pinb-2等位变异位点的检测...     

Comparative Studies of High MrSubunits of Rye and Wheat. II. Partial Amino Acid Sequences

A panel of anti-peptide antibodies specific for each of the different N-terminal sequence types of B- and C-low molecular mass glutenin subunits (L M_rGS) were utilised in immunoblotting studies to identify the chromosomal location of genes encoding different sequences and to characterise the allelic variation of the encoding loci. The MET-type sequences were predominantly found among the B- subunits, while the α- and γ- sequences predominated in the C- subunits. The quantitatively major SHIPGLERPS sequence was found in both the B- and C- mobility regions. Using either biotypes in the cultivar, Aroona or genetic lines containing double rye chromosome 1 substitutions and thus expressing only single LM_r GS alleles, the sequences were determined for most of the major polypeptides expressed by each LM_r GS allele. The L M_rGS from different genomes encoded different numbers of each sequence type. Furthermore, different polypeptides within a particular «block» of subunits encoded by a given allele often had differing N-terminal sequences. However, subunits of similar electrophoretic mobilities encoded by different alleles at each locus usually had identical N-terminal sequences, suggesting that they may instead differ in the number of repeats. In Chinese Spring, genes encoding the SHIPGLERPS and METSHIPGL sequence types were predominantly present on chromosomes 1B and 1D, while the related METSRVPGL sequence was only encoded on 1D. In contrast, the METSCIPGL, α- and γ-sequences were encoded on each of chromosomes 1A, 1B and 1D. Several different electrophoretic and immunoblotting approaches using null lines suggested that some of the α-type L M_rGS may also be encoded by group 6 chromosomes, particularly 6D. The anti- SHIPGLERPS antibody also recognised chromosome 1B encoded β-, γ- and ω-gliadins, while the anti-METSRVPGL antibody recognised 1D encoded α- and β-gliadins. The absence of sequences within the major gliadin families that are highly homologous to the latter two N-terminal L M_rGS sequences may suggest that some monomeric L M_rGS could exist within the electrophoretically-resolved gliadins. These antibodies will provide valuable reagents for the study of the roles of particular L M_rGS families in the structure and function of the glutenin macropolymer, the role of different LM_r GS types in determining the influence of allelic variation of L M_rGS composition on dough properties, and potentially in the development of diagnostics for these flour components.     

不同氮效率小麦品种苗期根系氮代谢及其吸收能力差异分析

为了解不同氮效率小麦品种根系氮代谢特征及其吸收能力的差异,明确小麦氮高效利用的生理机制,在水培条件下,研究了氮高效小麦品种漯麦18和氮低效小麦品种西农509的根系氮代谢特征和对NO-3、NH+4吸收的动力学特征。结果表明,漯麦18的根系GS活性、硝酸还原酶活性、游离氨基酸含量、可溶性蛋白质含量均高于西农509;而西农509的根系硝态氮和铵态氮含量高于漯麦18;漯麦18根系对NO-3、NH+4吸收的最大吸收速率(Vmax)显著高于西农509;漯麦18根系对NO-3、NH+4的亲和力(以Km的倒数衡量)低于西农509。结果说明,氮高效型小麦品种根系对NO-3、NH+4的吸收能力和同化能力均显著高于氮低效型小麦品种;小麦根系对NO-3、NH+4的吸收和同化是相互促进的关系。     

2008-2010年度陕西关中小麦品质分析与比较

为掌握近年来关中地区小麦品质状况,以2008-2010年从关中地区3市9县（区）抽取的253个大田生产小麦样品为实验材料,对其品质进行了全面检测分析。结果表明,2009年小麦籽粒品质和磨粉品质较差,籽粒硬度、L＊值、a＊值、b＊值在年度间差异显著。总体来讲,关中地区小麦的蛋白质品质较好,且比较稳定,受环境条件影响较小;而淀粉品质受环境的影响较大,3年间淀粉峰值黏度、破损值、回生值均有显著差异;粉质参数和拉伸参数在不同年度的差异较小,比较稳定。     

Puroindoline genotype,starch granule size distribution and milling quality of wheat

Genetically-diverse wheat samples from the Australian Winter Cereals Collection propagated in two environments were sequenced to identify puroindoline genotypes then the relationships between flour yield, genotype, starch granule size distribution and starch-bound puroindoline protein content were investigated. The Pina-D1a, Pinb-D1b genotype resulted in a higher average flour yield than either the Pina-D1b, Pinb-D1a or the Pina-D1a, Pinb-D1a but the ranges of flour yields for the three genotypes showed considerable overlap. For both hard wheat genotypes (Pina-D1a, Pinb-D1b or Pina-D1b, Pinb-D1a), a higher proportion of type A to type C starch granules was associated with higher flour yield and this relationship accounted for between 31% and 33% of the variation in flour yield. This result is consistent with previously reported findings for soft wheat. For the Pina-D1a, Pinb-D1b genotype, increased flour yield was also associated with a decrease in starch granule-bound puroindoline protein, which accounted for 31–35% of the variation in flour yield across the two environments. The combined effect of starch granule type and associated puroindoline content accounted for 68% of the variation in flour yield within the Pina-D1a, Pinb-D1b genotype.     

Studies on green gram (Phaseolus aureus) protein concentrate and flour

Protein isolate from green gram (Phaseolus aureus) was prepared and the chemical composition was determined. It contained 64.04% protein, 1.8% total lipids, 27.64% total carbohydrates, 1.68% crude fibre and 4.84% ash. Iron, calcium, magnesium, copper, zinc, potassium and sodium were determined. The limiting amino acid in the protein isolate was lysine. In vitro digestibility pepsin followed the pancretion was the highest and the lowest was the digestion by pepsin alone. Water absorption, oil absorption, emulsion capacity and nitrogen solubility index (NSI) of the protein isolate were 2.26g/g, 1.24g/g, 31.4g/g and 6.8g/g, respectively. For comparison the same functional properties were determined for the flour of green gram. Replacing 5 and 10% of the wheat flour with green gram flour improved the mixing properties of dough and produced good acceptable bread. However, the addition of 15% green gram flour weakened the dough and lowered the quality of bread. Replacing 2.5, 5 and 7.5% of wheat flour with protein concentrate also weakened the mixing properties of the wheat dough and decreased the bread quality.     

小麦品种西农979抗赤霉病基因的转录组测序鉴定

小麦品种西农979对赤霉病具有较好的抗性。为了发掘西农979的抗赤霉病基因,本研究采用禾谷镰刀菌菌株BN-8分别接种抗病品种西农979与感病品种周麦18,取接种前西农979颖壳及接种后12、24和96 h的西农979与周麦18颖壳进行转录组分析,筛选抗感赤霉病差异表达基因,并对其进行GO功能注释及KEGG富集分析。结果表明,接种后12、24和96 h各出现14、1 978和142个差异表达基因,共计2 122个基因。这些基因经GO功能注释分类分成3大类43个亚类,主要涉及代谢过程、细胞过程、应激反应、生物调控、细胞部件、细胞、催化活性、结合、转运活性等。KEGG通路分析结果显示,内质网中的蛋白质加工通路中差异基因最多,有48个;其次是光合作用—天线蛋白通路及淀粉和蔗糖代谢通路,各含41和30个差异基因;显著富集的通路有光合作用—天线蛋白、内质网中的蛋白质加工、萜骨架的生物合成等。植物激素信号转导通路中发现27个差异基因,参与脱落酸和茉莉酸等路径;植物-病原体互作通路中发现19个差异基因,编码钙结合蛋白、WRKY转录因子、抗病蛋白等。此外,还筛选到UDP-葡萄糖基转移酶基因等脱毒相关蛋白基因。