拟南芥 AtNHX5基因启动子的克隆和组织定位分析

为了探明拟南芥内膜反向转运体 AtNHX5基因启动子（proNHX5）功能及基因的组织表达模式,从基因组中克隆 AtNHX5基因开放阅读框（ORF）上游侧翼调控区1 807 bp序列,发现该启动子具有典型启动子一般特征,不仅具有TATA-box、CAAT-box等核心元件,还含有与光响应、激素响应、逆境诱导响应和分生组织表达调控元件。构建 AtNHX5基因启动子与GUS的融合表达载体,通过农杆菌花序浸染法转化野生型拟南芥获得转基因植株。利用组织染色法鉴定转基因拟南芥的GUS表达模式,发现在子叶、下胚轴和花中有显著的GUS酶活性,成熟叶片和根中只有局部检测到GUS表达,在未成熟果荚中只有在果荚顶端和基部存在GUS酶活性,说明 AtNHX5基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建且正常启动GUS基因表达,同时也表明, AtNHX5基因主要在这些部位表达,且表达具有时空特异性。     

唐菖蒲蛋白磷酸酶GhPP2C1基因功能及其对ABA的响应

为探究唐菖蒲GhPP2C1（Protein phosphatase 2C1）的功能及对脱落酸（Abscisic acid,ABA）的响应,以唐菖蒲‘Rose Supreme’为试材,利用同源克隆的方法获得ABA信号转导过程中的关键蛋白磷酸酶基因GhPP2C1,利用实时荧光定量分析、亚细胞定位和启动子β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色等方法检测其对ABA的响应情况;对其启动子序列进行响应元件分析;在拟南芥中异源过表达GhPP2C1基因,对转基因株系进行ABA敏感性测定、株型分析及下游基因表达情况分析。结果表明：1）GhPP2C1的表达在ABA处理的诱导下显著上调。2）GhPP2C1定位于细胞质中,可被ABA处理诱导入核。3）GhPP2C1基因启动子包含ABA、赤霉素（Gibberellins,GAs）、干旱和低温相关响应元件。在烟草叶片和拟南芥根尖中,GhPP2C1启动子活性可被ABA激活。4）在拟南芥中异源过表达GhPP2C1基因导致ABA信号通路中下游基因的表达量显著下降并出现分枝数、株高和种荚数量明显增加的表型。综上,推测唐菖蒲GhPP2C1可能通过减弱ABA信号传导,促进种子休眠解除,且在植株营养生长过程中也发挥作用。     

过表达玉米ZmSC1基因增强转基因拟南芥的耐盐性

旨在从玉米中克隆耐盐相关基因ZmSC1,分析其分子特征并在拟南芥中研究其耐盐性的生物学功能。以玉米B73为试验材料,克隆ZmSC1全长序列,与其他物种进行同源性比对,解析其盐诱导表达模式和亚细胞定位情况,将ZmSC1转入到拟南芥突变体atsc和野生型中,观察在盐处理下种子萌发率和主根根长情况,利用荧光定量PCR分析相关逆境（140 mmol·L^-1胁迫）基因的表达量。结果表明,ZmSC1基因全长为423 bp,编码141个氨基酸,ZmSC1和小麦、拟南芥中已知的TaSC1、AtSC1具有较高保守性。烟草细胞瞬时表达、玉米原生质体亚细胞定位研究表明ZmSC1定位于细胞膜中。生物学功能研究发现在140 mmol·L^-1的NaCl的盐处理下,相比较于拟南芥突变体,回补植株拟南芥的种子萌发率和主根根长得到了明显改善,这说明ZmSC1基因可以回补拟南芥同源基因AtSC1突变体植株在盐胁迫下的表型。ZmSC1基因过表达拟南芥植株的种子萌发率和主根根长也显著高于野生型植株。荧光定量PCR结果显示相较于野生型,在过表达植株中AtRD29A、AtSOS2、AtSOS3、AtCDPK1等胁迫相关基因的表达量也明显增强。研究结果表明TaSC1、AtSC1的同源基因ZmSC1对提高拟南芥的耐盐性具有重要作用。     

黄瓜CsMADS08及其下游调控基因的功能与表达分析

【目的】探究黄瓜CsMADS08基因及其下游调控基因的功能,为黄瓜新品种选育提供参考。【方法】以拟南芥agl8纯合突变体为材料,农杆菌介导法导入黄瓜CsMADS08基因,经筛选获得转CsMADS08抗性植株,比较agl8突变体植株、转CsMADS08植株及野生型拟南芥植株的表型变化,观察不同类型植株茎生叶的显微结构,并用实时荧光定量PCR方法分析CsMADS08及其下游调控基因SHP1、SHP2、ALC、IND在根、茎、莲座叶、茎生叶、花、果实中的表达情况。【结果】agl8突变体植株、转CsMADS08植株及野生型拟南芥根长、株高、莲座叶的数目及形状差异不明显;与野生型植株相比,agl8突变体植株抽薹及开花时间延迟,CsMADS08基因在agl8突变体植株花中的表达量无显著变化;而转CsMADS08植株抽薹及开花时间较agl8突变体植株提早4~6 d,且CsMADS08基因在花中表达量显著增加。野生型、agl8突变体及转CsMADS08拟南芥植株茎生叶数量、形状及侧枝数、果实均有明显差异,其中转CsMADS08植株叶片小而密集,形状接近圆形,果荚长且饱满,无提前开裂现象。茎生叶显微观察结果显示,与野生型植株相比,转CsMADS08植株叶片细胞变大,排列整齐,维管束细胞增加,叶片变厚。实时荧光定量PCR检测结果显示,CsMADS08基因在转CsMADS08植株各组织中均有表达,且在茎生叶中表达量最高;与agl8突变体植株相比,SHP1、SHP2、ALC、IND基因只在转CsMADS08植株花中上调表达,而在其他组织中均下调表达,且在茎生叶中降幅最大。【结论】CsMADS08基因具有促进开花、增加侧枝、调控叶片形态及果实发育等的功能。     

洋葱AcSCL4的克隆及其功能分析

【目的】初步探讨AcSCL4在洋葱成花中的功能,为解析洋葱成花分子调控机制提供理论基础。【方法】以长日生态型洋葱品系SB2为试验材料,根据已有的洋葱转录组数据,通过qRT-PCR筛选目的基因AcSCL4后进行基因克隆,并对其进行生物信息学分析;构建AcSCL4基因的过表达载体pB221-3300-AcSCL4并转化农杆菌,采用花序浸染法浸染拟南芥,并对T₃代纯系转基因植株进行表型分析和开花相关基因表达量分析。【结果】洋葱AcSCL4基因CDS长1 515 bp,编码504个氨基酸;AcSCL4蛋白N端高度变异,C端有GRAS结构域。聚类分析发现,AcSCL4与石刁柏和棉花的SCL4蛋白亲缘关系较近。与野生型拟南芥相比,AcSCL4过表达植株表现晚花表型。荧光定量PCR结果表明,与野生型拟南芥相比,AcSCL4过表达植株开花调控基因CO和FT的表达量极显著下降。【结论】AcSCL4通过调控CO及FT基因表达来抑制洋葱开花。     

玉米ZmEREB46基因调控耐渍性功能探究

为鉴定和发掘玉米渍水胁迫抗性基因,克隆玉米ERF家族成员ZmEREB46（Zm00001d015759）基因,同时对该基因进行重测序分析、功能变异位点鉴定以及表达模式分析,并进一步在模式植物拟南芥中初步探究ZmEREB46参与耐渍的功能。结果显示,ZmEREB46编码1个AP2/EREBP类转录因子;相较于耐渍自交系A3237,ZmEREB46基因编码区及启动子区在渍水敏感自交系A3239中分别存在1个G/A的转换以及1个911 bp片段插入,911 bp片段的插入显著抑制了渍水敏感自交系A3239中ZmEREB46基因的表达;亚细胞定位结果显示,ZmEREB46定位在细胞核中;荧光定量PCR结果显示,ZmEREB46受渍水胁迫诱导上调表达,渍水处理8 h后ZmEREB46在耐渍自交系A3237中的表达量是渍水敏感自交系A3239中的2倍。结果表明,ZmEREB46在拟南芥中过量表达提高了拟南芥苗期的耐渍性。     

茶树CsCBF1基因表达载体的构建及其转基因烟草的抗寒性分析

【目的】通过转基因烟草验证茶树CsCBF1基因抗寒性功能,为发掘、筛选茶树重要功能基因提供理论依据。【方法】 利用根癌农杆菌介导法将构建的表达载体pBI121-CsCBF1导入烟草,通过PCR、RT-PCR和GUS活性染色鉴定外源CsCBF1基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。然后将转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草分别置于25,4和0 ℃下处理48 h后,检测其膜质通透性、丙二醛（MDA）含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm,并将0 ℃处理3 d的转pBI121-CsCBF1型和野生型烟草置于25 ℃下培养1周后观测恢复表型和统计死亡率。【结果】 成功构建表达载体pBI121-CsCBF1,PCR、RT-PCR和GUS活性染色证明,CsCBF1已整合到烟草基因组中并转录表达。25 ℃处理下,转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草的膜质通透性、丙二醛含量和Fv/Fm均无显著差异,而在4和0 ℃处理下,转pBI121-CsCBF1型烟草的膜质通透性和丙二醛含量均显著低于转pBI121型和野生型烟草,但Fv/Fm显著高于转pBI121型和野生型烟草。生长恢复试验中,转pBI121-CsCBF1型的存活率为66.7％,而野生型仅为23.3％。【结论】 茶树CsCBF1基因能够显著增强非低温驯化植物烟草的抗寒性,说明茶树CsCBF1基因存在于细胞抗寒的分子调控途径中,从而提高植物细胞的低温防御能力。     

四季秋海棠BsMYB62的抗旱性功能研究

【目的】以前期从四季秋海棠叶片中克隆得到的R2R3型MYB转录因子BsMYB62为研究对象,分析其在干旱胁迫下的功能。【方法】对四季秋海棠MYB62蛋白进行亚细胞定位,并通过实时荧光定量PCR方法明确BsMYB62基因在四季秋海棠根、茎、叶、雄花和雌花5个组织部位中的表达情况;构建BsMYB62基因的过表达载体转化到拟南芥,观察过表达转基因株系与野生型植株在萌发期和幼苗期遭受干旱胁迫时的生长表型、种子萌发和根长情况,测定各株系在幼苗期干旱胁迫处理时的叶绿素荧光参数PSⅡ最大光化学效率（F_v/F_m）,叶绿素、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量,抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性以及转基因株系中BsMYB62基因的相对表达量变化。【结果】BsMYB62定位于四季秋海棠的细胞核,其在根、茎、叶和雌雄花中均有表达,其中以根和茎中的表达水平较高。在MS培养基中,野生型拟南芥和3个BsMYB62过表达转基因株系（OE1、OE2和OE3）的发芽率和长势均无显著差异,而在200 mmol/L甘露醇（模拟干旱胁迫）培养基中,OE1、OE2和OE3在胁迫处理后前2 d的发芽率及主根长均显著高于野生型拟南芥,幼苗长势也明显优于野生型。置于培养土中干旱胁迫1 d时,OE1、OE2和OE3的BsMYB62即被显著诱导;干旱胁迫13 d时,OE1、OE2和OE3的F_v/F_m、叶绿素含量、Pro含量以及SOD、POD和CAT活性均显著高于野生型拟南芥,而MDA含量则显著低于野生型拟南芥。【结论】BsMYB62基因通过提高转基因拟南芥的光合潜能和抗氧化能力,显著增强其对干旱胁迫的抗性。     

小麦转录因子TaWRKY28基因克隆与抗旱性分析

【目的】克隆小麦TaWRKY28基因,通过农杆菌浸染法将其转化至拟南芥,研究转基因拟南芥植株生理生化指标变化,探究其在抵御非生物胁迫中的作用。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦百农207 cDNA中克隆得到TaWRKY28基因,利用ProtParam等软件对其氨基酸序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法,分析TaWRKY28基因的组织表达特异性及在NaCl、ABA、H₂O₂、干旱和低温逆境胁迫下的表达情况;构建基因超表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,选取TaWRKY28基因相对表达量较高的转基因T₃拟南芥株系,测定拟南芥超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性以及丙二醛（MDA）、H₂O₂和脯氨酸含量,研究TaWRKY28对拟南芥抗旱性的影响。【结果】成功克隆获得小麦TaWRKY28基因,该基因ORF全长为978 bp,编码325个氨基酸,相对分子质量为34.87 ku,理论等电点为9.27,含有1个WRKY保守结构域和1个C₂H₂锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员。序列系统进化分析结果显示,小麦TaWRKY28与大麦HvWRKY2亲缘关系最近。亚细胞定位显示该基因位于细胞核中。qRT-PCR结果表明,TaWRKY28在小麦根、茎、叶、雌蕊和雄蕊组织中均有表达,但具有组织特异表达性,在叶中表达量最高,雄蕊中次之,雌蕊中表达量最低,且受NaCl、ABA、H₂O₂、干旱和低温胁迫后TaWRKY28表达会增强。对TaWRKY28转基因拟南芥植株的抗旱性分析表明,在干旱条件下,转基因植株的表型优于野生型,SOD、POD活性和脯氨酸含量显著增加,而H₂O₂和MDA含量显著降低,转基因植株抗旱性显著提高。【结论】克隆了小麦TaWRKY28基因,该基因可以增强转基因拟南芥植株的抗旱能力。     

GA信号因子 SlMYB33对番茄开花时间及果实大小的影响

以番茄Micro-Tom为材料,以GA信号转导因子GAMYB基因 SlMYB33为对象,利用GUS组织化学染色分析 SlMYB33在花和果实中的表达模式;其次,通过载体构建、遗传转化得到转基因植株,通过转基因植株的表型分析探究 SlMYB33对番茄开花及果实发育的影响。结果表明, SlMYB33主要在番茄雄蕊和柱头中表达;在番茄Micro-Tom中过表达 SlMYB33,获得OE3、OE4、OE5、OE6和OE7五个过表达株系;表型观察表明, SlMYB33的过量表达可导致番茄开花时间延迟,同时促进果实增大。     

十字花科植物PIN3基因调控元件及表达分析

为探明十字花科不同物种PIN3基因的表达调控差异,从拟南芥(Arabidopsis thaliala)、红花荠菜(Capsella rubella)、白菜(Brassica rapa)、油菜(Brassica napus)和甘蓝(Brassica oleracea)等17个已完成基因组测序的十字花科物种基因组数据库中鉴定出18个PIN3同源基因。对这18个同源基因编码序列上游1 500bp启动子区域顺式作用元件进行预测及比对分析,结果发现,光响应、多种激素响应及胁迫响应等相关元件呈现出较大差异,其中生长素以及向地性响应相关元件具有较高的保守性。克隆普通荠菜PIN3同源基因(CbPIN3)并构建普通荠菜PIN3基因启动子的GUS报告系统CbPIN3pro::GUS转化拟南芥。与拟南芥基因表达数据库比较,荠菜启动子表达与拟南芥PIN3具有基本一致的组织表达模式,但也存在一定的组织差异,说明植株形态建成中生长素极性转运调控的差异。拟南芥和荠菜PIN3的表达差异是十字花科物种适应性进化模式的缩影。     

甘蓝型油菜种子特异表达油体蛋白启动子P_(BnOA03)的克隆及功能分析

为了改良油菜种子的性状,常常需要研究种子特异表达目的基因的情况。在分析油菜油体蛋白表达模式的基础上,选择种子特异高表达的油体蛋白,根据甘蓝型油菜基因组序列设计引物,利用PCR技术从基因组中克隆到一段715bp的启动子序列。启动子顺式元件分析表明,这一克隆序列具有CAAT-box和TATA-box启动子基本元件,另外含有ABA响应元件等多种顺式元件。进一步利用GUS报告基因在拟南芥中对该启动子的功能进行鉴定,结果表明,在转基因株系的幼苗、根、茎、叶、花和种子发育前期及成熟种子中没有检测到GUS基因明显表达,在种子发育的中后期检测到GUS基因的表达逐渐增强。说明这个启动子的表达调控具有一定的种子特异性。     

普通小麦TaZIP29-7B基因的克隆及表达研究

金属离子在小麦生长过程中起重要作用,但土壤中金属离子含量过高,会对小麦生长造成损害。锌铁转运蛋白ZIP家族(ZRT,IRT-like protein,ZIP)广泛存在于植物中,参与多种金属离子的转运,也能提高植物的耐盐性。利用同源克隆技术获得 AtZTP29在小麦中的同源基因TaZIP29-7B,并获得其启动子序列,利用生物信息学技术对所获得的基因以及启动子序列进行初步分析,预测启动子顺式作用元件,通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析小麦 TaZIP29-7B基因在根和叶中在不同金属离子溶液处理下的表达情况,以研究该基因在小麦体内中对重金属转运的作用。结果表明:序列分析显示 TaZIP29-7B基因(登录号MK203894)编码277个氨基酸,TaZIP29-7B蛋白为疏水性蛋白,定位在细胞膜上,存在信号肽,属于分泌蛋白,第89～263位置间的结构功能域ZIP,属于典型的ZIP超级家族结构域,具有8个跨膜区;进化分析显示TaZIP29-7B与单子叶植物山羊草(Aegilops tauschii)ZIP29蛋白同源性最高;启动子中存在多种响应胁迫的顺式作用元件;qRT-PCR结果显示,小麦 TaZIP29-7B基因在外界重金属盐的变化下表达量有所变化。说明研究结果为进一步改良小麦抗盐性提供了参考。     

玉米ZmPGP1基因启动子的克隆及结构功能分析

为分析玉米ZmPGP1基因启动子的功能,利用巢式PCR方法克隆出了玉米ZmPGP1基因的启动子调控区,并将该启动子与GUS基因融合,通过基因枪法转入玉米(Zea mays)中,分析ZmPGP1启动子表达特性。结果显示,在玉米中克隆出ZmPGP1基因5′端上游1 090bp的启动子序列,该启动子序列包括光响应元件、激素响应元件和胁迫诱导及发育相关顺式作用元件。GUS染色表明ZmPGP1基因在玉米幼苗的茎部、叶子及根中都有表达,其中茎的节间处以及叶鞘部位表达量较高,这与ZmPGP1基因的Real-time PCR分析结果一致。研究结果进一步阐明ZmPGP1基因的功能以及作用机理。     

汉麻Alfin-like转录因子家族鉴定及表达分析

对汉麻Alfin-like转录因子家族进行鉴定和生物信息学分析,为Alfin-like转录因子调控汉麻生长发育及抗性奠定基础。通过利用拟南芥Alfin-like转录因子蛋白序列作为模板,利用TBtools、MEGA等生物信息学工具分析汉麻全基因组数据。在汉麻基因中共鉴定出5个CsALs基因,对其进行了理化性质分析、亚细胞定位、保守基序、基因结构、染色体定位、顺式元件、共线性分析、进化分析及聚类分析等基础分析。结果表明：鉴定的5个汉麻AL转录因子均含有DUF3594结构域（PAL结构域）和PHD手指状结构域;经理化性质分析得出,CsALs蛋白质长度在239～256 aa之间,等电点在4.97～5.31之间,亲水性为-0.809～-0.623,属于酸性亲水蛋白;CsALs基因分布在4条染色体上,亚细胞定位发现AL转录因子均定位在细胞核;上游2 000 bp启动子元件分析与光响应、胁迫响应和激素相关;根据与拟南芥、大豆、水稻、玉米、烟草等系统发育分析共分为B、E、F 3个亚族;热图聚类分析表明CsALs基因在汉麻中具有较高表达。     

马铃薯StTrxF基因的克隆与功能分析

为探究马铃薯硫氧还蛋白基因(StTrxF)的耐盐生理机制,通过RT-PCR方法从马铃薯品种中薯5号中克隆得到全长549bp硫氧还蛋白基因(StTrxF)。该基因编码182个氨基酸,预测蛋白质分子量为44.17ku,理论等电点(pI)为5.23,具有典型的Thioredoxin结构域。由StTrxF基因推导的氨基酸序列与番茄、拟南芥、芝麻和赤霞珠等TrxF蛋白质氨基酸序列的同源性为96.02%～59.28%。构建植物过表达载体,导入拟南芥中,获得转基因拟南芥纯系植株。通过对转基因拟南芥植株的耐盐离体和盆栽鉴定,表明转基因植株的耐盐性显著提高。同时盐胁迫下,转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性和脯氨酸含量显著提高,丙二醛(MDA)含量显著降低。结果表明,表达StTtxF基因通过增加转基因植株脯氨酸含量,提高SOD活性,降低MDA含量,以维持细胞渗透平衡并激活ROS清除系统,具有提高转基因拟南芥植株耐盐性的显著效果。     

植物凝集素MNB1基因启动子表达载体的构建及鉴定分析

近年来植物受逆境胁迫的影响日益严峻,而逆境胁迫是造成现代农作物减产的重要因素之一。MNB1基因是拟南芥中与甘露糖高度特异性结合的植物凝集素,具有多种生物学功能,对植物的生长发育及逆境胁迫的应答有着至关重要的调控作用。以拟南芥为试验材料,利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术成功构建了ProMNB1:GUS植物表达载体,结合浸花法,成功将ProMNB1:GUS载体转化到拟南芥中,最终通过PCR鉴定分析获得ProMNB1:GUS阳性植株,为研究逆境胁迫下MNB1基因的功能及其转录水平的变化提供了重要的依据。     

二穗短柄草DREB1G基因表达模式分析和在拟南芥中的异源过量表达

CBF/DREB基因是一类植物特异性转录因子,通过调控下游抗逆相关基因的表达,在植物逆境胁迫应答过程中发挥重要作用。为了研究新型的禾本科模式植物二穗短柄草DREB基因的功能,克隆BdDREB1G的cDNA序列,分析该基因在各种非生物胁迫条件下的表达,构建过表达载体,获得转基因拟南芥。结果表明:高温、低温和水杨酸胁迫处理显著诱导BdDREB1G的表达,暗示该基因响应高温和低温胁迫。初步观察结果说明,该与野生型拟南芥相比,转基因植株生长发育迟缓。这些为研究该基因响应非生物胁迫的功能奠定基础。     

拟南芥免疫相关基因启动子对免疫信号分子的响应强度分析

为对比不同的植物抗病相关基因对植物免疫激发子的响应强度,筛选出响应强度较高的报告基因,从拟南芥中克隆5个植物免疫相关基因(WRKY33、FRK1、WRKY29、PR2和PDF1.2)的启动子序列,构建目的基因启动子驱动的萤光素酶(Luciferase,LUC)表达载体,并将其转化到拟南芥原生质体中瞬时表达;经植物免疫激发子(FLG22与PEP1)处理后,进行LUC活性检测,判断目的基因启动子的激活情况,分析上述目的基因启动子对免疫信号分子的响应强度。结果显示:经FLG22与PEP1处理后,拟南芥原生质体细胞中WRKY33响应强度为最高,与对照相比分别上调11.2与4.5倍,WRKY29响应强度次之,分别为对照的10.0与3.1倍;与WRKY相比,FRK1响应强度明显降低,而PR2与PDF1.2均无明显响应。上述结果表明在拟南芥原生质体瞬时表达体系中WRKY33可高效响应植物免疫激发子,pWRKY33::LUC原生质体表达体系可作为一种高效的PTI反应报告系统,用于新型植物免疫激发子的筛选鉴定。