Kin17基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达特性分析

Kin17是一种在物种进化中较保守的、在各种组织中普遍表达的蛋白。为明确Kin17基因在斑马鱼发育中的表达特性及在斑马鱼胚胎发育过程中的功能,利用RT-PCR和Q-PCR方法检测Kin17 mRNA在斑马鱼中的表达情况,运用免疫组织化学技术检测Kin17蛋白在成鱼各组织中的表达特性。采用胚胎整体原位杂交(WISH)方法观察Kin17 mRNA在斑马鱼胚胎内的表达分布情况。利用吗啉反义寡核苷酸介导的基因敲降技术降低Kin17的表达水平,并观测斑马鱼胚胎发育情况。结果表明:Kin17转录本母源存在,Kin17 mRNA的表达水平在原肠期前表达较低,到体节期迅速上升且稳定在较高水平。Kin17基因在斑马鱼成鱼多个组织中均有表达,高表达于卵巢、精巢、肠道组织。原位杂交结果显示,Kin17基因在斑马鱼胚胎的原始生殖细胞、脑部、眼部中的表达量较高。注射Kin17吗啉反义寡核苷酸使Kin17基因表达受到抑制,导致斑马鱼胚胎发育迟缓,出现眼部缺失、腹腔肿大、尾部缺失等不同程度的畸形。上述结果提示,Kin17在斑马鱼胚胎发育过程中发挥重要作用。     

奶牛乳脂性状候选基因EEF1D突变位点功能分析

提高乳脂含量、提升奶质已成为当前奶牛业研究的重点方向之一。前期经GWAS方法研究发现,EEF1D基因5′非翻译区(5′-UTR)的G/A突变与乳脂率极显著相关,为了进一步对候选基因EEF1D的突变位点进行功能分析,首先通过人工合成获得了EEF1D基因突变型与野生型片段,并在细胞水平上对其开展了功能验证实验。研究发现,EEF1D基因5′-UTR的G/A突变引起Sp3转录起始位点后移33 bp,并且突变型的活性大约是野生型的3倍。研究结果表明,该突变可改变转录因子的转录起始位点,从而使EEF1D的表达上调。     

miR-663通过靶向TGF-β1调控羊驼黑色素细胞的黑色素生成

【目的】预测和验证羊驼TGF-β1是mi R-663的靶基因之一,并对mi R-663介导的TGF-β1在黑色素生成过程中的作用进行研究。【方法】利用Targetscan、RNAhybrid和RNA22在线预测mi R-663的靶基因,并对靶基因3′UTR区可能的mi R-663的作用位点进行分析。利用DNAMAN软件分析比对羊驼、人和牛等哺乳动物TGF-β1-3′UTR区的相似性。利用SacⅠ和XbaⅠ将羊驼TGF-β1基因的3′UTR区插入pmir GLO构建双荧光报告载体pmir GLO-TGF-β1-3′UTR并与mi R-663 mimic共转染293T细胞,通过测定荧光素酶活性来验证mi R-663的直接靶基因是TGF-β1。在羊驼黑色素细胞中通过转染mi R-663 mimic来过表达mi R-663,并利用q RT-PCR和Western blotting检测mi R-663过表达后细胞中TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7和β-catenin分别在m RNA和蛋白水平的变化及黑色素含量的变化。【结果】软件预测显示mi R-663有68个保守的靶基因,包含74个保守的靶位点和44个非保守靶位点。TGF-β1是mi R-663的靶基因之一,且已被证明与毛囊发育和黑色素生成相关。不同物种的TGF-β1基因的3′UTR区相似性较高且均存在多个保守的mi R-663靶位点。克隆了羊驼TGF-β1基因3′UTR区发现存在3个保守的mi R-663靶位点。成功构建包含3个mi R-663作用位点的pmir GLO-TGF-β1-3′UTR双荧光报告载体并与mi R-663 mimic共转染293T细胞。双荧光素酶报告基因检测结果显示:与对照组相比,试验组pmir GLO-TGF-β1-3′UTR+mi R-663 mimic荧光素酶活性下调31.01%,表明TGF-β1是mi R-663直接的靶基因。在羊驼黑色素细胞中转染mi R-663 mimic后:mi R-663表达量上调334倍,TGF-β1、β-catenin、Smad4基因的表达量分别下调89%、41%、34%;TGF-β1蛋白表达量下降了21%,β-catenin蛋白表达量无明显差异;黑色素细胞中的黑色素含量下降42%。【结论】TGF-β1是mi R-663的直接靶基因。mi R-663通过调控TGF-β1的表达而影响TGF-β/Smad和Wnt信号通路,进而影响羊驼黑色素细胞中的黑色素生成。     

青海湖裸鲤TOB1和TOB2基因的克隆与表达分析

【目的】对青海湖裸鲤TOB1和TOB2基因进行克隆及表达分析,为揭示其在青海湖裸鲤生长和生理过程中的作用奠定基础。【方法】采用PCR和RACE技术克隆青海湖裸鲤中TOB1和TOB2基因的cDNA全长序列,对其特性进行了生物信息学分析。以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测TOB1和TOB2基因在3龄成鱼肾脏、肠、鳃、脑、心脏、肌肉等组织及发育12,72,120,168,216 h胚胎中的表达水平。【结果】青海湖裸鲤TOB1 cDNA全长为1 734 bp,5′非编码区为466 bp,3′非编码区为296 bp,开放阅读框长972 bp,编码323个氨基酸。TOB2 cDNA全长为2 785 bp,5′非编码区为51 bp,3′非编码区为1 582 bp,开放阅读框为1 152 bp,编码383个氨基酸。TOB1和TOB2在N端均具有明显的BTG家族结构域,且系统进化分析显示2个TOB蛋白与鲤科鱼类同源性较高,亲缘较近。qRT-PCR结果表明,TOB1和TOB2在3龄成鱼的肾脏、肠、鳃、脑、心脏、肌肉等组织中均有表达;TOB1在3龄成鱼的心脏组织中表达量最高,其次为脑和肌肉组织,在鳃组织中的表达量最低;TOB2在3龄成鱼的脑组织中表达量最高,其次为肌肉。TOB1及TOB2在不同发育时期胚胎中均有表达,且都在12 h胚胎中表达量最高。【结论】TOB1及TOB2在3龄成鱼各个组织及胚胎中均有表达,但表达量有较大差异,表明2个基因均具有时空表达特异性。     

Tbx5基因在漠斑牙鲆（Paralichthys olivaceus）变态前的表达

鲽形目鱼类仔鱼经过变态后形成眼睛和偶鳍等器官左右不对称的稚鱼。Tbx家族成员参与脊椎动物心脏、肢体和眼等器官的发育,而Tbx基因与鲽形目鱼类变态的关系目前尚无报道。我们运用扫描电镜和软硬骨染色等方法对出膜后2d（变态早期）和26d（变态前期）的牙鲆仔鱼的形态进行观察,牙鲆出膜后2d胸鳍原基出现,出膜后26d胸鳍发育成熟,而在出膜后26d胸鳍和腹鳍仍呈现左右对称。我们克隆了牙鲆Tbx5基因的CDS序列,该序列编码的多肽具有部分T-box保守结构域,与斑马鱼Tbx5同源性高达93%。系统进化分析显示：这段CDS序列与硬骨鱼的Tbx5基因聚为一支,但与四足动物Tbx5相分离。整体原位杂交显示出膜后26d的牙鲆仔鱼中,Tbx5基因不仅在胸鳍、眼背侧、脊柱和尿囊表达,且在胸鳍和眼背侧的表达呈现左右不对称,左侧面（有眼侧）的表达量均高于右侧面（无眼侧）的表达量。综上结果暗示,牙鲆Tbx5基因可能参与了变态过程中眼睛与胸鳍左右不对称的形成。 研究亮点： 鲽形目鱼类都经历变态发育过程,产生显著的左右不对称形态,但调控该过程的分子机制尚不清楚。本文对牙鲆变态初期仔鱼进行了形态学观察,并对牙鲆Tbx5进行克隆及其表达分析,并探讨Tbx5与牙鲆仔鱼眼睛与胸鳍不对称变态过程的关系,为进一步研究牙鲆变态机制奠定基础。     

Tbx5基因在牙鲆变态初期的表达

鲽形目鱼类仔鱼经过变态后形成眼睛和偶鳍等器官左右不对称的稚鱼。Tbx家族成员参与脊椎动物心脏、肢体和眼等器官的发育,而Tbx基因与鲽形目鱼类变态的关系目前尚无报道。运用扫描电镜和软硬骨染色等方法对出膜后2 d（变态早期）和26 d（变态前期）的牙鲆仔鱼的形态进行观察,牙鲆出膜后2 d胸鳍原基出现,出膜后26 d胸鳍发育成熟,而在出膜后26 d胸鳍和腹鳍仍左右对称。我们克隆了牙鲆Tbx5基因的CDS序列,该序列编码的多肽具有部分T-box保守结构域,与斑马鱼Tbx5同源性高达93%。系统进化分析显示：这段CDS序列与硬骨鱼的Tbx5基因聚为一支,但与四足动物Tbx5相分离。整体原位杂交显示出膜后26 d的牙鲆仔鱼中,Tbx5基因不仅在胸鳍、眼背侧、脊柱和尿囊表达,且在胸鳍和眼背侧的表达呈现左右不对称,左侧面（有眼侧）的表达量均高于右侧面（无眼侧）的表达量。综上结果显示,牙鲆Tbx5基因可能参与了变态过程中眼睛与胸鳍左右不对称的形成。     

瓯江彩鲤体色调控相关因子MC1R的克隆与表达分析

黑素皮质素1受体（melanocortin 1 receptor, MC1R）是动物黑色素合成通路中的关键基因之一,对动物的体色和毛色有重要影响。瓯江彩鲤（Cyprinus carpio var．color）具有5种基本体色类型（“全红”、“粉玉”、“大花”、“粉花”和“麻花”）,其中后3种带有黑色斑点或斑块,是研究动物黑色素合成机制的良好材料之一。克隆了瓯江彩鲤的MC1R基因,并进行了“全红”、“大花”、“粉玉”、“粉花”4种体色间的表达差异分析。研究发现,瓯江彩鲤的MC1R基因的全长cDNA序列为1 914 bp,包括637 bp 5′-UTR（非转录区）、311 bp 3′-UTR及966 bp ORF （开放阅读框）。该基因由一个外显子编码（321个氨基酸）,有7个跨膜结构域。瓯江彩鲤与鲫的编码区核苷酸同源性达98%,与斑马鱼达93%;不同体色间的编码区只存在一个核苷酸无义突变（C/G）,因而氨基酸序列完全相同。qRT PCR表明,MC1R基因在眼睛的表达量显著高于皮肤、肌肉、鳃、肾脏、鳔、心、肝等组织（P<0.05）;但在4种体色间不存在显著的表达差异（P＞0.05）。研究结果表明：瓯江彩鲤体色类型中的黑色斑块不是由MC1R基因直接决定,还有待对其它体色相关基因或调控因子的研究。     

黄颡鱼生长抑素基因的克隆及表达谱分析

【目的】克隆黄颡鱼生长抑素(Somatostatin,SS)基因cDNA全长序列,分析其在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育阶段及成鱼各个组织中的表达规律。【方法】以黄颡鱼脑组织为材料,根据瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰SS基因保守区设计1对引物用于扩增SS基因中间保守区序列,再根据中间保守区序列设计2对引物,分别用于扩增5′端和3′端序列,将扩增得到的中间保守区序列、5′端和3′端序列拼接后得到黄颡鱼SS基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析。用NCBI的Protein Blast对黄颡鱼与其他物种SS基因编码的氨基酸序列同源性进行比较,并构建系统发育树。用实时荧光定量RT-PCR检测SS基因在胚胎发育时期和胚后发育阶段（1～20 d）的表达特征。采用半定量RT-PCR检测SS基因在黄颡鱼脑、心脏、肌肉、胃、肝脏、肾脏、鳃、脾脏、性腺等组织中的表达特征。【结果】黄颡鱼SS基因cDNA全长694 bp,其中5′端非翻译区139 bp,3′端非翻译区211 bp,开放阅读框为345 bp,编码114个氨基酸。黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼SS基因编码氨基酸同源性最高,为98%。系统发育树结果显示,黄颡鱼与同属于鲇形目的瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰聚为一支。SS基因在黄颡鱼受精卵时期就有表达,并持续至胚胎孵化出膜,且在心跳期和出膜期的表达量显著高于受精卵时期(P＜0.05);在出膜后的1～20 d,SS基因在黄颡鱼中稳定表达;在成鱼的各个组织中,SS基因只在脑组织中特异性表达。【结论】初步探明了SS基因在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育阶段及成鱼各组织中的表达规律,推测其可能在黄颡鱼胚胎发育中发挥着重要的生理功能。     

红麻Ms5基因的克隆及多转录本分析

为研究Ms5基因在红麻(Hibiscus canabius L.)花药中的转录特征,以L23A不育系为试材,基于已知的红麻Ms5基因5′端cDNA序列,采用3′RACE和RT-PCR技术对该基因全长cDNA序列进行克隆。序列比对分析结果表明,红麻花药组织中同时存在Ms5基因2种不同的转录本,其长度分别为972和1 105bp,依次命名为HcMs5-α和HcMs5-β。这2种转录本均包含了完整且一致的编码序列,其编码序列(CDS)全长为858bp,预测编码的蛋白质含有285个氨基酸残基,分子质量为32.4ku,理论等电点为7.62;两者5′端前972bp序列完全一致,但3′端的非编码区(UTR)长度有所不同,HcMs5-β在第972bp以后比HcMs5-α多出133bp的序列,具有选择性转录终止的特征。这种转录终止信号的可选择性可能与该基因转录后水平的调控有关。     

凡纳滨对虾繁育相关基因Allatostatin-AR的克隆与表达分析

咽侧体抑制素主要抑制昆虫咽侧体保幼激素的分泌,是昆虫体内重要的神经肽,在甲壳动物体内可能参与繁殖发育的调节。本研究利用RACE PCR技术对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)A型咽侧体抑制素受体(Allatostatin-A receptor,AST-AR)基因进行克隆,获得全长为2 650 bp的cDNA,包括1 425 bp的开放阅读框,1 170 bp 5''非编码区,55 bp 3''非编码区,编码474个氨基酸,形成具有7个跨膜区的不稳定亲水性蛋白。同源性和系统发育分析结果表明凡纳滨对虾AST-AR基因与斑节对虾(Penaeus monodon)、美洲龙虾(Homarus americanus)同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示AST-AR氨基酸TM7后C末端精氨酸在不同物种之间高度保守。实时荧光定量PCR结果显示,AST-AR基因在雌、雄凡纳滨对虾多个组织(眼柄、脑、胃、肝胰腺、鳃、性腺、肠、肌肉)中均有表达,除脑组织外AST-AR基因在雌性凡纳滨对虾中相对表达量高于雄性。在幼体发育中,AST-AR基因的相对表达量随发育阶段上升,同时该基因在不同群体仔虾生长对比实验中表达量差异显著。据此推测AST-AR基因参与凡纳滨对虾的繁殖、幼体发育、幼虾生长到成虾,基因表达基本贯穿凡纳滨对虾的一生。     

七彩神仙鱼Vasa基因cDNA的克隆及表达分析

源自DEAD-box家族的Vasa基因是生殖细胞的分子标记之一。本研究克隆了七彩神仙鱼（Symphysodon haraldi） Vasa基因的全长序列,并进行了不同组织的表达分析。结果表明：七彩神仙鱼Vasa 基因cDNA序列共2 370 bp,其中5''UTR占123 bp,3''UTR为279 bp,ORF编码655个氨基酸,长1 968 bp。氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙鱼的Vasa基因与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的同源性最高。半定量分析表明,Vasa基因在成熟七彩神仙鱼的性腺中特异表达,在其它组织中无表达信号。qRT-PCR结果显示,Vasa在七彩神仙鱼早期胚胎发育阶段及出膜后50日内均有表达。在受精卵至囊胚期阶段,Vasa基因表达持续增加,在囊胚期至孵化期阶段,表达持续降低。在仔鱼阶段,Vasa分别在25日龄和40日龄出现了最低和最高表达量。繁殖前后比较发现,繁殖前的精巢组织中Vasa表达量比繁殖后的表达量低,而卵巢恰好相反。本研究结果可为研究七彩神仙鱼的性分化、生殖细胞分子标记及其发育提供参考。     

青稞耐低氮相关类甜蛋白基因HvTOND1克隆和亚细胞定位研究

为了探索青稞耐低氮相关类甜蛋白基因HvTOND1的基因和蛋白结构特点,为青稞耐低氮分子机制研究提供基础.以青稞'昆仑14'叶片为材料,根据植物基因组数据库Gramene(http://www.gramene.org/)中的大麦HvTOND1(HORVU5Hr1G005300)基因和启动子区域序列设计引物,通过PCR获得...     

水稻地方品种Pi-ta的3'-UTR遗传多态分析

【目的】分析Pi-ta的3'-UTR区遗传变异与该基因抗性功能之间的关系,了解Pi-ta的抗性决定机制,为培养更持久的抗性品种提供依据。【方法】以遗传多样性极高的云南水稻地方品种为研究对象,收集了137个云南地方水稻品种。育苗后提取三叶一心期的水稻幼苗总DNA,设计引物扩增了Pi-ta的3'-UTR区的DNA序列,并扩增了关键功能位点6 640到终止密码子第6 675处这一段的DNA序列。通过双向序列测定获得了137条3'-UTR区的DNA序列并提交至Gen Bank,通过变异位点检测分析云南水稻地方品种Pi-ta的3'-UTR区的遗传多样性程度,并基于最大简约法构建单倍型网络图,分析不同单倍型之间的谱系关系。同时,联合编码区关键抗病位点6 640的碱基状态对3'-UTR单倍型的分布进行分析,讨论3'-UTR区与Pi-ta抗性功能之间的关系。【结果】云南水稻地方品种Pi-ta的3'-UTR区呈现出高度的遗传多样性,长度为1.1 kb的3'-UTR区共有12个SNP位点,由这些SNP可将137个品种划分成7个单倍型。不同单倍型之间没有重组的信号。Pi-ta的3'-UTR对应的DNA编码区长为1 120bp,是植物基因3'-UTR平均长度(200 bp)的5倍多,G+C含量相对较低,为40.43%,不存在插入或缺失导致的长度多态性。Pi-ta的3'-UTR序列中存在多个非保守的潜在poly A位点,此外,Pi-ta的3'-UTR区还存在非常高频率的TTTT序列,提示Pi-ta在转录终止时可能具有复杂的调控机制;而对Pi-ta的不同转录本的分析也表明3'-UTR对应于DNA编码区序列时呈现复杂多变的剪切方式,3'-UTR这种选择性拼接可能与抗性决定作用有关。对遗传多态的进一步分析表明,3'-UTR的SNP高度多态性都出现在感病品种中,所有抗性品种只共享一种单倍型。有趣的是,唯一的3'-UTR抗性单倍型与Pi-ta编码区唯一的抗性单倍型相对应,也即是6 640G所在单倍型也是3'-UTR唯一抗性单倍型。这表明3'-UTR与其编码区是紧密关联的,在功能上和所受到的选择压力方面是连续和一致的。Pi-ta的抗性单倍型区域已从编码区扩展到了3'-UTR区,在研制广谱抗性品种引入Pi-ta时需要同时保证其3'-UTR区不能有额外的SNP,必须是抗性单倍型特有的SNPs。【结论】Pi-ta的3'-UTR与其编码区紧密连锁,抗性品种的3'-UTR受到纯净化选择,维持单一单倍型,3'-UTR对于Pi-ta的抗性功能具有不可或缺的作用。     

猪LPAR3基因克隆及其在子宫内膜细胞的表达

【目的】获得猪LPAR3基因完整mRNA及基因结构,研究其启动子活性;探究LPAR3基因在子宫内膜的转录调控及可能影响母猪产仔的机制。【方法】应用5'RACE和3'RACE技术获取LPAR3基因完整mRNA序列;预测5'调控区潜在的启动子转录因子结合位点及CpG岛,构建不同长度的启动子双荧光素酶报告基因重组载体,与pRL-TK质粒共同转染至猪子宫内膜细胞,检测启动子活性;应用RT-qPCR比较LPAR3基因在妊娠第12天的二花脸猪和长大二元猪子宫内膜的相对表达量;应用亚硫酸氢钠修饰后测序比较LPAR3基因在妊娠第12天的二花脸猪和长大二元猪子宫内膜的甲基化状态。【结果】猪LPAR3 mRNA全长为2 127 bp,其中5'UTR和3'UTR的长度分别为202和860 bp,CDS区为1 065 bp。克隆获得包括LPAR3转录起始位点上游3 080 bp (–2 430/+650bp)的5'调控序列,分析预测显示该调控区不存在TATA box,存在GC元件、CPBP及糖皮质激素受体IR3等调控因子结合位点,且在–190/–84和–44/+651 bp处存在2个潜在CpG岛。成功构建9个不同长度的5'缺失报告重组载体并转染猪子宫内膜细胞。双荧光素酶活性检测结果显示,启动子P4(+454/+80 bp)的转录活性最高,其次是P6(–123/+80 bp)。RT-qPCR结果显示,妊娠第12天二花脸猪LPAR3基因在子宫内膜的表达量高于在其他组织的表达量,且极显著高于在妊娠第12天长大二元猪子宫内膜的表达量,LPAR3在2个猪种子宫内膜均处于低甲基化状态且差异不显著。【结论】猪LPAR3 mRNA全长为2 127 bp,妊娠第12天LAPR3基因在二花脸猪子宫内膜表达高于其在长大二元猪子宫内膜的表达,显示LPAR3可能参与了猪早期妊娠并影响产仔数。     

尾叶桉苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、表达与单核苷酸多态性分析

【目的】通过获得尾叶桉Eucalyptus urophylla苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因序列,分析其在不同水肥处理下的表达模式及在尾叶桉群体中的单核苷酸多态性(SNP),为研究该基因与尾叶桉抗逆性的相关性提供基础。【方法】根据巨桉E.grandis的PAL基因序列设计引物,通过基因克隆、测序获得尾叶桉PAL基因序列;采用逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析该基因在不同水肥处理下的表达模式。【结果】PAL基因组全长4 507 bp,包括166 bp的5′非编码区、411 bp的3′非编码区、2 172 bp的氨基酸编码序列(由2个外显子组成,分别为422和1 750 bp)和1 759 bp的内含子区域。PAL基因在AT4处理中表达量最高,在AT5处理中表达量最低。尾叶桉PAL基因与巨桉具有高度相似性。尾叶桉PAL基因的SNP位点主要集中在内含子区域,可见尾叶桉PAL基因在长期进化过程中保持着稳定的遗传。【结论】获得尾叶桉PAL基因全长4 507 bp,该基因具有遗传稳定性,且可能在尾叶桉抗逆性中起重要作用。     

克氏原螯虾泛素结合酶E2r基因的克隆及表达分析

为了解泛素结合酶E2r基因在克氏原螯虾性腺发育中的作用,利用RACE技术得到了c DNA全序列,命名为Pc-UBE2r。该基因序列全长为3 671 bp,包含泛素结合酶的特有结构域,以及半胱氨酸残基活化位点。开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸,预测蛋白分子量约为27.6 ku。BLAST比对发现,克氏原螯虾UBE2r基因与节肢动物UBE2r基因具有较高的同源性。系统进化分析表明,Pc-UBE2r基因与日本囊对虾聚为一枝。qRT-PCR研究表明,Pc-UBE2r基因在性腺中的表达量显著高于其他组织(P0.05)。在卵巢中,PcUBE2r基因的表达量在未发育期最低,在卵黄发生前期表达量快速增长,随后表达量逐渐降低。在精巢中,Pc-UBE2r基因的表达量在精母细胞发生期达到最高水平。组织原位杂交结果显示,Pc-UBE2r基因在卵巢中均匀分布在未发育期的卵母细胞细胞质中,随后逐渐迁移到卵母细胞细胞核以及滤泡细胞周围。在精巢中,Pc-UBE2r基因主要分布在精母细胞的周围。组织总蛋白Western blot检测发现,UBE2r蛋白在精巢和卵巢中的表达量也显著高于其他组织(P0.05)。综上所述,我们推测Pc-UBE2r基因在克氏原螯虾配子发生和性腺发育方面发挥了重要作用,本研究将为虾蟹类性腺发育调控的分子机制奠定基础和提供依据。     

三角帆蚌KLHL10基因的特征和表达分析

为了探究KLHL10基因在三角帆蚌性别分化中的作用，利用RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）克隆了其cDNA全长，使用实时荧光定量分析比较其在6个不同组织（性腺、鳃、肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜）、早期发育阶段（1~8月龄）性腺及12、24、36月龄雌雄性腺中表达水平的差异，运用RNA干扰（RNAi）对其功能进行初步探究。结果显示KLHL10基因cDNA全长为2 361 bp，其中5''非编码区长93 bp，3''非编码区长447 bp，开放阅读框（ORF区）长1 821 bp，编码606个氨基酸；qRT-PCR结果显示KLHL10基因在精巢中高表达；早期发育阶段在6月龄时表达量最高；12、24、36月龄的表达结果显示，KLHL10基因在精巢中的表达量均高于同时期在卵巢中的表达量（P<0.05）。同时，设计KLHL10基因的3条dsRNA干扰链，结果显示RNA干扰能有效减少KLHL10基因在性腺组织的表达量。根据以上结果推测KLHL10基因在三角帆蚌中是雄性相关基因，其可能参与三角帆蚌的性别分化与精巢发育。     

紫光对斑马鱼皮肤黑色素细胞数量及相关基因表达的影响

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建感紫光短波视蛋白(short-wave-sensitive 1,sws1)基因缺失的斑马鱼突变品系sws1^-/-。检测紫光照射后野生型AB品系和sws1^-/-突变品系在背腹皮肤中黑色素细胞的数量、黑色素合成相关基因pomc和asip、视黄酸合成相关基因raldh2和raldh3的表达量。结果显示:在紫光照射60和100 d后,sws1^-/-斑马鱼背部皮肤黑色素细胞数量显著少于野生型斑马鱼(P<0.05);实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现,pomc基因在紫光照射100 d的sws1^-/-斑马鱼背部皮肤中的表达量显著低于野生型,raldh2在紫光照射100 d的sws1^-/-斑马鱼背部皮肤中的表达量显著低于野生型。研究表明,紫光可能通过SWS1影响背部皮肤raldh2的表达从而影响视黄酸的合成,再通过影响pomc的表达调控黑色素细胞的形成。研究结果为分析紫光基因调控鱼类皮肤黑色素细胞形成的分子机制提供了基础。