我国玉米穗腐病致病镰孢种群及禾谷镰孢复合种的鉴定

为阐明中国玉米镰孢穗腐病的主要致病镰孢菌种类及其分布特征,采用形态学、培养特征及特异性分子鉴定方法,对采集自我国18省100个县的玉米籽粒样品进行分离鉴定,并通过TEF-1α基因序列测定解析禾谷镰孢复合种的构成.结果表明,在我国引起玉米穗腐病的主要致病菌为镰孢菌,分离频率为56.0%,其次还有青霉菌、曲霉菌、木霉菌等.138个镰孢菌分离物中鉴别出7个种及复合种,其中拟轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides(56.5%)和禾谷镰孢复合种F.graminearum species complex(37.7%)为广泛分布的优势致病种类,其余为黄色镰孢菌F.culmorum(2.2%)、层出镰孢菌F.proliferatum(1.5%)、尖镰孢复合种F.oxysporum species complex(0.7%)、茄镰孢复合种F.solani species complex(0.7%)和亚粘团镰孢菌F.subglutinans(0.7%).在禾谷镰孢复合种中鉴定出3个独立种:广泛分布的禾谷镰孢菌F.graminearum sensu stricto(59.6%)、分布在云南、贵州及陕西商洛等南方生态区的南方镰孢菌F.meridionale(25.0%)和分布在内蒙古、吉林、山西、河北及北京等北方生态区的布氏镰孢菌F.boothii(11.5%).     

玉米禾谷镰孢茎腐病和穗腐病抗性鉴定接种方法的比较

田间采用不同人工接种鉴定方法对92份玉米种质同步进行玉米禾谷镰孢茎腐病和穗腐病抗性评价与筛选, 明确了东北春玉米产区玉米禾谷镰孢茎腐病?穗腐病抗性鉴定的最佳接种方法:茎节注射法在玉米禾谷镰孢茎腐病抗性精准鉴定中可更好地评价玉米种质的抗病性, 综合考虑接种方法的实用性和可操作性, 菌土覆盖法对大体量的规模化种质进行田间抗病性鉴定更具有优势; 双牙签法对玉米穗腐病抗性鉴定中在种质接种后发病的严重度?田间进行接种的可操作性和实用性等方面均优于花丝通道法?同时筛选出对玉米禾谷镰孢茎腐病抗性稳定的种质52份, 对穗腐病抗性稳定的种质66份, 对2种病害均表现稳定抗性的兼抗种质33份?     

春玉米区穗腐病病原菌组成、分布及禾谷镰孢复合种的鉴定

 本研究对2015年收集的春玉米区玉米穗腐病样本的病原菌进行了分离鉴定。结果表明,禾谷镰孢复合种(Fusarium graminearum species complex)的总分离频率最高,为35.90%,为优势菌。进一步分析显示,山西、河北、吉林和黑龙江省以禾谷镰孢复合种为主,分离频率分别为81.25%、 75.00%、 44.00%和44.44%;内蒙古以拟轮枝镰孢菌(F. verticillioides)为主,分离频率为56.25%;辽宁省拟轮枝镰孢菌和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的分离频率分别为34.48%和31.03%;而在陕西省,禾谷镰孢复合种、拟轮枝镰孢菌和亚粘团镰孢菌(F. subglutinans)分离频率均为28.57%。以禾谷镰孢复合种的EF-1α基因序列为基础构建系统发生树,进一步对分离到的禾谷镰孢复合种进行亚种鉴定。结果表明,春玉米区禾谷镰孢复合种为禾谷镰孢菌和布氏镰孢菌,且以布氏镰孢菌为主。     

禾谷镰孢漆酶样多铜氧化酶的鉴定及其表达模式

 子囊菌禾谷镰孢(Fusarium graminearum)可侵染玉米茎部造成严重的玉米茎腐病。漆酶样多铜氧化酶(Laccase-like multicopper oxidase)具有广泛的作用底物且在植物病原真菌中参与病菌侵染,促进病菌定殖。利用已知真菌漆酶的蛋白序列在禾谷镰孢中鉴定得到14个漆酶样多铜氧化酶,分属5种亚家族。通过对其在侵染玉米茎部不同时间后的芯片数据分析表明FGSG_02142、FGSG_05159在菌丝、孢子及侵染各阶段表达量均较高,FGSG_02328、FGSG_13185和FGSG_00142在侵染阶段表达量明显增加,其他基因表达量相对较低;试验进而利用qPCR检测了部分差异基因在接种玉米感病种质资源B73和抗病种质资源Mo17中的相对表达量,结果显示,禾谷镰孢FGSG_00142基因在B73中的表达量明显高于在抗病材料Mo17中的表达量,而毒素相关基因FGSG_02328在接种Mo17时表达也出现延迟,推测这2个基因均参与了禾谷镰孢的侵染过程。     

禾谷镰孢漆酶样多铜氧化酶的鉴定及其表达模式

 子囊菌禾谷镰孢(Fusarium graminearum)可侵染玉米茎部造成严重的玉米茎腐病。漆酶样多铜氧化酶(Laccase-like multicopper oxidase)具有广泛的作用底物且在植物病原真菌中参与病菌侵染,促进病菌定殖。利用已知真菌漆酶的蛋白序列在禾谷镰孢中鉴定得到14个漆酶样多铜氧化酶,分属5种亚家族。通过对其在侵染玉米茎部不同时间后的芯片数据分析表明FGSG_02142、FGSG_05159在菌丝、孢子及侵染各阶段表达量均较高,FGSG_02328、FGSG_13185和FGSG_00142在侵染阶段表达量明显增加,其他基因表达量相对较低;试验进而利用qPCR检测了部分差异基因在接种玉米感病种质资源B73和抗病种质资源Mo17中的相对表达量,结果显示,禾谷镰孢FGSG_00142基因在B73中的表达量明显高于在抗病材料Mo17中的表达量,而毒素相关基因FGSG_02328在接种Mo17时表达也出现延迟,推测这2个基因均参与了禾谷镰孢的侵染过程。     

FpStuA参与假禾谷镰孢的产孢和致病性

 假禾谷镰孢是一种土传真菌,其引起的小麦茎基腐病已成为威胁我国小麦生产的重要病害。APSES蛋白是真菌中保守存在的一类转录因子,参与多种细胞生理过程。本研究,我们在假禾谷镰孢中鉴定到StuA同源蛋白FpStuA。qRT-PCR分析发现FpStuA在假禾谷镰孢分生孢子和侵染阶段诱导表达。通过PEG介导的原生质体转化方法获得3个FpStuA基因缺失的突变体。与假禾谷镰孢野生型菌株相比,Δfpstua突变体的生长速度明显减慢,气生菌丝减少;分生孢子的产生比野生型减少70%,且Δfpstua突变体分生孢子变短、分隔减少;Δfpstua突变体对大麦叶片、小麦胚芽鞘和小麦根的致病性均显著降低,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)合成明显减少。综上结果,转录因子FpStuA对假禾谷镰孢的生长、产孢和致病性都非常重要。     

引起玉米穗腐病的两种镰孢菌双重PCR快速检测体系的建立

禾谷镰孢(Fusarium graminearum)和拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)是引起玉米穗腐病的两种主要病原菌。为了建立这两种病原菌的快速和定量检测体系,本研究分别设计了针对F.graminearum和F.verticillioides的基因特异性引物,建立了双重PCR反应体系,并从DNA浓度、引物浓度和退火温度3个方面对反应体系进行了优化。结果表明,退火温度为54℃和58℃时扩增效果较好,DNA模版的检测灵敏度可以达到6.25 ng·μL~(-1);F.graminearum和F.verticillioides引物最佳终浓度配比为0.2μmol·L~(-1)/0.4μmol·L~(-1)。本研究建立的双重PCR对同时鉴别引起玉米穗腐病的两种主要镰孢菌提供了准确、快速、灵敏的检验检疫技术。     

禾谷镰孢菌产玉米赤霉烯酮毒素zearalenone的PCR检测

玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEN）是由镰孢菌产生的真菌毒素,该毒素具有雌性激素生物活性。PKS4基因是禾谷镰孢菌中玉米赤霉烯酮生物合成途径中的必需基因。根据PKS4基因序列,设计一对PKS4基因特异性引物,通过检测PKS4基因的存在间接检测ZEN毒素的产生。特异引物在禾谷镰孢菌菌株以及被禾谷镰孢菌侵染的小麦籽粒中都能稳定地扩增出大小为1 076 bp的特异片段,扩增片段与PKS4基因（DQ019316）相同区段序列相似性达99.63%。同时,酶联免疫吸附法（ELISA）验证了PCR的检测结果,证明了该技术的可靠性。     

禾谷镰孢单端孢霉烯族毒素在小麦组织中的积累

 本试验将禾谷镰孢一高产毒菌株B4-1采用单小花注滴法接种于小麦抗赤霉病品种苏麦3号和感病品种宁麦6号,用气/质联检法测定接种后4、8、12、16和20 d组织中的单端孢霉烯族毒素积累量。结果显示,在病组织中有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol,15-ADON)和3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol,3-ADON)等3种单端孢霉烯族毒素,但未发现雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol)和镰刀菌酮-X (fusarenon-X)等毒素。抗病品种病穗组织中,DON平均含量由接种后4 d的29.5 μg/g dry weight (gdw)下降到20d时的15.7μg/gdw,15-ADON和3-ADON量则较低,分别为1.5~3.6μg/gdw和<1.7μg/gdw;而同期感病品种病穗组织中的DON量则由23.1μg/gdw上升到47.7μg/gdw,15-ADON和3-ADON量均较高,分别达8.6~10.0μg/gdw和2.6~8.3μg/gdw。在抗、感病品种无症状穗组织中,3种毒素的含量均很低(<0.5 μg/gdw)。同时,本研究还首次在感病品种的穗颈(总花梗,peduncle)组织中检测到大量的DON和15-ADON及少量的3-ADON。     

咯菌腈和戊唑醇复配对假禾谷镰孢菌丝生长及所致病害的影响

为筛选对小麦茎基腐病安全且有效的药剂组合,本研究采用菌丝生长速率法检测不同作用机制的杀菌剂咯菌腈与戊唑醇复配对病原菌假禾谷镰孢的毒力,筛选出最佳增效组合,进而利用温室苗期生物测定明确复配药剂的安全性及防治效果,最后利用qPCR检测复配药剂对小麦根际土壤及茎秆中病原菌的影响。结果表明：咯菌腈与戊唑醇质量比为1∶7的复配药剂对假禾谷镰孢菌丝生长毒力最强,平均增效系数为7.22;该组合复配种衣剂在3个不同抗性小麦品种上温室苗期防治效果分别为73.35%、62.59%和82.07%,显著高于同剂量的两个单剂,且兼有促生作用;对小麦根长、鲜质量分别提高了2.81%～12.33%和18.87%～49.21%。通过qPCR检测发现,使用该复配药剂与空白对照相比假禾谷镰孢含量在小麦根际土壤中降低76.95%～90.37%,在小麦茎秆组织中降低92.00%～96.70%。验证了咯菌腈与戊唑醇质量比为1∶7的复配剂可通过降低土壤和小麦茎秆组织中病原菌的含量从而达到防治效果。本研究为小麦茎基腐病的化学防治提供新的参考依据。     

应用PCR技术检测玉米中的禾谷镰刀菌

本实验通过用PCR方法来实现对禾谷镰刀菌的快速检测,经对霉变玉米样品、玉米茎腐病组织及玉米穗腐病标本的检测,证明该方法是一种高效、灵敏的方法,具有重要的实际应用价值.     

玉米穗腐病和茎基腐病镰孢菌间相关性的RAPD分析

 利用随机扩增多态性DNA (RAPD)技术对玉米穗腐病和茎基腐病镰孢菌之间的相互关系进行了研究,证实了引起2种病害的串珠镰孢菌同源性很高,在遗传上具有较高的相似性,病菌不易受地域或环境和寄生部位选择作用的影响,同一类型的串珠镰孢菌可以是穗腐病和茎腐病的共同病原菌。禾谷镰孢菌间的遗传变异性很强,易受地域、环境和寄生部位选择作用的影响,出现明显的分化现象,穗腐病和茎基腐病可以由同一禾谷镰孢菌分化类型侵染所致,也可由不同分化类型侵染所致。     

安徽省玉米穗腐病主要致病镰孢菌的分离与鉴定

为明确安徽省玉米穗腐病主要致病镰孢菌的种类,采用单孢分离、形态学鉴定和分子生物学鉴定的方法,对2017年采集自安徽省6个玉米主产区——合肥市、蚌埠市、淮北市、阜阳市、亳州市和宿州市的玉米穗腐病病样进行了分离鉴定。在获得的455株镰孢菌中,拟轮枝镰孢菌、禾谷镰孢复合种、层出镰孢菌、尖孢镰孢菌和黄色镰孢菌的分离频率分别为59.13%、21.28%、13.68%、5.12%和0.79%。其中拟轮枝镰孢菌在各地的分布最广,属于安徽省的优势致病镰孢菌。     

高温胁迫对禾谷镰孢生长和致病力的影响

为探究高温胁迫对禾谷镰孢生长和致病力的影响, 本研究测定了禾谷镰孢5株耐高温菌株和4株温度敏感型菌株在25℃和30℃下的菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率以及不同胁迫压力下的生长速率、致病力和DON毒素含量等。结果表明, 不论耐高温菌株还是温度敏感型菌株, 30℃高温对其菌丝生长均有抑制作用, 但对产孢量和孢子萌发有促进作用;30℃高温能减轻NaCl和CaCl2胁迫对禾谷镰孢生长的抑制, 但是不影响KCl、刚果红, SDS和H2O2对病原菌的抑制作用;在30℃下, 大部分耐高温菌株的致病力不变或降低, 而大部分温度敏感型菌株的致病力反而增加, 30℃对大部分菌株的DON毒素产量有一定促进作用。研究结果可为研究气候变化下小麦赤霉病的流行和预测提供理论基础。     

小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性研究

测定了1976 年从江苏南京采集的54 株小麦赤霉病菌菌株对多菌灵的敏感性,EC50值在0. 2617～ 0. 6544 μg. mL - 1 之间, 1983 年在同一地点采集的76 株, EC50 值相应为0. 2517～ 0. 7050 μg. mL- 1 , 而1998 年从浙江、湖北、上海、福建、安徽、江苏各地采集的104 株菌株EC50值为0. 2478～ 6. 4574 Lg. mL- 1 , 表明湖北、上海、浙江等地田间已检测到小麦赤霉病菌抗多菌灵菌株。紫外光诱导分生孢子也获得了该病菌抗多菌灵突变株, 其EC50 值为14. 1993 Lg. mL - 1 。抗药性突变体JPR 与敏感亲本菌株JPS 相比, 在菌丝生长、产孢量方面无明显差异, 但JPR 孢子萌发率为57. 1% , 而JPS 为100% , 而且50% 孢子萌发的时间较野生亲本菌株滞后12 h。JPR 产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON 毒素) 3. 90 μg mL - 1 , 而JPS 产生的DON 毒素为9. 28μg. mL - 1 。     

一种用玉米拟轮枝镰孢穗腐病病粒制备接种体的简易方法

制备接种体是玉米穗腐病抗性鉴定中的一个重要环节, 本研究提出了一种用玉米拟轮枝镰孢穗腐病病粒制备接种体的简易方法, 即将上年的拟轮枝镰孢穗腐病带菌病粒按一定重量加入无菌水洗脱制成接种体。田间接种试验结果表明, 采用本方法简易制备的接种体接种后可获得与常规制备接种体相当的接种效果, 且在-18℃冻存15 d仍可达到新鲜的常规制备接种体接种后的水平。使用简易制备接种体对33个玉米品种进行了田间穗腐病抗性鉴定, 21个品种表现为感病或高感。与实验室常规培养制备接种体的方法相比, 本制备方法简便易操作, 用时短, 成本低, 无需专业仪器设备, 能够一次制备大量接种体, 可广泛用于玉米种质材料和新品种的拟轮枝镰孢穗腐病田间抗性鉴定及抗性材料筛选等。     

Effects of carbendazim on conidial germination and mitosis in germlings of Fusarium graminearum and Botrytis cinerea

The effects of carbendazim on carbendazim-sensitive (wild-type) and -resistant strains of Fusarium graminearum and Botrytis cinerea were compared. When treated with carbendazim, conidia and germlings of wild-type F. graminearum and B. cinerea germinated and grew to produce stunted, distorted, and abnormally branched germlings; in addition, distinct nuclei were replaced by irregularly distributed chromosome masses, and normal nuclear division was not observed. The CMI (chromosome mitosis index) values of wild-type strains rapidly increased within 60 min of treatment with carbendazim and then rapidly declined. Whereas the wild-type strains of the two fungi responded similarly, the carbendazim-resistant strains of F. graminearum and B. cinerea responded differently to carbendazim. The resistant strain of F. graminearum showed normal mitosis but produced significantly more branches and higher CMI values when treated with carbendazim than when untreated. In contrast, the carbendazim-resistant strain of B. cinerea exhibited normal morphology and mitosis after carbendazim treatment. The results suggest that the mechanism for carbendazim resistance in F. graminearum differs from that in B. cinerea and other fungi.     

陕西省小麦禾谷镰刀菌的遗传多样性研究

为了明确陕西省小麦禾谷镰刀菌混合群(Fusarium graminearum species complex)的遗传多样性,利用4对E coRⅠ和M seⅠ引物对来自陕西省19个区县的162株小麦禾谷镰刀菌菌株进行了AFLP扩增。结果表明,4对引物均能扩增出数量不等的多态性条带,最少的6条,最多的20条,大部分扩增片段在100～750bp之间。利用NTSYS-2.1软件聚类分析表明,不同地区禾谷镰刀菌可分为两大类群,即类群A和类群B。这两大类群的分化和地理来源有明确相关性,类群A主要分布在关中地区,类群B主要分布在陕南地区。初步判断可能与两个地区生态环境和小麦主栽品种差异有关。各类群内的菌系与地理位置间的关系较为复杂,一些菌系与地理来源存在明确关系,而个别菌系与地理来源间的关系尚不能完全明确。还需进一步研究以明确各菌株与地理来源之间的关系。