二倍体和四倍体泥鳅IGFBP-1基因的表达及其与DNA甲基化的相关性

为探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)基因在二倍体和四倍体泥鳅之间的表达差异及其与DNA甲基化的相关性,克隆二倍体、四倍体泥鳅的CDS序列和启动子序列,并分别采用qRT-PCR和亚硫酸氢盐测序技术(BSP)分析IGFBP-1在二倍体、四倍体泥鳅中的表达水平及启动子区和第一外显子区的甲基化水平。结果显示,泥鳅的IGFBP-1基因CDS序列长789bp,编码262个氨基酸,二倍体、四倍体泥鳅间有5bp的差异,但氨基酸序列完全相同。在二倍体、四倍体中分别克隆得到2 341bp和2 331bp的启动子序列,倍性间的序列相似度达99%,启动子序列中包含典型元件TATA-box,以及SP1、CREB、C/EBP、POU2F2、GATA-2/3/4和SRY等转录因子结合位点。泥鳅的IGFBP-1基因主要在肝脏中表达,且四倍体泥鳅肝脏中IGFBP-1的表达水平显著高于二倍体(P0.01)。四倍体泥鳅IGFBP-1基因启动子及第一外显子区的甲基化水平均比二倍体低,其中四倍体肝脏中的甲基化水平显著低于二倍体(P0.01)。综合分析研究结果表明,在IGFBP-1基因主要表达的肝脏组织中,其mRNA表达水平与DNA甲基化水平呈负相关,启动子区较高的甲基化可能抑制了二倍体泥鳅IGFBP-1基因的表达。     

泥鳅二倍体与四倍体trim63a基因的克隆及表达分析

试验以泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus,Ma)为研究对象,采用PCR技术克隆获得trim63a基因(tripartite motif containing 63,又名肌肉环状指基因1)的cDNA部分序列,生物信息学分析结果显示,Matrim63a基因cDNA的编码序列(coding sequence,CDs)为1 035bp,编码344个氨基酸,与硬骨鱼类相似度较高。采用荧光定量PCR技术检测人工繁殖获得的二倍体(D×D)和四倍体(T×T)胚胎不同发育时期Matrim63a的表达量以及泥鳅二倍体(D)和四倍体(T)成鱼不同组织中Ma-trim63a的表达量,基因表达分析结果显示,Ma-trim63a在泥鳅二倍体和四倍体成鱼肌肉中的相对表达量最高,其次是心脏;Ma-trim63a在泥鳅二倍体和四倍体胚胎的13个发育时期均有表达,但是不同倍性的胚胎表达差异较大。     

西南大西洋公海阿根廷滑柔鱼性成熟的初步研究

根据2007年2—5月我国鱿钓船在西南大西洋公海生产期间所采集的阿根廷滑柔鱼（南部巴塔哥尼亚种群）数据,对其性成熟进行分析。结果表明,渔获物雌雄比例约为1．1：1。雌雄性腺成熟度差异大,雄性个体性成熟度高于雌性。雄性Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期占总样本的78．4％,雌性仅占48．1％。雌性群体3月开始大批量性成熟,4月开始大批量产卵;雄性群体2月即开始大量性成熟,并开始交配。经拟合,南部巴塔哥尼亚种群雌雄个体初次性成熟胴长（ML50%）分别为264．9mm和208．5mm。     

西南大西洋公海阿根廷滑柔鱼性成熟的初步研究

根据2007年2—5月我国鱿钓船在西南大西洋公海生产期间所采集的阿根廷滑柔鱼（南部巴塔哥尼亚种群）数据,对其性成熟进行分析。结果表明,渔获物雌雄比例约为1．1：1。雌雄性腺成熟度差异大,雄性个体性成熟度高于雌性。雄性Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期占总样本的78．4％,雌性仅占48．1％。雌性群体3月开始大批量性成熟,4月开始大批量产卵;雄性群体2月即开始大量性成熟,并开始交配。经拟合,南部巴塔哥尼亚种群雌雄个体初次性成熟胴长（ML50%）分别为264．9mm和208．5mm。     

黄颡鱼胰岛素样生长因子结合蛋白1基因的克隆及表达分析

为研究黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)胰岛素样生长因子结合蛋白1基因(IGFBP1)的特征,阐明IGFBP1基因在不同性别黄颡鱼组织中的表达特征和IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉中的表达差异,克隆IGFBP1基因的c DNA全长,并进行实时荧光定量PCR检测和Western Blot分析。结果表明:黄颡鱼IGFBP1基因c DNA全长为1 259 bp,其开放阅读框长度为714 bp,编码237个氨基酸,3'端和5'端非翻译区分别为407 bp和138 bp;黄颡鱼IGFBP1基因核苷酸序列与鲇形目斑点叉尾鮰的相似度(89%)较高,与鲢、鲤、鲫、草鱼和团头鲂等的差异较大;肝脏是黄颡鱼IGFBP1基因m RNA表达最丰富的组织,IGFBP1基因在雄性个体心脏、肾脏、肌肉和肠组织中的表达量显著高于雌性的(P0.05);IGFBP1蛋白在雌、雄黄颡鱼肌肉组织中都有表达,且在雄性个体中的表达量高于在雌性个体中的表达量。     

二倍体和四倍体泥鳅全基因组DNA甲基化的比较

以二倍体和四倍体泥鳅为研究对象,采用甲基化修饰依赖性内切酶测序技术(MethylRAD-Seq)在全基因组水平上分析泥鳅的DNA甲基化特点及倍性间的DNA甲基化变异。测序结果共得到302 111 684条Methyl-RAD序列标签。与参考基因组比对结果显示,泥鳅的甲基化位点主要分布在基因体区(gene body),其次为内含子区(intron)和基因间区(intergenic),而在其他功能元件上的分布较少。四倍体泥鳅的整体甲基化水平比二倍体高,尤其是在第一外显子区(1st Exon)和转录起始位点上游1 500bp至200bp区(TSS1500),且倍性间差异极显著(P0.01)。但在启动子区,四倍体泥鳅的甲基化水平略低于二倍体。在二倍体和四倍体泥鳅间共筛选到1 268个差异甲基化CmCGG位点和14个差异甲基化CmCWGG位点,这些位点主要分布于内含子、基因体和基因间区。比较各基因的甲基化水平,共得到684个倍性间差异甲基化基因。KEGG分析结果显示,倍性间差异甲基化基因主要富集到与生长发育、免疫及错配修复等相关通路上。     

中华鲟促甲状腺激素β亚基基因（TSHβ）cDNA序列的克隆及其表达分析

【目的】克隆中华鲟(Acipenser sinesis)促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因,分析其序列特征和进化特征,研究其在中华鲟中的组织表达特征和不同年龄垂体中的差异表达,为中华鲟生长发育调控研究提供基础数据。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE),克隆中华鲟TSHβ,对其cDNA序列及其推导的氨基酸序列进行序列特征分析和系统发生分析;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,对TSHβ-mRNA在中华鲟肝、心、脾、性腺、肠、垂体、下丘脑、中脑、端脑、小脑和延脑等组织中的表达状况,以及在1,3,5龄中华鲟个体垂体中的表达差异进行研究。【结果】克隆获得TSHβ基因,该cDNA序列全长649bp,5′和3′端非编码区分别为142和75bp;开放阅读框432bp,编码143个氨基酸。TSHβ亚基成熟多肽含有12个半胱氨酸(Cys)和2个N连糖基化位点。氨基酸序列多重比对表明,中华鲟TSHβ与促滤泡激素β亚基和促黄体激素β亚基的一致性分别为36%和35%,但与糖蛋白激素α亚基的一致性约为10%。与其他脊椎动物的TSHβ氨基酸序列进行比对发现,中华鲟TSHβ亚基与西伯利亚鲟一致性最高(98%);与鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类的序列一致性分别约为44%,55%,56%和60%;脊椎动物TSHβ的Cys和N连糖基化位点位置高度保守。TSHβ亚基仅在中华鲟垂体中有表达;3龄雄性个体垂体中TSHβ的表达量约为1龄的9倍,3龄和5龄雌性个体垂体中的表达量均约为1龄的5倍左右。【结论】成功获得了中华鲟TSHβ亚基基因,该基因具有与其他动物TSHβ相似的结构和表达特征;雄性个体表达量高于雌性个体,其在中华鲟个体的生长发育过程中表达量上升。     

三角帆蚌中WNT4基因克隆及表达分析

为进一步了解WNT4在三角帆蚌性别决定过程中的作用,通过RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆获得了三角帆蚌WNT4基因的全长cDNA,共1560 bp,其中5’-UTR 396 bp、3’-UTR 24 bp,开放阅读框（ORF）为1140 bp,可以编码379个氨基酸,且该序列含有Wnt家族特有结构域。对WNT4的氨基酸序列进行同源性分析后,发现该基因在物种间的进化关系和结构功能具保守性。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现WNT4基因在三角帆蚌雌雄多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、性腺、斧足和肝)均有表达,表明其参与了多样的生物学过程,在腮、斧足、肝中表达量较高,在性腺、闭壳肌、斧足中雌雄间有显著性差异,且雌性三角帆蚌的性腺、闭壳肌表达量显著高于雄性。原位杂交结果显示,WNT4在雌性三角帆蚌的卵母细胞上有明显的杂交信号,推测WNT4基因与性别决定相关。     

海兰鸡主要脏器重量及脏器系数的测定

以10只（雌雄各半）280 d海兰鸡为材料,比较雌雄个体体重和14个主要脏器重量及系数的差异。结果表明,雄性海兰鸡体重及腺胃、胸腺重量显著高于雌性（P〈0.05）,心脏重量极显著高于雌性（P〈0.01） 雄性海兰鸡心脏系数极显著高于雌性（P〈0.01）,脾脏和胸腺系数显著高于雌性（P〈0.05）,肝脏系数显著低于雌性（P〈0.05） 其他脏器重量及系数差异均不显著。     

罗氏沼虾淀粉酶基因克隆及其表达规律分析

【目的】克隆罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）淀粉酶基因（AMY）,并进行生物学信息分析及其表达规律研究,为揭示AMY基因的生物学功能及其对罗氏沼虾生长发育的调控作用机理提供理论依据。【方法】PCR克隆罗氏沼虾AMY基因编码区（CDS）序列,利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、SignalP-5.0、MegAlign及Lasergenev8.0等在线软件进行生物信息学分析,应用实时荧光定量PCR检测AMY基因在罗氏沼虾不同组织（腹神经节、胃、心脏、鳃组织、性腺、肝胰腺、肌肉和肠道）中的表达情况,并明确其在生长快速家系（FG）和生长慢速家系（SG）个体肌肉中的表达模式。【结果】罗氏沼虾AMY基因CDS序列全长2121 bp,共编码706个氨基酸残基;其编码蛋白分子量为76.87 kD,理论等电点（pI）为4.63,属于不稳定的亲水性蛋白,包含2个典型的淀粉酶结构域;在罗氏沼虾AMY蛋白二级结构中,α-螺旋占13.88%,延伸链占21.39%,无规则卷曲占64.73%。罗氏沼虾AMY氨基酸序列与克氏原螯虾AMY氨基酸序列的相似性最高（62.6%）,与大珠母贝AMY氨基酸序列的相似性较低（48.9%）;基于AMY氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,罗氏沼虾与克氏原螯虾的亲缘关系最近,而与中华绒螯蟹的亲缘关系较远。AMY基因在罗氏沼虾不同组织中广泛表达,但存在性别差异性和组织特异性,具体表现为:雌性个体肠道中的相对表达量极显著高于雄性个体（P<0.01,下同）,鳃组织中的相对表达量显著高于雄性个体（P<0.05）,而肝胰腺中的相对表达量极显著低于雄性个体。罗氏沼虾AMY基因在FG个体肌肉中的相对表达量极显著高于SG个体。【结论】AMY基因在罗氏沼虾的生长发育过程中发挥重要作用,广泛表达于罗氏沼虾的不同组织中,但存在性别差异性和组织特异性。     

泥鳅cyp19a1基因克隆及其在倍性间的表达差异

克隆并分析泥鳅cyp19a1a的全长cDNA和5′侧翼序列,用qRT-PCR技术比较cyp19a1a在二倍体、四倍体泥鳅组织间和倍性间的表达差异.结果发现,泥鳅cyp19a1a的cDNA全长1905 bp,包括29 bp的5′TR、301 bp的3′UTR和1575 bp的ORF序列,其氨基酸序列中存在I-螺旋区、芳香...     

雌雄泥鳅不同组织同工酶特异性表达分析

应用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳方法研究了泥鳅雌雄成体的肝脏、心脏、脑、性腺、肌肉、血液等6种组织中EST、SOD、G6PDH、ALP、ADH等5种同工酶的表达情况。结果表明,泥鳅5种同工酶不仅存在不同程度的组织差异,而且雌雄个体间也存在较大的差异。大部分同工酶在肝脏和卵巢中表达活性较高,且同工酶类型较多;雌雄个体间存在EST-5两条雌性特异性条带,可作为泥鳅雌雄个体的生化遗传标记,也可为泥鳅性别决定机制的研究提供线索。     

所罗门群岛海域长鳍金枪鱼繁殖生物学初步研究

根据2012年9-12月所罗门群岛海域采集的307尾长鳍金枪鱼样本,分析其性别比、性腺成熟度和性腺指数等繁殖生物学参数。结果表明：繁殖群体总性别比和性成熟个体性别比均不符合1：1（P〈0．05）,雄性个体比例大于雌性,性别比在产卵期间出现一定波动,但普遍小于1：1。性别比与个体大小密切相关,雄性比例随叉长增长而降低。性成熟度分析表明,产卵期间性成熟个体比例达到70％以上,其中存在大量的产卵后群体,未成熟比例较低。雌性不同性成熟度大小差异明显（P〈0．05）,但雄性并不明显（P〉0．05）。相同性成熟度雄性个体平均叉长均大于雌性,但并没有体现出一致的变化。雌、雄个体初次性成熟叉长分别为84．88cm和85．61cm。性腺指数（Gsi）在各性成熟度和叉长组间存在显著差异（P〈0．05）,雌性GSI大于1．2几乎全部为成熟个体,尤其GSI大于2普遍为即将产卵（V期）和产卵后（Ⅵ期）群体;雄性个体GSI普遍小于2,各叉长组雌性GSI普遍高于雄性,这表明雌性性腺发育较快。而调查期间9月GSI均值明显高于其他3月（P〈0．05）,综合分析认为该海域长鳍金枪鱼9—10月达到产卵高峰期。     

东海北部外海剑尖枪乌贼渔业生物学特征

根据2017和2018年的9月—翌年2月拖网渔船在东海北部外海采集的剑尖枪乌贼样本,研究其基础生物学特征。结果表明,个体的优势胴长和体质量组雄性分别为100～180 mm和40～160 g(n=309尾),雌性分别为80～160 mm和40～160 g(n=304尾),雌雄个体的胴长和体质量年间不存在差异。协方差分析(ANCOVA)表明,雄性个体体质量-胴长关系年间差异显著(P0.05),而雌性年间差异不显著(P0.05)。性成熟胴长雄性主要集中在大于120 mm的个体,雌性为大于140 mm的个体,并且呈现出较小体型下即可达到性腺成熟的趋势。雌性个体的胴长和体质量生长速率略快于雄性,并且雌雄个体的体质量生长率年间差异较大。综合分析认为:两年间采样的剑尖枪乌贼种群为春季和夏季产卵种群,2018年样本中夏季产卵种群的幼体数量较多。因此,研究剑尖枪乌贼渔业生物学动态特征是资源持续开发和渔业管理的基础。     

二倍体及其同源四倍体酸枣的生理特征和转录组分析

目的研究酸枣基因组复制后分子水平的变异机制,为深入探讨枣树多倍体性状、关键调控基因的克隆及基因工程育种提供参考。方法本实验以二倍体及其同源四倍体酸枣为研究材料,比较了二者的叶片相对含水量、叶绿素含量、可溶性糖含量以及可溶性蛋白质含量,对两种材料进行了转录组测序,并参考GO Ontology、KEGG等数据库对差异基因和转录因子进行功能分类与富集分析。结果四倍体的叶绿素含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白质含量均显著高于二倍体植株,叶片相对含水量在两种材料中没有显著差异。二倍体与四倍体酸枣共1 329个基因具有显著差异,GO功能分析表明这些差异基因主要参与生长发育和胁迫耐受相关功能。KEGG通路分析显示,大部分差异基因富集在碳水化合物代谢、氨基酸代谢和信号传递过程,其中16个关键基因参与糖和氨基酸的代谢与转运过程,如SPS2、GAE6和PGDH3,这些基因在四倍体中具有较高的表达量;23个基因参与激素信号传导通路,其中与生长素传导、应答相关的基因如ARG7,GH3.6和IAA26在四倍体植株中表达量较高,而与油菜素内酯合成酶（CYP）、乙烯不敏感蛋白（EIN）相关的基因在四倍体植株中表达量较低。在对二倍体与四倍体差异转录因子的分析中发现,四倍体MYB转录因子家族基因表达量高于二倍体。结论四倍体叶片叶绿素含量高是植株叶色加深的原因之一,可溶性糖、可溶性蛋白质含量高为四倍体叶片变大、茎加粗提供了更多能源物质。参与糖、氨基酸代谢和激素合成、信号传导的关键基因在二倍体与四倍体中差异表达,可能与四倍体植株体内能源物质含量高、生长势强的性状相关;具有渗透调节功能的基因在四倍体中表达量较高暗示着四倍体可能具有较强的抗性。进一步对差异转录因子的分析表明,MYB转录因子在二倍体与四倍体植株中的差异表达可能会导致植物在生长发育、形态建成和抗逆过程中的差异,但二者的具体差异性状还需进一步的实验研究。      

斑节对虾腺苷酸转移酶(PmANT)基因的cDNA克隆与表达分析

利用RACE技术获得了斑节对虾(Penaeus monodon)ANT基因(PmANT)的cDNA序列。该序列全长1 388 bp,开放阅读框(ORF)为930 bp,3’非编码区(UTR)为393 bp,5’非编码区(UTR)为65 bp。ORF可编码309个氨基酸,分子量大约为33.622 ku。与所有ANT家族成员一样,PmANT蛋白具有3个重复同源的线粒体跨膜结构域,但不含信号肽和糖基化位点。相似性、同源性及系统进化树分析显示,斑节对虾的ANT基因与凡纳滨对虾的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了ANT基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明:PmANT的mRNA在各组织中都有表达,其中,在雄性个体的肌肉中表达量最高,其次为雌性肌肉,在精巢的表达量最低,且未成熟精巢低于成熟精巢。PmANT的mRNA在卵巢的表达量高于精巢,且在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅳ期最低。为今后进一步研究该基因在斑节对虾性腺发育中的作用提供基础材料。     

秘鲁外海茎柔鱼胴长组成及性成熟初步研究

根据2001年6-8月我国鱿钓船对秘鲁外海（79°～90° W、5°～16° S）茎柔鱼资源的调查,对其胴长组成和性成熟作了初步分析.结果表明,渔获物胴长范围为200～880 mm,优势胴长为240～480 mm,约占总数的80%左右.依据胴长组成和性成熟度,调查海域茎柔鱼存在3个群体.雌雄性别比为2.52∶1.00.渔获物中,雄性个体的性成熟度高于雌性,雄性Ⅲ和Ⅳ期占总数84.3%,雌性仅占47.5%.同一性成熟阶段,雌性个体的胴长范围均大于雄性.经估算,雌性和雄性个体的初次性成熟胴长分别为374 mm、228 mm.     

中国洪湖不同倍性泥鳅的染色体组型及形态特征比较分析

以中国洪湖自然二倍体、三倍体、四倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus为研究对象,运用经典的形态测量观察方法、染色体制片技术对不同倍性泥鳅的染色体组型、形态特征进行比较分析。结果表明：1）二倍体泥鳅2n=50,核型公式为10m＋4sm＋36t,NF=64;三倍体泥鳅3n=75,核型公式为15m＋6sm＋54t,NF=96;四倍体泥鳅4n=100,核型公式为20m＋8sm＋72t,NF=128;2）5个比例性状测量结果显示,二倍体与四倍体很接近,没有表现出明显的差异,但两者与三倍体在眼后头长/体长（PL/SL）、后头部到鳃的距离/体长（LOOSR/SL）、背鳍前端到尾鳍的距离/体长（LODO-CB/SL）3个比例性状存在显著差异（P〈0.05）;3）主成分分析表明,二倍体、三倍体及四倍体形态差异主要系躯体后半部差异所致;（4）聚类分析结果显示,洪湖二倍体和四倍体相聚类,亲缘关系较近,与三倍体群体的聚类关系较远。     

秘鲁外海茎柔鱼胴长组成及性成熟初步研究

根据2001年6-8月我国鱿钓船对秘鲁外海（79°～90° W、5°～16° S）茎柔鱼资源的调查,对其胴长组成和性成熟作了初步分析.结果表明,渔获物胴长范围为200～880 mm,优势胴长为240～480 mm,约占总数的80%左右.依据胴长组成和性成熟度,调查海域茎柔鱼存在3个群体.雌雄性别比为2.52∶1.00.渔获物中,雄性个体的性成熟度高于雌性,雄性Ⅲ和Ⅳ期占总数84.3%,雌性仅占47.5%.同一性成熟阶段,雌性个体的胴长范围均大于雄性.经估算,雌性和雄性个体的初次性成熟胴长分别为374 mm、228 mm.     

二倍体和四倍体泥鳅qRT-PCR分析中内参基因优选

为筛选在泥鳅中稳定表达的内参基因,以确保泥鳅基因表达分析结果的可靠性,选取ACTB、TUBA、EF1A、GAPDH、TUBB和18SrRNA 6个常用的内参基因作为候选内参基因,分别用BestKeeper、geNorm、NormFinder、ΔCt和RefFinfer软件分析这6个基因在二倍体和四倍体泥鳅胚胎发育阶段、成鱼组织间以及倍性间表达的稳定性。结果显示,在胚胎发育各阶段,TUBB和TUBA的表达最稳定,可作为胚胎发育阶段qRT-PCR分析的内参基因;其中,TUBB在泥鳅倍性间的表达差异不显著,因此,可作为泥鳅胚胎发育中跨倍性qRT-PCR研究的内参基因。在成鱼各组织中,ACTB和18SrRNA的表达最稳定,可用作组织间qRTPCR分析的内参基因;其中,18SrRNA在倍性间的组织表达差异不显著,因此,可作为泥鳅组织间跨倍性qRTPCR的内参基因。