核桃举肢蛾线粒体CO I和Cytb基因片段序列分析

核桃举肢蛾（Atrijuglans hetaohei）是危害核桃果实的主要害虫,严重影响核桃的产量和商品价值。在最新的形态学分类上,核桃举肢蛾属于鳞翅目、麦蛾总科、黑展足蛾属。通过同源序列比对探讨利用DNA条形码技术（DNA barcoding）对核桃举肢蛾进行分类鉴定的准确性。运用2对通用引物分别扩增核桃举肢蛾线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（CO I）基因和细胞色素b（Cytb）基因片段,并与鳞翅目麦蛾总科、巢蛾总科、凤蝶总科、螟蛾总科等昆虫的同源片段进行碱基组成多样性和系统进化分析,扩增得到核桃举肢蛾CO I基因664 bp片段和Cytb基因479 bp片段。结果表明:核桃举肢蛾线粒体CO I基因片段中,A、T、G和C 4种核苷酸的含量分别为29.5%、39.4%、15.1%和16.1%,A+T的含量(68.9%)明显高于G+C含量（31.1%）,存在显著的AT使用倾向性。在Cytb基因片段中, A、T、G和C 4种核苷酸的含量分别为33.4%、41.5%、10.2%和14.8%,A+T的含量为74.9%,也明显高于G+C含量（26%）。两段序列都以T-A间颠换和T-C间转换为主要替换方式,且密码子第2位点保守性最强,第3位点变异率最高。基于CO I和Cytb基因片段构建的NJ系统进化树均显示核桃举肢蛾与麦蛾总科昆虫处于同一个分支之下。利用DNA条形码技术得到的核桃举肢蛾分子生物学分类结果与传统的形态学分类结果一致。     

百山祖冷杉SSR体系的建立及人工辅助授粉子代的初步鉴定

应用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取百山祖冷杉Abies beshanzuensis叶片DNA,建立百山祖冷杉简单重复序列（SSR）反应体系。在体系建立过程中,采用单因素法分别对影响聚合酶链反应（PCR）的因素进行分析。结果表明：在20.00 μL反应体系中,模板DNA用量、镁离子（Mg²⁺）浓度、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dNTPs）浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量分别是60 ng,3.75 mmol·L^－1,0.15 mmol·L^－1,0.40 μmol·L^－1,16.67 nkat（1.0 U）时结果最好。随机挑取其中1对引物扩增的多态性片段进行克隆测序,序列经比对后得到的一致性值达到94%,表明其他杉科植物的SSR引物可以在百山祖冷杉中应用。通过引物筛选,得到15对引物可在百山祖冷杉中扩增得到多态性条带,其中4对引物扩增得到的部分片段在百山祖冷杉和日本冷杉Abies firma间有明显区别。这些结果表明,利用SSR分子标记技术能够用于百山祖冷杉人工辅助授粉子代的初步鉴定。图7表2参16     

柔嫩艾美耳球虫杂交株MIC2基因克隆及序列分析

根据柔嫩艾美耳球虫子孢子微线蛋白2的cDNA序列,利用计算机设计l对引物,以柔嫩艾美耳球虫杂交株子孢子总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出1个片段。把这个片段克隆到pMD18-T载体,经酶切鉴定得到1个阳性克隆,测序及序列分析结果表明该片段为MIC2基因,开发阅读框（0RF）与E．tenella豪顿株MIC2核苷酸同源性为99.51％,推导的氨基酸序列同源性为99.12％,说明MIC2基因高度保守。     

小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的RT-PCR检测

小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）是葫芦科作物上的一种重要病毒,近几年来已成了我国葫芦科作物上的一种重要病原物。根据已知的ZYMV基因组序列分别设计了2对特异性引物,在优化RT—PCR条件的基础上,成功建立了ZYMV的RT—PCR检测方法。引物ZYM1／ZYM2用于扩增整个CP基因序列（片段长度949bp）,而引物ZYM3／ZYM4用于扩增部分CP基因序列（片段长度449bp）,其中,引物ZYM3／ZYM4的检测灵敏度比引物ZYM1／ZYM2的检测灵敏度高。把所建立的方法用于南瓜（Cucurbita moschata）、丝瓜（如如cylindrica）病叶的检测,结果在这些病叶中也检出ZYMV。因此,该方法可用于ZYMV的快速、灵敏检测及分子流行病学的调查研究。     

致病疫霉菌无毒基因AVR3a的克隆与序列分析

根据GenBank中致病疫霉菌无毒基因AVR3a序列（AJ893357）及参考文献中的特异引物（Pex147F,Pex147R）,以致病疫霉菌基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到了特异性扩增片段,并对特异片段进行纯化和测序。结果表明,该片段的长度为451bp,经序列分析表明,其氨基酸编码序列为441bp,共编码147个氨基酸。BLAST分析结果显示,该片段核苷酸序列与无毒基因AVR3a核苷酸序列的同源性为99．34％,氨基酸序列比对结果表明,氨基酸序列在第19、80和103位存在着差异,这些核苷酸序列差异以及某些关键氨基酸的改变有可能是导致不同菌株中AVR3a毒性变异的原因。     

桂花EST-SSR引物开发及在品种鉴定中的应用

利用L₁₆（45）正交实验设计,针对模板DNA,镁离子（Mg2+）,dNTPs,TaqDNA酶和引物5个因素进行正交优化,建立适用于桂花Osmanthus fragrans表达序列标签-简单重复序列（EST-SSR）的最优扩增反应体系,将其用于桂花转录组EST-SSR多态性引物的筛选,最后利用筛选得到的多态性引物和聚类分析对14份四川省常见的栽培丹桂（SC01~SC14）样本进行品种鉴定。结果表明:桂花EST-SSR最优反应体系包含40 ng模板DNA,2.25 mmol·L-1 Mg2+,0.3 μmol·L-1引物,0.3 mmol·L-1 dNTPs,1.25×16.67 nkat TaqDNA聚合酶,10×PCR Buffer缓冲液2 μL,双蒸水补至20 μL;从150对EST-SSR引物中筛选得到了19对稳定性好、多态性高的SSR引物,多态性从高到低依次为五核苷酸（25.00%）,六核苷酸（19.44%）和三核苷酸（16.67%）重复类型。利用筛选得到的3对高度多态性SSR引物（OF8623-1677,OF24299-844和OF28774-2088）对四川省成都市周边常见栽培的14份丹桂（Aurantiacus group）样本进行了有效鉴定。结果表明:14份样本中,有12份可判定为‘朱砂丹桂’‘Zhusha Dangui’,SC06为‘堰红桂’‘Yanhong Gui’,SC08与‘满条红’‘Mantiao Hong’和‘状元红’‘Zhuangyuan Hong’亲缘关系较近。本研究也为今后利用EST-SSR标记对桂花指纹图谱构建、遗传多样性分析、分子育种及品种鉴定与保护等工作奠定基础。     

光皮桦EST-SSR PCR反应体系的优化

为获得稳定的聚合酶链式反应（PCR）产物,采用正交设计L25（56）对光皮桦Betula luminifera表达序列标签-简单重复序列聚合酶链式反应（EST-SSR PCR）反应体系中的5个因素:DNA模板浓度,引物浓度,镁离子（Mg2+）浓度,三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度和DNA聚合酶量进行优化,每个因素设计5个水平。优化试验结果表明:光皮桦EST-SSR最佳PCR反应体系:4.0 mgL－1DNA模板,0.500 molL－1引物,1.250 mmolL－1 Mg2+,0.250 mmolL－1 dNTPs,0.072 5 16.67 mkatL－1 rTaq酶。通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。对优化出的EST-SSR PCR反应体系进行稳定性检测,结果均能获得稳定、清晰可辨的DNA谱带。图6表3参15     

苏云金芽孢杆菌新疆分离株cry3基因的克隆和序列分析

从新疆天山北坡土壤及昆虫上分离到的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株对鞘翅目害虫具有高毒力,其总DNA约为15 kb,以此为模板,并设计特异引物,扩增出800 bp和550 bp DNA片段,将回收的片段与pBS-T质粒连接,转化大肠杆菌（Escherichia coli）,用蓝白斑法筛选,将阳性克隆子（1号-5,700 bp左右、G4号-3,500 bp左右、G4号-4,720 bp左右）测序,与GenBank中已知的序列进行比对,结果表明1号-5与cry3基因家族的杀虫蛋白基因序列同源性可达84%~100%。     

黄瓜性别控制基因CsACS1G的分子标记及其快速检测

根据黄瓜性别控制基因CsACS1G、CsACS1及BCAT基因DNA差异序列,设计CsACS1G基因特异标记引物G1/G2,采用碱处理法,快速提取黄瓜品种WI1983G、95、98-17、S-2-98及95×WI1983G的F1、F2群体植株DNA,并以此为模板进行PCR扩增.为了验证特异引物对检测CsACS1G基因的准确性,在黄瓜开花期间进行田间调查,结果表明,以快速提取的黄瓜DNA为PCR模板,特异引物G1/G2能稳定、准确扩增出CsACS1G基因特异片段,电泳检测结果与田间调查结果一致.     

基于MIRA技术的霍乱弧菌胶体金试纸条快速检测方法的建立

为了建立一种快速、灵敏、便捷的针对霍乱弧菌的检测方法,利用多酶恒温核酸快速扩增技术,对不同引物组在胶体金试纸条检测中的特异性和灵敏度进行研究.研究结果表明,在以质粒为模板的特异性试验中,Probe1+引物对2、Probe1+引物对3、Probe2+引物对5这3组引物组均显示出较高的特异性.但在灵敏度试验中,仅有Probe2+引物对5能够检出浓度为0.1 fg/μL的质粒模板.在后续以核酸为模板的特异性和灵敏度试验中,Probe2+引物对5的引物组合同样显示出较强的特异性,并对核酸模板的检出限可达到10 fg/μL,均显示出优于另外2种组合的特异性和灵敏度.本研究所建立的基于MIRA技术的霍乱弧菌检测方法具有较高的特异性和灵敏度,对于推进霍乱弧菌及其他致病菌的现场快速检测具有重要意义.     

板栗叶片DNA的提取及AFLP反应体系的建立

以初展开的板栗嫩叶为材料,利用改进的CTAB法,提取到高质量的板栗叶片总DNA。通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件,建立了板栗AFLP银染反应体系,得到了清晰的板栗AFLP指纹图谱。为板栗品种的分子标记和板栗品种间亲缘关系等研究奠定了基础。研究结果表明:①DNA模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应。以初展开的嫩叶提取的板栗叶片总DNA纯度最高,所含蛋白质、小分子杂质少,改良的CTAB提取法可用于板栗AFLP分析,形成清晰的AFLP指纹。②先进行酶切后再进行酶连的反应体系比酶切酶连一起进行的体系效果更好。板栗基因组DNA最佳酶切反应体系为:模板DNA总量500ng,反应体积为25μl,10×Y+/TanqoTMBuffer2.5μl,BSA0.8μl,EcoRI5U,MseI5U。连接反应体系中T4DNA连接酶浓度2U即达最佳效果。酶切、酶连反应最佳温度均为37℃。③以板栗为材料进行AFLP标记时,E AAC+M CAA、E AAC+M CAT和E AGT+M CAT三个引物均获得较好的多态性。其中以E AGT+M CAT引物组合的扩增条带信号强度一致性好,条带分布均匀,能够得到稳定、清晰、分辨率较高的指纹谱带,可进行中国板栗的遗传变异分析。     

正交设计优化茄子SSR反应体系

以茄子基因组DNA为模板,利用正交设计方法对茄子SSR反应体系中的Mg^2＋、模板DNA、Taq聚合酶、dNTP、引物5个因素进行了优化,同时对反应程序中的退火温度及循环次数进行筛选。结果确定了茄子10μL体积SSR反应体系的最优条件为：Buffer为1μL,Mg^2＋为2．25mmol·L^-1,dNTP为400μmol·L^-1,上下游引物各为39.60ng,Taq聚合酶为0．75U,DNA约为100ng。PCR程序为94℃预变性2min：然后进行35个循环的94℃变性30s,52℃复性30s,72℃延伸45s;72℃延伸8min后4℃保存。     

苹果自交不亲和基因PCR扩增程序优化

通过研究PCR反应体系(DNA、Primer、Mg2+、dNTP、Taq聚合酶、buffer)及退火温度对苹果自交不亲和基因(S基因)扩增结果影响的分析,构建了适合于苹果自交不亲和基因的PCR扩增程序的优化体系。结果表明:在20μL的反应体系中,模板DNA的最适含量为40ng,dNTP最适浓度为0.25mmol/L,而Primer最适浓度为0.4μmol/L,Mg2+的最适浓度为2.5mmol/L,Taq聚合酶最适浓度为1U,buffer最适浓度为1×buffer,最适退火温度为50℃。     

双七瓢虫对大豆蚜捕食作用研究

双七瓢虫是蚜虫的重要捕食性天敌之一,对大豆蚜具有明显的控制作用。试验测定了双七瓢虫对大豆蚜的捕食功能反应,结果表明:双七瓢虫捕食大豆蚜的数量与大豆蚜密度呈负加速曲线关系,双七瓢虫4龄幼虫对大豆蚜的日捕食量最大,3龄幼虫和成虫次之2,龄和1龄幼虫最小,捕食者对猎物的功能反应均属于Holling-Ⅱ型方程。双七瓢虫成虫及1～4龄幼虫对大豆蚜的捕食功能反应模型依次为:Na1=1.1305Nt1/(1+0.0137 Nt1),Na2=0.8564 Nt2/(1+0.0491 Nt2),Na3=0.7158 Nt3/(1+0.0142 Nt3)。Na4=0.9983 Nt4/(1+0.0097 Nt4),Na5=1.1309 Nt5/(1+0.0089 Nt5)。     

麻疯树cpSSR标记技术的建立与体系优化研究

[目的]建立麻疯树cpSSR—PCR反应的最佳反应体系。[方法]对影响麻疯树cpSSR—PCR反应体系的5个因素（细DNA聚合酶、DNA模板、Mg2＋、dNTP、引物）进行优化试验,筛选各反应因素的最佳水平。[结果]20山反应体系各组分的最合适浓度分别为10XBuffer、2．00mmoL／LMg2＋、2U／μlTagDNA聚合酶、0．2mmol／LdNTP、0．2μmol／L引物、35ng／μlDNA模板。[结论]最佳的退火温度为52℃：该反应体系的稳定性和可重复性均较好。     

黄瓜SSR-PCR反应体系的优化

采用L9(34)正交试验设计,研究了黄瓜SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,并比较了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明,最适反应体系为:在20μL体系中包括dNTP 200μmol.L-1、Primer 0.4μmol.L-1、Mg2+2.5μmol.L-1、Taq酶0.5μmol和模板DNA60 ng。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR扩增产物结果更准确。     

正交优化法建立沙打旺ISSR-PCR最佳反应体系

根据正交试验设计的原理,设计了探索性正交试验和细调性正交试验来确定沙打旺ISSR-PCR体系中各成分的浓度。得到既稳定又能扩出最多条带的适合沙打旺的ISSR-PCR最佳反应体系,即20μl的反应体系中含有1×buffer,dNTP 0.2 mmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.3μmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,DNA模板2.5 ng/μl。然后对沙打旺ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到这条引物的最佳退火温度为54.1℃。这一最佳体系的建立为今后利用ISSR标记技术,研究沙打旺的遗传多样性提供了标准化程序。     

油松SSR-PCR引物筛选及反应体系的建立

油松是我国特有的重要乡土针叶树种,开发合适的油松PCR-SSR引物并建立优化的反应体系,是开展油松天然群体和种子园人工群体遗传研究的基础.该研究以油松总DNA为材料,分析了Taq聚合酶、样本浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度以及引物浓度对PCR SSR扩增结果的影响,筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物12对,建立了稳定的、可重复的油松PCR-SSR最佳反应体系及PCR扩增参数.研究结果表明:在15 μL SSR -PCR反应体系中,样本最适宜浓度为30 ng,Mg2+的最适浓度为0.25 mmol/L,dNTP最适浓度为0.2 mmol/L,单引物的最适浓度均为250 nmol/L;Taq聚合酶在15 μL反应体系中宜加入0.375 U.统计利用所选12对引物,对辽宁兴城油松种子园内49个建园无性系进行了SSR-PCR反应,通过6%的变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测,每对引物扩增产物在100～250 bp之间的等位谱带数最大为10,最小为5,不同无性系间DNA谱带多态性丰富.油松SSR-PCR引物筛选及反应体系的建立,为今后利用SSR标记技术开展油松种子园的父本分析及选择性受精研究提供了一个标准化程序和强有力的工具.      

华山松SRAP-PCR反应体系的优化

为建立华山松SRAP-PCR反应体系,研究先采用L16(45)正交设计对影响华山松SRAP反应的5个因子(DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶)在4个水平上进行优化试验。结果表明:各因素对SRAP反应的影响依次为:Mg2+>dNTPs>Taq酶>DNA模板>引物;对SRAP反应结果影响较大的3个因子(Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度)进行单因素试验;确立华山松SRAP反应最佳体系为:20μL的PCR体系中含有Mg2+2.2mmol/L、dNTPs0.25mmol/L、DNA模板60ng、Taq酶0.8mol/s、引物0.8μmol/L。将该体系用于华山松的SRAP扩增能获得稳定、清晰的多态性条带。     

利用单因子和正交设计双重实验法优化鹧鸪茶RAPD-PCR反应体系

为了建立鹧鸪茶RAPD-PCR的优化反应体系,首先通过单因素试验选定其各影响因子比较适宜的浓度范围,再利用正交试验设计方法,对影响鹧鸪茶RAPD-PCR反应的5种因素进行4水平优化试验。并运用SAS软件对试验结果进行了分析,最后确定优化的RAPD-PCR反应体系为:10×Buffer缓冲液2.5μL+Mg2+2.5mmol/L+dNTPs0.2mmol/L+TaqDNA聚合酶1.5U+S28引物0.48mmol/L+80ng模板,定容至25μL。PCR扩增程序为:94℃预变性4min,然后按94℃变性30s,38℃退火45s,72℃延伸120s,进行45个循环,最后72℃延伸10min;16℃保存。该优化的RAPD-PCR反应体系具有良好的稳定性和重现性,可应用于鹧鸪茶不同居群间亲缘关系和遗传多样性分析。