犬细小病毒山东流行株分离鉴定及其全基因组测序分析

为了解山东地区犬细小病毒的流行及其变异情况,应用F81细胞从山东地区送检的发病犬粪便中分离出4株细小病毒,根据PCR和电镜技术对其进行鉴定,并对分离株的全基因组进行克隆测序与序列分析。结果表明:所分离到的4株病毒均能在F81细胞上产生明显的细胞病变,经PCR及电镜观察鉴定为犬细小病毒,分别命名为QN1/QN2/QN3/QN4株。全基因组分析结果显示,除QN3株的基因组全长为4 756 nt外,其余3株均为4 757 nt;4个分离株之间全序列核苷酸同源性为99.31%,与GenBank登录的10株具有代表性的CPV核苷酸序列比对,同源性为98.2%⁹9.9%;VP2基因的核苷酸序列同源性为98.5%99.9%;VP2基因的核苷酸序列同源性为98.5%⁹9.9%,氨基酸序列同源性为98.1%99.9%,氨基酸序列同源性为98.1%¹00%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,同属于NewCPV-2a亚型。     

猪流行性腹泻病毒山西分离株全基因组序列分析

用RT-PCR扩增分离的一株PEDV CH-SXCH11-2015的全基因组序列,测序拼接后,进行了序列分析。CH-SXCH11-2015全长28 038bp比CV777长5bp,与BJ-2011-1同源性最高,为98.9%;与LZC、SM98同源性最低,为96.6%。S基因全长均为4 161bp,突变主要发生在S1区,同源性分析表明,CH-SXCH11-2015核苷酸同源性与BJ-2011-1和CH/ZJJS-Z/2012的最高为98.9%,与SM98同源性最低为93.6%,与CV777、CV777vaccine同源性分别为94.2%和93.8%。CH-SXCH11-2015S基因氨基酸同源性与CH/ZJJS-Z/2012的最高为98.3%,与CV777vaccine、SQ2012同源性最低为91.8%,与CV777的同源性为92.9%。ORF3基因全长均为675bp,无核苷酸插入和缺失,同源性分析表明,CH-SXCH11-2015的ORF3基因与CH/HBQX/10核苷酸同源性最高,为99.3%,与CV777truncated核苷酸同源性最低,为90.6%。CH-SXCH11-2015的ORF3基因推导的氨基酸与(CH/HBQX/10、CH/S、CH/SHH/06、CH/TJ-2012、CH/ZKXH/11、CPF299、GZGY-10、PFF188、PFF285)同源性最高,为98.7%;与CV777truncated毒株最低,为88%。CH-SXCH11-2015的ORF3基因与CV777、attenuated DR13的核苷酸同源性分别为96.6%和97.6%,氨基酸同源性分别为95.1%和97.1%。遗传进化分析表明,CH-SXCH11-2015全基因组、S基因、ORF3基因与2010年以后我国分离的毒株亲缘关系较近,与CV777、2个疫苗株(attenuated DR13、CV777vaccine)的亲缘关系较远。     

犬瘟热病毒SH202003株全基因组序列分析

为了解上海地区犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）遗传变异情况,本研究采用首尾重叠的11对特异性引物,对CDV上海株SH202003进行RT-PCR扩增,将扩增片段进行反复测序,序列拼接后最终获得了SH202003株全基因组序列,应用Lasergene 7.0和Mega 6.0软件对全基因及H基因进行序列分析,并构建系统进化树。结果显示,SH202003株基因组全长为15 690 bp,编码6种结构蛋白（N、P、M、F、H和L）,H和L基因间隔序列为CUA,L和5'端尾随序列为CAA,与Hebei株核苷酸和氨基酸相似性最高,达到98.6%和96.6%,与疫苗株核苷酸相似性在92.2%~94.3%,氨基酸相似性只有82.7%~87.0%;全基因进化树中,SH202003株与流行野毒株在同一分支,与疫苗株在不同的分支;H基因同样与Hebei株亲缘关系最近,核苷酸和氨基酸相似性分别为98.7%和99.5%,与疫苗株Snyder Hill、CDV3、Convac及Onderstepoort亲缘关系较远;SH202003株处于Asia-1型分支,属于Asia-1型强毒株;SH202003株具有9个潜在N-糖基化位点,与强毒株Hebei株一致。研究表明,上海株SH202003属于CDV强毒株,为Asia-1型,其H基因序列相对保守,具有9个潜在N-糖基化位点,但是全基因序列存在较多突变,与疫苗株的匹配度较差,可能是免疫犬依然发生犬瘟热的主要原因。     

传染性法氏囊病病毒BC6/85株全基因组克隆及其序列分析

以传染性法氏囊病病毒（IBDV）BC6／85株基因组RNA为模板,采用RT—PCR方法扩增并克隆了IBDVBC6／85株基因组全长eDNA。序列测定结果表明：A节段全长共3260个核苷酸,与IM株的同源性最高为97．4％,与其他血清I型毒株的核苷酸同源性介于91．2％～97．1％;B节段有2827个核苷酸,与IM株同源性最高为98．6％,与其他毒株的核苷酸同源性为88．7％～98．6％。通过对编码的氨基酸序列进行分析,发现BC6／85株有21个特有氨基酸,其中15个位于多聚蛋白VP2—4—3。系统进化树分析表明,BC6／85株与经典毒株、弱毒株和变异株的关系较近,而与超强毒株相对较远。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GZZJ201711株全基因组序列分析

为了解贵州省毕节地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因变异情况,于2017年从贵州毕节地区某疑似感染PRRSV猪群分离到1株PRRSV,将其命名为GZZJ201711毒株。采用RT-PCR分段扩增出PRRSV GZZJ201711株13个基因片段,分别连接到pMD19-T载体上进行测序,拼接后得到PRRSV GZZJ201711株全基因组长15 322 bp (去除polyA尾),包括5’UTR、ORFla-ORF7、3’UTR。序列分析表明,GZZJ201711株与欧洲型Lelystad virus(LV)株核苷酸同源性为60.3%,与美洲型毒株代表株ATCC VR-2332核苷酸同源性为89.2%,与HP-PRRSV(HUN4、JXA1、TJ)等毒株同源性在98.8%~98.9%之间。GZZJ201711株与高致病性毒株JXA1、HUN4、TJ属于同一小分支,其中与XJu-1、GDHY毒株遗传关系最近。GZZJ201711毒株的NSP2基因有30个氨基酸缺失,与JXA1、HUN4、TJ等HP-PRRSV毒株缺失位置一致。     

塞内卡病毒广西分离株的初步分离与鉴定

为了确诊一例疑似SVA感染的临床病例,本试验将从广西地区某猪场母猪和肥育猪鼻及蹄部采集的出现典型水泡性病变的猪水泡液进行无菌处理后接种PK-15细胞,连续传代培养,通过细胞病变、RT-PCR扩增、基因序列测定、TCID₅₀和间接免疫荧光等方法对分离得到的病毒进行鉴定。结果显示：该病毒株在PK-15细胞上生长良好,可见明显细胞病变;接种PK-15细胞进行TCID₅₀测定,病毒滴度达到10^-6.75/mL;间接免疫荧光试验结果显示,接种第4代细胞培养物的BHK-21细胞出现特异的绿色荧光;扩增和测定了VP1基因序列后进行同源性及遗传进化分析,发现该毒株与Senecavirus病毒属中的病毒成员同源性最高,与之前2017年报道的广东分离株SVA-CH-GDYS02-2017和SVA-CH-GDLZ01-2017位于较近的进化分支内。以上结果表明,已成功从样品中分离到了SVA,且该毒株可以在PK-15和BHK-21细胞上进行增殖。本研究成功分离到一株SVA,为后续塞内卡病毒的诊断和疫苗研制提供试验材料。     

猪塞内卡病毒全基因组分析及系统进化树构建

研究对目前发现的典型A型塞内卡病毒(SVA)毒株进行遗传进化分析,旨在了解该病毒的进化路线,为相关疫苗开发和疾病防控提供参考。研究从NCBI网站中选取220株SVA全基因组序列作为分析对象,使用RDP5软件剔除重组病毒,利用MEGA7和MrBayes软件将符合要求的184条全基因组序列构建进化树。结果显示,SVA遗传进化历程以时间跨度分为3个进化支。随着时间推移,每个进化分支中的毒株数量逐渐增加,流行扩大化。研究表明,SVA的进化树体现了地域上的屏障,每个国家的SVA分离株大多聚类在一起;该病毒由美国始发,向加拿大、巴西、哥伦比亚、中国、泰国等地扩散,并有向其他国家流行的趋势。     

猪圆环病毒2型山西株全基因组序列分析

为了解山西省猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异情况,本试验采用PCR方法对山西省分离的4株猪圆环病毒流行株（SXXZ1株、SXXZ2株、SXTY株和SXJZ株）的全基因组进行了扩增、克隆和测序,并将其全基因组序列与国内外34株主要流行毒株进行核苷酸同源性与系统进化树分析。结果显示,4株PCV2山西流行株全基因组核酸序列全长SXJZ株为1 768 bp,其余均为1 767 bp,分别占25%和75%。4株毒株核苷酸同源性为95.9%~100.0%,与国内外34株参考株同源性为94.5%~99.9%,与国产疫苗株同源性为95.6%~99.8%;PCV2全基因组序列进化分析表明,本研究分离的SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株属于PCV-2b基因型,SXJZ株属于PCV-2e基因型,其中SXXZ1株和SXXZ2株与广东QY株的进化关系最近,SXTY与奥地利AUT5株的进化关系最近,SXJZ与福建FJ株的进化关系最近;而SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株与山西PCV2疫苗DBN-SX07-2株的进化关系较近,SXJZ株与国内PCV2疫苗LG株的进化关系较近。从而证实在山西省流行的PCV2毒株以PCV-2b为主,同时还分离出了PCV-2e亚型,表明山西省存在PCV-2e亚型毒株。本试验结果为山西省PCV2的分子流行病学、遗传变异及防控奠定了基础。     

鸡传染性贫血病毒广西株全基因组的克隆与序列分析

为了解鸡传染性贫血病毒(CIAV)广西分离株全基因变异情况,设计3对特异性引物,对CIAV广西分离株(GXC060821)的全基因进行PCR扩增、克隆和序列分析.结果显示,广西分离株的全基因为2 292个核苷酸,含有3个互相重叠的开放阅读框(ORF).序列分析表明,本CIAV分离株与国内外其他31个CIAV毒株比较核苷...     

猪圆环病毒2型贵州株全基因组的克隆与序列分析

应用PCR方法对采自贵州长顺、清镇和仁怀地区疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征的病料进行了猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组扩增、克隆和测序分析。结果表明:所扩增克隆的3株PCV2中,GZ-QZ1(JQ809463)和GZ-RH1(JQ809464)2个PCV2毒株基因组全长为1 767 bp,GZ-CS1(JQ809462)株为1 768 bp;3株PCV2之间的核苷酸序列相似性介于94.5%⁹9.9%,与国内外参考毒株核苷酸序列相似性为93.6%99.9%,与国内外参考毒株核苷酸序列相似性为93.6%⁹9.9%;全基因组序列比对分析表明,GZ-QZ1和GZ-RH1两个毒株属于PCV2b,GZ-CS1株属于PCV2a。对3株病毒编码Cap蛋白的ORF2基因分析发现,GZ-QZ1和GZ-RH1毒株与GZ-CS1毒株相比在696位缺失了一个碱基A,导致移码突变,使得末端氨基酸序列变由L K P变为L N P R。     

一株塞内卡病毒A全基因组序列测定与致病性分析

本研究旨在明确塞内卡病毒A（Senecavirus A,SVA）FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的同源性关系,并了解SVA-FJLY株的致病性。以分离自福建省某养殖场中的一株SVA-FJLY株为研究对象,参照其原型毒株SVV-001（GenBank No.DQ641257.1）全基因组序列设计5对引物,通过RT-PCR扩增、测序、拼接,获得SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析;并通过滴鼻攻毒3~4周龄仔猪。结果表明,SVA-FJLY株基因组全长7 275 bp（不包括PolyA）,SVA-FJLY株基因组存在一个多聚蛋白、VP1蛋白和VP2蛋白。SVA-FJLY株与参考毒株之间的基因组一级结构有较高的相似性,与HeB01-2017株（MF967574.1）相似性最高,达98.5%;而与SVA原型毒株SVV-001株（DQ641257.1）的相似性较低,为93.9%。SVA-FJLY株与国内几个毒株属于同一个分支,与国内的HeB01-2017株亲缘关系最近,同时与国外Colombia-2016株（KX857728.1）的亲缘关系最近。通过动物试验发现试验组猪攻毒10 d后,试验组2/3发病,对照组3/3正常,未出现仔猪死亡。通过全基因组序列测定获得了SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析,明确SVA-FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的相似性关系,了解了SVA-FJLY株的致病性,为SVA的反向遗传学和疫苗的研制提供参考依据,同时也丰富了SVA的基因组信息数据库。     

猪德尔塔冠状病毒CH7328株的致病性及全基因组序列分析

为了解猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV） CH7328株的致病性,并分析其基因变异和遗传演变规律,试验通过病毒培养、间接免疫荧光试验（IFA）、病毒生长曲线及仔猪致病性试验鉴定病毒的生长特性和致病性,并分析该毒株的全基因组序列。结果显示,感染PDCoV CH7328株的ST细胞出现肿大变圆、细胞呈碎玻璃状且拉丝、细胞集聚成簇和脱落等病变。IFA结果显示,PDCoV CH7328株主要分布在细胞质中。生长曲线结果显示,PDCoV CH7328株在6 h就已开始增殖,在36 h时达到峰值,对应的TCID₅₀为10^-8.0/mL,随后逐渐下降。仔猪致病性结果显示,攻毒组仔猪出现腹泻、脱水和厌食等临床症状,仔猪小肠明显变薄、透明而充盈,小肠绒毛严重脱落、萎缩或减少、肠绒毛细胞坏死等。粪便病原检测结果显示,在攻毒第2天便能检测到病毒,之后排毒持续增加,而正常对照仔猪无任何临床现象。全基因组测序及序列分析显示,PDCoV CH7328株的基因组全长为25 420 bp,与国内GD株的相似性最高,达到99.9%;遗传演化结果显示,PDCoV CH7328株与国内HKU15-155、CHN-HN-2014和GD株处在同一进化分支,亲缘关系最近。本研究结果为中国PDCoV疫苗候选株的筛选及猪场疫病防控提供了参考数据和理论依据。     

1株塞内卡病毒A型的基因组序列与演化分析

旨在分析塞内卡病毒A型(Senecavirus A,SVA)CH-HNCY-2019株的基因组特性和演化,参考SVA毒株SVV-001(GenBank No.NC011349)全基因组序列设计8对引物,通过RT-PCR扩增和测序获得SVA CH-HNCY-2019株全基因序列并进行序列分析.结果显示,SVA分离株CH-...     

一株金黄色葡萄球菌小菌落突变株全基因组测序分析

对金黄色葡萄球菌小菌落突变株(small colony mutant strains Staphylococcus aureus,SASCVs)和CP000253.1基因组差异进行了研究,为后续研究金葡菌分泌抗药物相关物质能力提供数据支持。对一株金葡菌小菌落突变株进行全基因组测序,并与CP000253.1参考序列进行序列比较。结果显示,金葡菌SCVs的文库插入片段为350bp,测序读长为150bp,SCVs的原始数据量为551 Mb,SCVs的碱基含量分布在处理前后有所不同,通过重测序,存在单核苷酸多态性(SNP)的数量较大。金葡菌SCVs与CP000253.1参考序列之间存在明显的序列差异,该数据为研究金葡菌感染奶牛乳房炎提供了一定的序列依据。     

多重耐药胸膜肺炎放线杆菌GD2107株全基因组测序及生物信息学分析

【目的】通过对多重耐药胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)GD2107株进行全基因组测序及生物信息学分析,丰富APP基因组数据库信息;构建基于ApxⅣ基因的系统进化树,分析该菌株的进化关系,为探索APP致病机制和临床防控猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumia, PCP)提供参考。【方法】通过药敏试验测定分离菌株的耐药谱;采用全基因组测序技术(whole genome sequencing, WGS)对细菌DNA进行全基因组测序,分别利用Illumina NovaSeq、PacBio SequeI测序平台对全基因组测序结果进行基因功能注释及生物信息学分析(包括基因组基本信息、功能元件分析及亚系统分析等);基于ApxⅣ基因构建系统进化树。【结果】药敏试验结果显示,GD2107菌株对青霉素、头孢拉定(先锋Ⅵ)、卡那霉素等14种抗菌药均耐药。对GD2107株全基因组测序得到1条大小为2 271 987 bp的环状染色体(GC含量为41.21%)和2个大小分别为5 027和3 497 bp的环状质粒...     

黑龙江省一株马流感病毒的全基因组测序及同源性分析

通过采集一匹患病马的病料及后续的病毒分离、病毒核酸提取、RT-PCR、连接T载体等一系列分子生物学技术,对病毒核酸进行测序,经NCBI比对分析,获得一株H3N8亚型马流感病毒。将获得的毒株与我国分离的A/equine/Jilin/1/1989禽源性毒株、2002年美国肯塔基分离株A/equine/Kentucky/1/02（美洲谱系Florida亚型）、A/equine/Argentine/77（美洲谱系Argentine亚型）等有代表性毒株进行同源性分析,发现该毒株与Florida-2型马流感病毒基因片段的同源率最高。根据马流感病毒的命名规则,将这毒株命名为A/equine/Heilongjiang/1/2010。本次所分离到的黑龙江株马流感病毒,丰富了我国马流感病毒资源库,为我国马流感流行病学研究、诊断技术及疫苗研究提供了重要基础。     

水貂冠状病毒中国分离株全基因序列测定及分析

为分析水貂冠状病毒中国分离株的遗传特征,采用高通量测序方法测定从山东省青岛市某养殖场分离的水貂冠状病毒基因组,首次报道了水貂冠状病毒中国分离株的全基因序列,并对其进行特性分析与比较基因组研究。结果显示:该病毒全基因组大小为28924 bp,具有与其他冠状病毒相似的基因组结构和基因顺序;5′端具有帽子结构,3′端具有poly(A)尾。该分离株与19株代表性毒株的全基因组和N基因进化和同源性分析都证实,该分离株与美国分离株的同源性较高,与其余2株水貂冠状病毒和2株雪貂冠状病毒同属于冠状病毒的一个新种。     

细菌全基因组测序技术用于沙门氏菌流行病学调查的可行性分析

为探讨细菌全基因组测序（whole genome sequencing,WGS）技术在基层沙门氏菌防控中的优势与可行性,对前期分离的9株沙门氏菌进行细菌全基因组测序,并进行血清型预测、多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）和耐药基因分析,将全基因组测序结果与传统血清分型和耐药性分析结果进行对比。结果显示：基于全基因组测序数据的血清分型结果与传统血清分型结果符合率为100%,两种方法对9株沙门氏菌血清分型结果完全一致;两种方法分析出的β-内酰胺类、氯霉素类、喹诺酮类和氨基糖苷类药物的耐药基因与耐药表型符合率为100%,即耐药菌株中均含有4大类抗菌药物的耐药基因;用全基因组测序检测到利福平、磺胺类和四环素3大类抗菌药物的7个耐药基因,表明9株沙门氏菌可能对这3大类抗菌药物耐药。结果表明：全基因组测序结果与传统实验室诊断结果完全一致,且具有快速、低成本、操作简单等优势,并且随着测序技术的发展,其检测成本和周期将进一步缩减,因此基于细菌全基因组测序开发沙门氏菌快速分型和耐药性分析方法有一定的应用价值和可行性。     

猪的全基因组测序研究进展

猪具有独特的生物学特征,在畜牧业生产和医学研究中占有重要地位。全基因组测序即de novo测序和全基因组重测序为解释猪的生物学特性和促进猪的分子育种发挥了重要作用。本文重点阐述全基因组测序在猪基因组学研究中的应用,分析全基因组测序技术及其在猪的全基因组测序工作中的优势和不足,并对未来猪的分子遗传育种研究工作进行展望。     

全基因组测序在畜禽中应用的研究进展

在基因组研究方面,目前全基因组测序已由第一代测序技术发展到第三代测序技术,全基因组测序与传统方法相比具有更加全面、精准、高效等优势。随着测序技术的发展和费用的降低,全基因组测序（whole genome sequencing,WGS）技术逐渐成为基因组研究应用最广泛的技术。全基因组测序已经在畜禽起源进化、重要经济性状基因挖掘、分子育种等方面取得了诸多成果。通过全基因组重测序,能够发现拷贝数变异（copy number variation,CNV）及单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）变异,丰富现有的CNV和SNP数据库,为抗病、生长、食欲、代谢调节、表型、环境适应机制及重要经济性状基因的分析提供重要数据。作者针对全基因组测序技术在主要畜禽上的研究进展,综述了全基因组测序在畜禽的品种遗传多样性、群体演变机制、功能基因挖掘等研究中的应用,并探讨了全基因组测序存在的问题,旨在为畜禽种质资源保护和分子育种实践提供参考。