SigmaB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌毒力的影响

为了解缺失SigmaB基因对单核细胞增生性李斯特菌（LM）的毒力影响。通过体外生长试验、巨噬细胞RAW264.7的粘附与侵袭试验、小鼠肝脾载菌量试验、毒力基因转录水平试验、小鼠LD₅₀试验来研究缺失株（LM XS5 △SigmaB）的毒力变化。结果显示,与野毒株相比,缺失株体外生长能力减弱、侵袭率和粘附率降低,小鼠肝脾载菌量显著减少,毒力基因（inlA、inlB、hly、prfA、actA）的转录水平降低,而小鼠LD₅₀升高。可见,SgmaB基因对LM的毒力具有重要的调控作用,为LM基因缺失疫苗和活疫苗载体的研发可资借鉴。     

hipA对禽致病性大肠杆菌生物学特性和致病性的影响

【目的】探究毒素-抗毒素（TA）系统中毒素基因hipA对禽致病性大肠杆菌（APEC）生物学特性和致病性的影响，为深入研究TA系统和APEC的致病机制提供理论依据。【方法】利用Red同源重组方法,构建禽致病性大肠杆菌野生株AE81的hipA基因缺失株AE81ΔhipA及回复株C-AE81ΔhipA，测定其生长曲线、运动性、环境耐受能力、细胞黏附能力，并采用实时荧光定量PCR检测环境耐受相关基因（hdeA、hdeB）、黏附相关基因（fimF、fimH）、毒力相关基因（hcp、ompR、ompC）的转录水平，探究毒素蛋白hipA对APEC的生物学功能及致病性的影响。【结果】成功构建hipA基因的缺失株和回复株。野生株AE81、缺失株AE81ΔhipA和回复株C-AE81ΔhipA的生长情况无明显差异。与野生株AE81相比，hipA基因缺失株AE81ΔhipA的运动能力降低，对酸性、碱性、高渗和氧化应激环境的耐受能力减弱，鞭毛和菌毛的数量和长度明显减小，对鸡胚成纤维细胞（DF-1）的黏附能力极显著减弱（P＜0.01），回复株C-AE81ΔhipA各指标基本恢复到野生株水平。实时荧光定量PCR结果显示，与野生株AE81相比，AE81ΔhipA菌株的hdeA、hdeB、fimF、ompR、ompC基因转录水平显著降低（P＜0.05），hcp基因转录水平差异不显著，但fimH转录水平显著升高（P＜0.05）。【结论】TA系统毒素蛋白hipA影响APEC的运动性、环境耐受能力和对细胞的黏附能力，参与APEC的致病过程。     

食源性单增李斯特菌毒力岛基因检测与致病性

为了解食源性单增李斯特菌分离株的毒力岛1(LIPI-1)和毒力岛2(LIPI-2)的基因及致病性。利用PCR方法对8株分离株LIPI-1和LIPI-2进行基因检测,小鼠腹腔接种分离株菌悬液5×10~7 CFU/只,进行致病性的初步试验。结果显示,LIPI-1的6个毒力基因除actA基因检出率为50.0%外,hly、prfA、plcA、plcB、mpl的检出率为100.0%;LIPI-2中inlA、inlB、inlC基因检出率为100.0%,inlD和inlE基因检出率分别为87.5%和75.0%,inlF和inlG毒力因子基因的检出率较低,分别为50.0%和37.5%。小鼠致病性试验显示,8株分离株均能致死小鼠,致死率在50.0%～100.0%。其中,LM5567和LM5570在5 d内全部死亡,致死率为100.0%,表明这2株菌对小鼠有强致病力。说明LIPI-1基因检出率高于LIPI-2的基因检出率;菌株的致病性与毒力岛基因的携带率无明显相关,但分离株对小鼠均有致病性,提示食品安全不容忽视。本研究为食源性单增李斯特菌毒力岛基因携带率与致病力的关系提供铺垫。     

黄曲霉ste20-like基因功能鉴定及与ste20基因功能的比较

为了鉴定ste20-like基因在黄曲霉生长、分生孢子形成、菌核形成中的作用以及其侵染性,并比较其与ste20基因功能的差异,以A.flavus NRRL3357为研究对象,对两个基因进行相似度比对和生物信息学分析,根据同源重组策略获得单基因缺失菌株Δste20、Δste20-like和双基因缺失菌株Δdouble（Δste20-like&ste20）,并分析基因敲除对菌株生长、分生孢子形成、菌核形成、黄曲霉毒素B₁（AFB₁）生物合成和侵染功能的影响。应用pyrG的双向遗传筛选成功获得Δste20、Δste20-like和Δdouble;与野生型相比,单基因缺失和双基因缺失突变株的生长速率、分生孢子量、菌核数量以及侵染能力都显著降低,在毒素合成方面,Δste20、Δste20-like和Δdouble菌株分别降低约76%、93%和72%;突变株之间比较发现,ste20-like缺失对生长速率的影响大于ste20基因;突变株之间的分生孢子产生量无显著差异;Δste20无菌核产生而Δste20-like还有少量菌核产生;Δste20-like菌株产生的毒素显著低于Δste20和Δdouble菌株。ste20-like基因正调控黄曲霉生长、分生孢子生成、菌核形成、AFB₁生物合成,并影响黄曲霉分生孢子对粮油种子的侵染能力。与ste20基因功能相比,ste20-like基因在调控黄曲霉生长、毒素合成方面对菌株的影响方面较显著,而在菌核形成方面ste20的基因调控作用更显著。     

马铃薯转录因子StNAC043基因的克隆及其生理功能分析

为探究马铃薯转录因子StNAC043基因的功能，克隆马铃薯转录因子StNAC043基因，利用农杆菌介导法将其转入马铃薯‘东农310’基因组，使其过量表达。转基因植株经无性系扩繁后，测定转基因株系的根和茎的生长指标、叶绿素相对含量(SPAD)以及荧光参数(F_v/F_m、ETR_max)，并以转录组测序结合qRT-PCR验证分析其下游调控基因。结果表明:StNAC043基因过量表达可以显著促进转基因马铃薯根系和茎的生长、显著提高转基因植株叶片SPAD、F_v/F_m、ETR_max；并且转录因子StNAC043可以调控捕光色素结合蛋白基因StCAB1和StCAB2的表达。综上，马铃薯转录因子StNAC043基因对马铃薯幼苗的生长和光合生理调控具有重要作用。     

副溶血性弧菌vtrB基因敲除菌株的构建及其在抵抗胆汁中的作用

构建副溶血性弧菌转录调节因子VtrB （V.parahaemolyticus T3SS2 regulator B）敲除菌株和回补菌株,探讨VtrB在副溶血性弧菌抵抗胆汁中的作用。根据GenBank数据库中副溶血性弧菌vtrB基因上下游序列设计引物,通过融合PCR将vtrB基因上下游同源臂融合并克隆入自杀质粒pDS132中,将重组自杀质粒转入大肠杆菌S17-1 λpir中,再接合转移至副溶血性弧菌中进行同源重组,通过10%蔗糖筛选获得vtrB基因突变株ΔvtrB。将pBAD33-vtrB重组质粒电转入ΔvtrB突变株中获得回补菌株C-ΔvtrB。研究副溶血性弧菌野生型、突变株和回补株在2%脱氧胆酸盐（DOC）处理后的存活率。基于同源重组原理,经vtrB基因的PCR扩增和转录水平检测结果表明,成功获得副溶血性弧菌vtrB基因缺失突变株ΔvtrB和回补株C-ΔvtrB。与野生型和回补菌株C-ΔvtrB相比,ΔvtrB突变株在2% DOC处理20、40和60 min后的存活率分别为17%、4%和1%,vtrB基因的失活使得副溶血性弧菌对胆汁抵抗能力极显著降低（P<0.001）,表现出存活能力的缺陷。由此表明,转录调节因子VtrB有助于副溶血性弧菌对胆汁的抵抗。     

组氨酸激酶基因envZ调控禽致病性大肠埃希菌生物被膜的机制研究

目的 研究双组分系统ompR/envZ中的组氨酸激酶基因envZ对禽致病性大肠埃希菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)生物被膜形成能力的影响,了解该双组分系统在APEC中对生物被膜的调控机制,为探索生物被膜影响禽致病性大埃希菌耐药性的途径提供参考。方法 采用Red同源重组的方法构建envZ基因缺失株,比较野生株和envZ基因缺失株生长特性、生物被膜形成能力的差异。利用转录组学方法分析envZ在转录调控网络中对其生物被膜形成相关基因的调控机制。结果 成功构建envZ基因缺失株AE17ΔenvZ;envZ基因缺失对APEC的生长速度无明显影响,但使APEC生物被膜的成膜能力减弱。与野生株AE17相比,envZ基因缺失株有711个基因发生差异表达,与生物被膜形成相关的基因显著下调。结论 envZ基因除了响应环境渗透压,还参与调控APEC生物被膜的形成。     

Smad9基因干扰表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及内分泌的影响

为阐明BMP/Smad信号通路下游的转录因子 Smad9对鹅卵泡发育的调控作用，研究采用RNAi技术干扰 Smad9基因在鹅卵泡颗粒细胞的表达。通过对SMAD9蛋白表达定位， Smad9基因干扰后颗粒细胞的增殖情况以及卵泡发育相关激素及其受体的表达分析，探讨 Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及其内分泌功能的影响。结果显示，SMAD9蛋白在鹅卵泡仅表达于颗粒细胞，Smad9-siRNA显著抑制 Smad9的表达。 Smad9干扰后颗粒细胞的增殖能力明显降低，细胞上清中雌二醇（E₂）的水平显著下降，孕酮（P_{4）水平未见明显变化，细胞色素P450芳香化酶基因（ CYP19A1）和促黄体素受体（LHR）基因的表达显著下降，促卵泡素受体（FSHR）基因的表达无显著变化。这些结果表明，干扰 Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖和内分泌功能均产生显著影响，其机制可能是 Smad9基因表达抑制后引起颗粒细胞E2合成减少和LHR的表达下降有关。}     

冬瓜首雌花节位遗传分析与基因定位

【目的】对冬瓜首雌花节位基因（FFFN）进行遗传分析和定位，为FFFN基因的克隆奠定基础。【方法】以首雌花节位差异显著的冬瓜高代自交系材料B214 (P₁)和B227 (P₂)及以P₁为母本和P₂为父本构建的F₁（P₁×P₂）、F₂、B₁（F₁×P₁）和B₂（F₁×P₂）遗传群体为材料，采用6世代混合模型分析方法对FFFN进行遗传分析，并利用已构建的高密度SNP遗传图谱进行数量性状位点(QTL)分析。【结果】冬瓜FFFN遗传符合E模型，主要受2对主基因的加性效应及2对主基因的加性互作效应控制，同时受环境影响较大；结合已构建的高密度分子遗传图谱，仅检测到1个与FFFN相关的QTL位点（FFFN2.1），其对数优势比阈值（LOD）为11.7，贡献率为32.1%，位于2号染色体上的Marker 61668-Marker 39179，物理距离为7.64 Mb。通过标记加密将FFFN2.1定位在InDel2和SSR91之间的1.38 Mb范围。候选区间内有28个候选基因（Bhi02M001022～Bhi02M001049），其中11个基因没有功能注释，其他17个注释的功能基因包括生长素反应蛋白（ARF）、逆转录酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、三角状五肽重复蛋白等。【结论】冬瓜FFFN是多基因控制的数量性状，主效位点FFFN2.1定位在InDel2和SSR91之间，结合功能注释推测Bhi02M001033为候选基因。     

不同种植密度对施氮条件下玉米灌浆期叶片光合特性的影响

明确不同种植密度对施氮条件下玉米灌浆期叶片光合特征的影响，对通过种植密度调控玉米个体光合作用与群体产量关系，实现玉米稳产丰产具有理论和实践指导意义。在甘肃河西走廊，通过3 a田间试验，以施氮360 kg/hm²(N360)和不施氮(N0)为主区，玉米种植密度75 000株/hm²(D1)、87 000株/hm²(D2)和99 000株/hm²(D3)为副区，研究施氮条件下玉米灌浆期叶片光合特征对不同种植密度的响应。结果表明，试区玉米灌浆期光合有效辐射和大气温度最大值出现在14:00，最小值出现在6:00，而空气相对湿度最大值出现在6:00，最小值出现在14:00。施氮能够显著增加玉米灌浆期叶片净光合速率(P_{n)、叶片蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)，N360较N0在8:00-18:00的Pn平均增加19.5%~41.7%、Tr平均增加27.4%~44.1%、Gs平均增加27.4%~44.1%，但叶片胞间CO2浓度（Ci）显著降低；随着种植密度的增大，玉米灌浆期8:00―18:00的Pn、Tr、Gs呈降低趋势；N360D2与N360D1玉米灌浆期Pn差异不显著，显著大于其他处理。施氮水平和种植密度对玉米灌浆期8:00―16:00的叶片水分利用效率均无显著影响。N360较N0同时增加玉米籽粒产量和生物产量，但使玉米收获指数降低3.5%~5.3%；在N0中D2玉米籽粒产量大于D1和D3，而在N360中D2玉米籽粒产量与D3无显著差异，均显著大于D1；N360D2与N360D1的玉米籽粒产量无显著差异，均大于其他处理。总之，在施氮360 kg/hm²条件下，种植密度从75 000株/hm²增加到87 000株/hm²，能够使玉米灌浆期叶片光合速率保持在较高水平，提高收获指数，促进生物产量向籽粒产量的转化效率，获得最大籽粒产量。}     

瓜实蝇生物学特性研究

通过对瓜实蝇B actrocera(Z eug od acus)cucurbitae在10、14、18、22、26、30、34和38℃下卵、幼虫和蛹的发育历期及成虫羽化、取食、交尾和产卵等生物学特性的研究表明,瓜实蝇的卵、幼虫和蛹的发育历期随温度的升高而缩短,其最适发育温度在26~30℃范围内。14℃下卵期3.5~4.0 d,平均(3.68±0.14)d,30℃下仅需1 d;幼虫于14℃下历期最长为(9.0~16.0)d,平均(11.73±1.21)d,30℃下最短为4.0~6.0 d,平均(4.83±0.24)d;蛹14℃下最长为24.0~33.0 d,平均(26.95±0.41)d,最短30℃下为6.0~7.0 d,平均(6.39±0.02)d。成虫白天活动,黄昏时交尾,羽化多集中于凌晨。卵产于瓜皮内,以幼虫蛀食瓜肉为害,老熟幼虫脱离瓜果进入土中化蛹。     

二色胡枝子黄酮体外抗氧化活性

通过二色胡枝子黄酮(Lespedeza bicolor flavonoids ,LBF)清除羟自由基、超氧阴离子的效果及抑制猪油、菜油和亚油酸的自氧化来研究其体外抗氧化作用.结果表明:二色胡枝子黄酮对清除自由基有显著作用,且清除率随黄酮浓度的增加而增大;能够明显地抑制猪油、菜油、亚油酸的自氧化,抑制作用随浓度的增大而增强.作为天然的抗氧化剂,二色胡枝子黄酮具有一定开发利用价值.     

桂花OfPSY、OfPDS和OfHYB基因启动子克隆及表达特性分析

【目的】探究高温和外源脱落酸对桂花Osmanthus fragrans类胡萝卜素生物合成的3个相关基因,包括八氢番茄红素合成酶基因(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)、β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB)的调控作用,为阐释桂花类胡萝卜素代谢调控的机制提供研究基础。【方法】根据桂花基因组数据库的序列,从桂花品种‘堰虹桂’‘Yanhong Gui’中克隆OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的启动子序列,并进行生物信息学分析,再构建PCAMBIA3301-LUC载体在烟草Nicotiana benthamiana中瞬时表达,结合高温(37℃)和200 mg·L^-1脱落酸处理,分析启动子活性。【结果】获得OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的部分启动子,其长度分别为1 908、1 521及1 830 bp。作用元件分析表明：3个启动子中均存在TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件、光响应元件、脱落酸响应元件以及MYB和MYC结合位点。此外,在OfPSY启动子中,存在赤霉素响应元件;在OfPDS启动子中,存在茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、厌氧诱导型...     

MutL调控水稻黄单胞菌的致病力

为了了解水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)中 的MutL/MutS系统是否参与DNA修复以及是否调控病原菌的致病力,构建了mutL突变体,比较了野生型与mutL突变体的突变率差异,野生型、mutL突变体及其互补菌株侵染水稻的能力。结果显示,mutL突变导致Xoo在H₂O₂胁迫下的突变率显著升高,mutL突变导致Xoo致病力下降,表明DNA错配修复蛋白MutL参与Xoo的DNA修复并正调控Xoo致病力。     

转酿酒酵母HOG1基因拟南芥植株的获得与检测

HOG1(high osmolarity glycerol,HOG1)是酵母中参与耐高渗透压调控的重要基因。根据已发表的酿酒酵母序列,设计特异引物,扩增到完整的HOG1基因;构建植物表达载体pBI121-HOG1,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转化植株种子。对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选,并通过PCR和RT-PCR对抗性苗进行检测。结果表明,构建的载体成功转化拟南芥,并获得了13份转HOG1基因苗。     

欧洲千里光CYCLOIDEA(CYC)类SvRAY1基因的克隆及功能分析

  目的  揭示菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris CYC2类RAY1基因过表达使舌状花发生不同程度变宽现象的机制,进一步探究其产生原因。  方法  克隆欧洲千里光SvRAY1基因,利用生物信息学、实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)、超表达载体构建、扫描电镜观察、转基因植株形态学观察与统计等方法与技术,进一步进行SvRAY1基因功能分析。  结果  qRT-PCR反应显示:SvRAY1基因主要在欧洲千里光舌状花及筒状花中表达,且生殖发育第S3和S4阶段舌状花中表达量最高;形态学观察表明转基因欧洲千里光SvRAY1超表达植株的舌状花比野生型长度较短、显著变宽。扫描电镜观察舌状花腹侧表皮细胞大小与形状,宽度显著变宽的株系中显示远轴端细胞排列紧密且细胞分裂旺盛,中轴端细胞形状由边缘弯曲变为平滑,细胞长度变短且分裂旺盛。  结论  欧洲千里光舌状花发育过程中,SvRAY1基因可能促进细胞横向分裂,进而舌状花细胞形态和排列发生不同程度的变化引起舌状花变宽。图6表2参28     

农杆菌子房注射法对金钗石斛的活体转化研究

对金钗石斛 Dendrobium nobile 进行人工自花授粉,在授粉之后10、20、30、40、45、50和60 d分别将工程化根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens EHA105(pCAMBIA1301)直接注射入子房内部.150 d后,金钗石斛蒴果成熟,摘取果实,进行种子β-葡萄糖苷酸酶（GUS）染色、无菌播种、潮霉素筛选以及PCR检测试验.结果表明：子房注射对果实发育具有较大影响,在授粉后10~30 d进行子房注射后,果实脱落;在授粉后45 d进行子房注射,成熟果实注射部位的种子GUS染色率最高,可达18%;无菌播种之后,经潮霉素筛选,获得11株幼苗,每株植株均表现出GUS染色反应;随机挑选4株幼苗进行PCR检测,发现均能扩增出预期条带,说明外源基因已经整合到植株基因组内.农杆菌子房注射法在兰科植物转基因的成功应用,可以为兰科植物育种提供一种简单高效的方法.     

草酸青霉和棘孢木霉对青枯劳尔氏菌的生防效果

  目的  探究自主筛选获得的2株生防菌棘孢木霉Trichoderma asperellum QZ2与草酸青霉Penicillium oxalicum QZ8对青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum(简称青枯菌)的生防效果。  方法  以青枯菌作为靶标菌,通过平板培养法、生长曲线法测定2株生防菌及其发酵液对青枯菌生长的抑制作用;通过土培试验、基于稀释涂布法测定生防菌在土壤中对青枯菌的抑制效果。  结果  平板对峙培养试验发现:棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌有显著的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别达80.9%和45.9%;棘孢木霉QZ2与草酸青霉QZ8生防菌高温灭菌发酵液对平板培养青枯菌,同样呈显著的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别达33.3%和34.8%。无菌滤膜处理的未高温灭菌2株生防菌发酵液的青枯菌液培养结果表明:其D(600)显著小于未添加生防菌发酵液的对照D(600)(P＜0.05),且棘孢青霉QZ8抑制效果好于草酸木霉QZ2。土壤培养结果显示:2株生防菌处理的土壤中青枯菌的活菌数量显著低于未添加生防菌的对照(P＜0.05)。  结论  棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌均有显著的抑制效果,可作为番茄Lycopersicon esculentum青枯病的潜在生防菌。图5表2参32     

花生油酸脱氢酶基因AhFAD2A和AhFAD2B的时空表达特征

花生Arachis hypogaea油酸脱氢酶AhFAD2是调控花生种子中油酸与亚油酸比值（oleic acid/linoleic acid,O/L）的关键酶,已确定存在2个编码AhFAD2的基因:AhFAD2A和AhFAD2B,但两者在花生中的时空表达特征尚不清楚。选取2个有代表性O/L的花生品种‘山花15’‘Shanhua 15’（O/L为1）和高油酸花生突变体（O/L大于20）为材料,根据AhFAD2A和AhFAD2B基因3'-UTR核苷酸序列的差异,设计了新型、简便的区分两者的特异性引物,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术,对2个花生品种的7个不同组织（根,茎,叶,花,开花后20,40,60 d种子）中AhFAD2A和AhFAD2B的表达特征进行了分析。结果表明:AhFAD2A和AhFAD2B在‘山花15’和高油酸花生突变体7个组织中都有表达;其中,在2个花生品种3个不同发育时期的种子中,AhFAD2A和AhFAD2B在开花后40 d的种子中表达量最高,推测在开花至花后40 d这一阶段种子中FAD2的表达量可能对花生最终O/L起主要的调控作用。另外,‘山花15’种子中AhFAD2B的表达量显著高于AhFAD2A,而在高油酸花生突变体种子中则相反,推测花生中AhFAD2B在催化油酸去饱和生成亚油酸的过程中比AhFAD2A可能起更重要的调控作用。     

关于不定方程5x(x+1)(x+2)(x+3)=18y(y+1)(y+2)(y+3)

运用Pell方程、递推序列、同余式及平方剩余等初等数论知识,证明了不定方程5x(x+1)(x+2)(x+3)=18y(y+1)(y+2)(y+3)仅有4组非平凡整数解(x,y)=(6, 4),(-9, 4),(6,-7),(-9,-7),同时给出该不定方程的全部整数解,分别为(x,y)=(0, 0),(0,-1),(0,-2),(0,-3),(-1, 0),(-1,-1),(-1,-2),(-1,-3),(-2, 0),(-2,-1),(-2,-2),(-2,-3),(-3, 0),(-3,-1),(-3,-2),(-3,-3),(6, 4),(-9, 4),(6,-7),(-9,-7).