鸡蛋壳蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及耐药性分析

【目的】分析不同环境下鸡蛋外壳携带蜡样芽孢杆菌的情况和分离菌株的基本特征。【方法】从养殖场和超市各采集9种新鲜鸡蛋,对鸡蛋表面携带的蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定、基因分型、毒力基因筛查和耐药性分析。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对分离菌株进行初步鉴定,全基因组测序后进行菌种鉴定并确定基因分型、筛选毒力基因和耐药基因,同时采用微量肉汤稀释法测定分离株对头孢曲松、红霉素、万古霉素等12种抗菌药物的耐药性。【结果】经MALDI-TOF MS初步鉴定和基因组菌种鉴定,确定从养殖场3种未经清洁加工的鲜蛋中分离出的6个菌株为蜡样芽孢杆菌,其序列分型(ST)较为多样,其中有2株新的ST型。在毒力基因筛查方面,6株蜡样芽孢杆菌均检出了非溶血型肠毒素nheB基因、腹泻型毒力因子hlyⅡ基因和侵袭免疫系统的inhA基因;nheA和nheC基因携带率为83.3%,编码溶血型肠毒素HBL的hblA、hblC和hblD基因携带率均为66.7%;cytK和hlyⅢ基因携带率分别为33.3%和50.0%;肠毒素基因BceT、entFM和致吐毒素基因ces均未检出。耐药性方面,6株菌...     

1株牛源致病性蜡样芽孢杆菌特征分析

自陕西省华阴县1头猝死荷斯坦奶牛肝脏分离出1株革兰阳性杆菌,经鉴定为蜡样芽孢杆菌,后对其进行了全基因组测序、耐药性检测以及小鼠感染模型的建立。全基因组测序分析表明,该菌株MLST分型属于ST1150,基因组携带有磷霉素耐药基因fosB以及多种毒素基因,并且具备从国外传入我国的可能性;药敏试验显示该蜡样芽孢杆菌对氨苄西林、头孢他啶、乙酰甲喹、磷霉素和壮观霉素具有较强抵抗力;其在95%置信区间内对小鼠的半数致死量估算值为1.247×10⁷ CFU,致死小鼠出现肝脏边缘变灰白、肺脏出血和肠壁出血水肿等病变。结果表明,我国奶牛养殖中存在携带有多种毒素基因的强毒力蜡样芽孢杆菌,与荷斯坦奶牛猝死密切相关。     

四株饲用芽孢杆菌的分离鉴定及其16S-rRNA的序列分析

芽孢杆菌是一类抗性强耐高温的细菌,部分芽孢杆菌有益生作用,在动物肠道内能有效抑制病原菌,促进肠道有益菌的繁殖,维持动物肠道内的微生态平衡。本试验从引进的饲料样品中分离出4株杆菌,分别命名为YB-1、YB-2、YB-3和YB-4,通过表型鉴定及16S-rRNA测序鉴定,YB-1为苏云金芽孢杆菌、YB-2、YB-4为枯草芽孢杆菌、YB-3为蜡样芽胞杆菌。16S-rRNA序列同源分析结果表明:YB-2、YB-4与枯草芽孢杆菌亚种的同源性分别为99.91%和100%;YB-1与苏云金芽孢杆菌亚种的同源性为99.17%,YB-3与蜡样芽胞杆菌亚种的同源性为100%,从样品中分离出两株枯草芽孢杆菌,一株苏云金芽孢杆菌和一株蜡样芽胞杆菌。     

北京市场饲料原料及全价饲料中蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌和3种霉菌毒素情况调查

饲料中的霉菌和其毒素对养殖企业的养殖成本影响十分巨大。本试验以北京大兴种猪示范基地为观察对象,检测不同饲料和饲料原料的蜡样芽孢杆菌、烟曲霉菌以及呕吐毒素（DON）、烟曲霉毒素（FB）和玉米赤霉烯酮（ZEN）3种毒素含量。试验结果表明,66份饲料原料和全价饲料样本中,蜡样芽孢杆菌样本的总体检出率为75.8%,烟曲霉菌检出率为69.7%;饲料原料中DON、FB和ZEN检出率较高,成品饲料DON检出率100%,FB检出率83.3%,ZEN检出率66.7%。结论 ：北京地区的饲料霉菌及其毒素污染情况严重,应尽快制定饲料原料毒素污染限量。     

饲料中蜡样芽孢杆菌致病性及其毒素检测方法研究进展

蜡样芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌,菌株主要通过产生呕吐毒素和肠毒素而发挥致病性,临床分为呕吐型和腹泻型。文章对蜡样芽孢杆菌血清分型、污染来源、致病性特点、检测方法和防控措施进行综述,旨在系统了解蜡样芽孢杆菌致病机制,为防控蜡样芽孢杆菌提供新的思路。     

1株乳源蜡样芽胞杆菌的分离鉴定及致病性分析

无菌采集重庆市某奶牛场乳房炎患牛奶样,利用MYP选择培养基无菌分离培养得到1株疑似蜡样芽孢杆菌的纯培养物,利用全自动微生物鉴定系统、16S rRNA、KB法药敏试验、MLST分型和PCR扩增hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK、entFM、Ces毒力基因及测序,并通过测定小鼠LD_(50),血清ALT、AST、LDH和ALP活性,肝脏组织SOD、MDA、GSH-Px水平及病变组织病理组织学观察进行分析鉴定。结果显示,分离株在甘露醇卵黄多黏菌素琼脂(MYP)平板上,形成周围有白色至淡粉红色的菌落,在蜡样芽孢杆菌显色培养基上形成具有白色光晕的蓝色菌落,革兰染色阳性。全自动微生物鉴定系统鉴定为蜡样芽孢杆菌,鉴定可信度为99.9%,典型度为132 (典型)。16S rRNA序列与与韩国(FJ982661.1)、美国(NZ_JURK01000037.1)、斯里兰卡(MG827268.1)、马来西亚(MN093796.1)株同源性为100%,同美国奶源分离株(NZ_ASPZ01000016.1)亲缘关系最近。药敏试验结果表明,分离株对青霉素G、红霉素、苯唑西林、四环素、克拉霉素、环丙沙星、左氧氟沙星等极度敏感,对大观霉素、万古霉素、多黏菌素B耐药。该菌株MLST基因型为ST476,与ST1813亲缘关系最近,对扩增相关毒力基因PCR产物测序结果表明,nheA基因片段同日本分离炭疽杆菌(AP019731.1)毒力基因同源性高达96.91%,entFM基因片段同美国蜡样芽孢杆菌(CP001186.1)同源性为97.45%,nheB基因片段同挪威蜡样芽孢杆菌(CP001283.1)同源性高达95.48%。对小鼠的LD_(50)为1.44×10~(10)CFU。ALT、AST、LDH、ALP及MDA显著升高,SOD、GSH-Px含量明显降低。显微观察显示对照组小鼠肝小叶结构正常,攻毒组可见肝脏肿大、充血、质地脆弱、肝索排列紊乱,肝细胞变性坏死等肝损伤特征。本试验从奶牛乳房炎奶样中分离鉴定出1株耐多黏菌素、万古霉素及大观霉素的肠毒素基因型蜡样芽孢杆菌,命名为蜡样芽孢杆菌2018CQ-CMM01。该分离菌对小鼠LD_(50)为1.44×10~(10)CFU,对小鼠具有明显的肝脏毒性,目前暂未发现国内其他地区乳源中有该型蜡样芽孢杆菌报道。     

隐性乳腺炎乳牛乳样中苏云金芽孢杆菌的分离与鉴定

自2002年10月起，笔者从西安及其周边地区乳牛中随机抽取48头共184个乳室，进行了乳牛隐性乳腺炎的调查及病原菌分离鉴定。共分离出3株革兰氏阳性芽孢杆菌，初步鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。该菌的培养特性及形态与蜡样芽孢杆菌极为相似；小白鼠腹腔注射可致其死亡，证明该菌所产毒素毒力较强。     

生物饲料添加剂中微生物污染情况调查分析

研究旨在了解生物饲料添加剂中微生物污染情况。随机抽取生产及使用环节的微生态制剂、酶制剂及标示有微生物成分或酶制剂成分的混合型饲料添加剂产品270批,依据现行标准规定的方法进行了沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠菌群、霉菌总数、蜡样芽孢杆菌等微生物指标的检测。结果表明,生物饲料添加剂中沙门氏菌的检出率为1.85%;大肠菌群的检出率为23.33%,超标率为21.11%,检出水平为<10～10~5CFU/g;霉菌的检出率为42.22%,超标率为8.89%,检出水平为<10～10~6CFU/g;蜡样芽孢杆菌检出率为39.56%,超标率为4.44%,检出水平为<10～10~7CFU/g。结果显示,生物饲料添加剂中存在一定程度的微生物污染情况,有必要对该类产品进行质量监控。     

渔用芽孢杆菌制剂中菌株的分离与鉴定

为了解不同剂型渔用芽孢杆菌制剂中优势菌株情况,本研究对市售4种不同类型、使用效果良好的芽孢杆菌制剂进行培养分离、革兰氏染色和16S r RNA测序鉴定。结果显示:酶制剂中地衣芽孢杆菌为优势菌群,饲料添加剂中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌为主要菌群,复合菌中地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌为主要菌群,粬种中的主要菌群为地衣芽孢杆菌。据结果推测,地衣芽孢杆菌为目前水产养殖业较为普遍使用的芽孢杆菌。     

牦牛源肠道芽孢杆菌的分离、鉴定及生物学特性研究

为分离鉴定牦牛肠道有益菌的菌种资源,采集了西藏牦牛的肠道内容物,从中分离、纯化优势菌种,经16S rDNA序列比对和生化试验鉴定种属,通过革兰染色观察其形态,并进行抗逆性能、黏附能力、溶血活性、体外抑菌能力和药敏特性等生理生化试验鉴定了其菌种特性。结果从牦牛肠道内容物中成功分离纯化获得4株菌株,分别鉴定为枯草芽孢杆菌（XZMN-1）、短小芽孢杆菌（XZMN-2）、贝莱斯芽孢杆菌（XZMN-3）和蜡样芽孢杆菌（XZMN-4）。4株分离菌株均为γ-溶血、不具有生物膜,耐胆盐性、耐酸性强,能在pH值为3.0的培养基中存活;XZMN-3和XZMN-4具有耐高温性,其菌液在80℃下孵育30 min仍能检测到活性。4株菌对大多数抗生素敏感,在不同溶剂中的疏水性相差较大（1.91%～93.15%）,自凝集性在13.29%～60.63%之间;4株菌均对沙门氏菌有抑制作用,XZMN-1和XZMN-2对金黄色葡萄球菌有抑制作用。综上说明,分离纯化的4株芽孢杆菌抗逆性高,黏附性能强,其中XZMN-1对大多数抗生素敏感,可作为开发高活性益生菌饲料添加剂的候选株。     

四种芽孢益生菌组合对仔猪生产性能影响的比较

选择40头长荣杂交断奶仔猪(起始重7 kg左右),随机分为5个组,每组8头,两个重复,研究4种芽孢益生菌组合(在乳酸菌和酵母菌的基础方上分别加入凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌)对断奶仔猪生产性能及腹泻率的影响.结果表明,ADG芽孢杆菌各组高于对照组,但其中蜡样芽孢杆菌组最优;较之对照组,蜡样芽孢杆菌组在前、后及全期ADG分别显著提高45.7%(P<0.01)、14.74%和23.92%(P<0.05);F/G分别降低18.8%(P<0.05),4.3%和7.2%(P>0.05);腹泻率(DR)降低79.97%;表明复合蜡样芽孢杆菌制剂优于其它芽孢杆菌组合,具有抗病与促生长作用.为开发无公害猪用微生物饲料添加剂奠定了基础.     

动物粪便中纤维素分解菌的分离和鉴定

纤维素分解菌可用于动物微生态添加剂和除臭剂。此试验采用羧甲基纤维素平板法及刚果红染色法,从鹅的粪便中初步分离筛选出7株能够降解纤维素的细菌,结合摇瓶发酵法进行复筛,最终选出3株羧甲基纤维素酶活性高的菌株,并对其进行形态学和16SrRNA鉴定。结果表明:3株纤维素分解菌的菌落形态不一,但其表面均微粗糙,革兰氏染色均呈阳性,短杆状或细杆状,有芽孢;结合16SrRNA鉴定结果,最终将分离到3个菌株鉴定为芽孢杆菌属的地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌,分别命名为Bacillus licheniformis G-1、Bacillus cereus G-4和Bacillus safensis G-10。     

呕吐毒素降解菌的筛选、鉴定及应用

为了筛选出对呕吐毒素(DON)具有降解能力的菌株,试验从土壤、发霉秸秆和动物粪便、肠道内容物等不同环境中采集样品10份,分别在LB、NA和MRS培养基中添加DON,制成改良固体培养基进行菌种初筛,将初筛得到的菌株在改良液体培养基中培养,用ELISA方法测定改良培养基中DON的降解率并对菌种进行复筛,对降解率高的呕吐毒素分解菌进行形态学和16S rDNA保守序列分析鉴定,组合所筛选和鉴定的菌种对麸皮中的天然DON进行降解试验。结果表明:通过初筛和复筛,筛选到DON降解率分别为19.1%、51.3%、66.7%的菌种3株;通过菌落特征、菌体特征等形态学观察和16SrDNA保守序列比对的分子鉴定,最终确定3株呕吐毒素降解菌分别为解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌;枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌组合对麸皮发酵处理,DON降解率最高,可达71%。     

变质鸡蛋中蜡样芽孢杆菌的分离与鉴定

从山东地区保存超过14 d大范围出现变质鸡蛋中分离到一株细菌,经过培养特性、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定,鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus).分别将变质鸡蛋、煮熟的变质蛋、健康鸡蛋进行厌氧培养和细菌计数,发现健康鸡蛋和煮熟的变质蛋无蜡样芽孢杆菌,而变质鸡蛋中的细菌数量达到1.3×108CFU/g.本试验表明,蛋黄中过量的蜡样芽孢杆菌可能与鸡蛋变质有关,应注意过量添加蜡样芽孢杆菌可能影响蛋品的保鲜和食用安全性.     

基于宏基因测序的微生物饲料添加剂菌群结构及质量分析

随着饲料端全面禁抗,养殖端进入减抗、限抗时代,微生物饲料添加剂行业迎来了新的机遇。然而,如果在生产过程中控制不严,会造成产品的微生物污染,因此,需要对产品中的菌群结构进行分析,以保证产品质量。本文以4年采集的113个市售微生物饲料添加剂产品为研究对象,利用宏基因组测序、物种注释和统计学分析,研究微生物饲料添加剂产品的菌群结构和分布规律。结果表明：64.60%的微生物饲料添加剂样品存在非标识菌污染,主要表现在副地衣芽孢杆菌被误用为地衣芽孢杆菌、含有具有抑菌作用的贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌;污染菌中非致病菌主要是贝莱斯芽孢芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、解淀粉芽孢杆菌、卷曲乳杆菌;致病菌主要是肺炎克雷伯菌,检出比例为5.98%;其次是蜡样芽孢杆菌,检出比例为12.82%。综上,宏基因测序技术可有效监测微生物饲料添加剂产品的菌群结构,非靶向检测产品中的污染菌。目前,产品存在检测菌种与标识不符、标识菌含量偏低、部分产品存在杂菌甚至致病菌的问题。本研究使用的非靶向研究方法和统计学得到的高频污染菌信息对微生物饲料添加剂产品的质量控制和行业监管具有重要参考意义。     

鱼源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为探究鱼源蜡样芽孢杆菌的致病性和耐药性及指导科学用药,本试验采用形态学观察、生理生化特性分析、16S rDNA基因扩增及系统进化树构建等方法鉴定分离菌,人工感染试验确定分离菌的致病性,耐药基因检测和药敏试验确定菌株耐药性。结果显示,分离菌株形成边缘不规则、不光滑的乳白色菌落,为需氧型革兰氏阳性菌。葡萄糖、硝酸盐、明胶液化等生化反应为阳性,木糖、阿拉伯糖、甘露醇等生化反应为阴性。16S rDNA基因片段长度为1 457 bp,在系统发育树中,分离菌与蜡样芽孢杆菌RTR菌株亲缘关系最近,与蜡样芽孢杆菌的同源性均达到99%以上,从而综合判定分离菌株为蜡样芽孢杆菌。人工感染试验发现,分离菌株对黄颡鱼有一定的致病性。耐药基因检测结果显示,分离菌株中检测出Sul1和Sul2两种耐药基因。药敏试验发现,该菌株对庆大霉素、哌拉西林、米诺环素等敏感,对头孢哌酮中度敏感,对青霉素、头孢曲松、氨苄西林等耐药。本试验结果为有效防控蜡样芽孢杆菌感染的疾病提供了科学参考资料。     

金黄色葡萄球菌耐药性及肠毒素分型研究

为了解从生鲜乳中分离得到的31株金黄色葡萄球菌的耐药性和肠毒素分布情况,用微量肉汤稀释法进行药敏试验,用PCR方法进行肠毒素的检测和分型。结果表明,31株金黄色葡萄球菌耐药率在50%以上的抗菌药有7种,药耐药率小于10%的有3种;敏感率大于50%的抗菌药有6种,敏感率小于10%的有5种。31株金黄色葡萄球菌毒素基因携带率为93.5%,同时携带2种及以上毒素的菌株占67.7%,有SEA基因的占38.7%,含其他传统的毒素基因类型SEB、SEC、SED和SEE基因的菌株只占40.4%,携带新发现的毒素基因SEG、SHE、SEI和SEJ的菌株占67.7%。说明本次试验中的31株金黄色葡萄球菌对6类13种抗菌药都有不同程度的耐药性,且多重耐药现象比较严重。生鲜乳中分离的金黄色葡萄球菌带毒率高,且携带新发现的肠毒素基因较多。     

鱼源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为探究鱼源蜡样芽孢杆菌的致病性和耐药性及指导科学用药,本试验采用形态学观察、生理生化特性分析、16S rDNA基因扩增及系统进化树构建等方法鉴定分离菌,人工感染试验确定分离菌的致病性,耐药基因检测和药敏试验确定菌株耐药性。结果显示,分离菌株形成边缘不规则、不光滑的乳白色菌落,为需氧型革兰氏阳性菌。葡萄糖、硝酸盐、明胶液化等生化反应为阳性,木糖、阿拉伯糖、甘露醇等生化反应为阴性。16S rDNA基因片段长度为1 457 bp,在系统发育树中,分离菌与蜡样芽孢杆菌RTR菌株亲缘关系最近,与蜡样芽孢杆菌的同源性均达到99%以上,从而综合判定分离菌株为蜡样芽孢杆菌。人工感染试验发现,分离菌株对黄颡鱼有一定的致病性。耐药基因检测结果显示,分离菌株中检测出Sul1和Sul2两种耐药基因。药敏试验发现,该菌株对庆大霉素、哌拉西林、米诺环素等敏感,对头孢哌酮中度敏感,对青霉素、头孢曲松、氨苄西林等耐药。本试验结果为有效防控蜡样芽孢杆菌感染的疾病提供了科学参考资料。     

肉食动物肠道中芽孢杆菌的分离和降胆固醇能力的测定

为筛选、鉴定出降胆固醇芽孢杆菌,试验从健康狮、虎、狼等肉食动物粪便中分离得到3株菌,分别命名为L1、L2和L3。经形态学、染色特性和16S r DNA序列测定,鉴定出L1和L3为枯草芽孢杆菌,L2为蜡样芽胞杆菌。3株菌均具有良好的芽孢形成能力,芽孢形成率分别为82%、93%、91%。应用硫磷铁比色法对3株菌的体外降胆固醇能力进行测定,结果显示L1降胆固醇能力较弱,而L2、L3具有较强的胆固醇降解能力,其中L2在48 h内胆固醇降解率可达50%以上,这为相关降胆固醇药品和保健品的开发奠定了良好的基础。     

肉食动物肠道中芽孢杆菌的分离和降胆固醇能力的测定

为筛选、鉴定出降胆固醇芽孢杆菌,试验从健康狮、虎、狼等肉食动物粪便中分离得到3株菌,分别命名为L1、L2和L3。经形态学、染色特性和16S r DNA序列测定,鉴定出L1和L3为枯草芽孢杆菌,L2为蜡样芽胞杆菌。3株菌均具有良好的芽孢形成能力,芽孢形成率分别为82%、93%、91%。应用硫磷铁比色法对3株菌的体外降胆固醇能力进行测定,结果显示L1降胆固醇能力较弱,而L2、L3具有较强的胆固醇降解能力,其中L2在48 h内胆固醇降解率可达50%以上,这为相关降胆固醇药品和保健品的开发奠定了良好的基础。