家蝇防御素抗菌肽Des-hf突变体的抑菌活性研究

采用PCR定点诱变技术,将家蝇防御素抗菌肽成熟肽段的基因（des-hf gene）倒数第九个氨基酸由甘氨酸（G）突变为带正电荷的精氨酸（R）,构成第一个突变体des-hf-MU1。采用同样的方法在des-hf 基因的C端加上六个带有正电荷的赖氨酸（K）,构成第二个突变体des-hf-MU2。采用毕赤酵母表达系统对上述两个突变体进行表达,抗菌特性表明表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,根据琼脂孔扩散法检测des-hf-MU1和des-hf-MU2的抑菌效价比des-hf分别提高了2.4倍和8.0倍,且在PH值为5～6时活性最高,热稳定性实验显示des-hf-MU1、des-hf-MU2 100 ℃加热10min 后仍具有抑菌活性,这些充分显示了良好的应用前景。     

猪β-防御素体外抗菌活性和抗氧化活性研究

抗菌肽在哺乳动物先天免疫系统中发挥着非常关键的作用.猪β-防御素1(pBD-1)和β-防御素2(pBD-2)是猪体内两种重要的抗菌肽.本研究采用化学方法合成pBD-1和pBD-2,通过改良的微量肉汤稀释法研究了pBD-1和pBD-2对8种革兰氏阴性菌和3种革兰氏阳性菌的抗菌活性,并利用透射电镜初步探究了pBD-1和pBD-2可能的杀菌机制;本研究还进一步探讨了pBD-1和pBD-2的体外抗氧化活性.抗菌试验结果表明,pBD-1对Escherichia coli EPEC O78:K80和Bacillus subtilis ATCC 6633具有较好的抑菌活性,最小抑菌浓度(MIC)均为32 μg/mL,最小杀菌浓度(MBC)分别为32 μg/mL和128 μg/mL;pBD-2仅对Pseudomonas.aeruginosa CMCC 10104有较好的抗菌活性,MIC为8μg/mL,MBC为32μg/mL,对其他细菌抗菌活性较弱;透射电镜观察结果表明,pBD-1和pBD-2能够作用于菌体细胞膜杀灭细菌;抗氧化活性实验结果表明,pBD-1和pBD-2在0～256 μg/mL范围内,具有清除自由基的功能和还原力,且呈现浓度依赖效应.研究结果揭示,pBD-1和pBD-2对特定细菌发挥抗菌作用的同时,还具有一定的抗氧化活性,为进一步阐明pBD-1和pBD-2的生物学功能及其开发和应用提供了基础资料.     

在毕赤酵母中利用口蹄疫病毒(FMDV)2A实现dTomato和串联MagaininⅡ基因的共表达

抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的多肽,是天然免疫的重要组成部分.为了提高抗菌肽的表达量以及很方便地检测抗菌肽的表达情况,本研究利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) 2A将荧光蛋白dTomato基因和3个串联的MagaininⅡ基因融合到一个开放阅读框中(open reading frame,ORE),融合的基因被置于pPIC9K载体醇氧化酶基因(AOX1)启动子的下游,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC9K-dTomato -2A-3M,将线性化的重组酵母表达载体通过电击法转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS115中,经G418筛选和PCR鉴定得到阳性转化子,然后将其转至摇瓶,在30℃、0.5％甲醇的条件下进行诱导表达,连续诱导3d.SDS-PAGE电泳图谱显示,在31 kD(dTomato)和9.5kD(3M)处有蛋白条带出现,在荧光显微镜下观察酵母表达上清发出红色荧光,对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽串联的MagaininⅡ具有明显的抑菌效果.结果表明,由2A连接的融合基因(荧光蛋白dTomato和串联的MagaininⅡ)在毕赤酵母中成功的进行了表达,FMDV 2A在其C端剪切多聚蛋白,得到dTomato和串联的MagaininⅡ两个独立而有活性的蛋白,为小分子抗菌肽的表达提供一个高效的检测方法.     

抗菌肽模式肽PGYa的分子设计、克隆及在毕赤酵母中的分泌表达

在α-螺旋抗菌肽序列比较和两亲性分析的基础上,提取序列模板,计算机辅助（螺旋轮法）设计出新型抗菌肽模式肽PGYa(Peptide以Gly开头,以Tyr-NH2结尾),然后选用毕赤酵母偏爱密码子,设计合成了PGYa基因（rPCR法）。所合成的基因全长为94bp,并在其N端引入kex2裂解位点,以保证表达抗菌肽具有天然N端。基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型酵母表达载体pPICZα-A-PGYa。在AOX1 (醇氧化酶)启动子调控下,PGYa蛋白获得分泌表达,其表达量达到132 mg/L。初步抑菌（E.coli DH5α）活性显示：PGYa有较好的抗菌活性。     

猪源抗菌肽Protegrin-1基因在大肠杆菌中的融合表达

为了使猪源抗菌肽Protegrin-1(PG-1)在原核表达载体中获得高效表达,在不改变PG-1氨基酸的基础上,根据大肠杆菌偏好密码子表,替换PG-1部分密码子,设计两段互补的引物,利用搭桥PCR技术扩增完整的PG-1成熟肽基因,重组至融合表达载体pGEX-4T-1中,构建成抗菌肽PG-1基因融合表达载体pGEX4T-PG-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)plyS中,筛选得到阳性克隆,并用1.0 mmol/L的IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE电泳图谱显示在28 kD处有特异性的蛋白条带出现,经Western blot检测表明重组子已经成功地在大肠杆菌中表达了融合蛋白.纯化得到的GST-PG-1用凝血酶切割后,经用亲合层析得到分子量约为2 kD抗菌肽PG-1蛋白1.38 mg/L.对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽PG-1具有明显的抑菌效果.     

坝上长尾鸡TYR基因核心启动子鉴定与单核苷酸多态性分析

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)作为参与黑色素形成并起调节作用的关键酶,对于动物毛色表型具有重要意义。TYR功能异常会阻断黑色素形成通路,TYR突变会产生白化而导致皮肤、被毛和羽毛呈现白色表型。基因启动子区的转录调控对基因表达具有重要作用。为探明坝上长尾鸡(Gallus gallus)TYR基因启动子活性区及其结构,本研究首先构建了双荧光素酶表达载体,通过脂质体瞬时转染至鸡胚成纤维细胞DF1,利用双荧光素酶检测试剂盒进行启动子活性检测;进而成功克隆了TYR基因5'侧翼区片段1813 bp,构建了7个含有不同长度启动子片段的表达载体(P1~P7)及2个启动子区突变载体(mut-1和mut-2),确定了鸡TYR基因启动子的核心区域为-810~+65,其中-810~-213区域可能存在重要的正向调控元件SP1、Oct-1、GATA-1、C/EBP、SRF、NF-1、YY1、NF-κB、TBP和AP-1的结合位点。通过测序筛选出-963~-957、-955、-932、-692、-391和-321等6个多态位点,利用SHEsis软件预测到8种单倍型:Hap1~Hap8;白羽鸡和黑羽鸡基因型及等位基因频率差异显著(P0.05),白羽鸡的优势基因型分别为BB、DD、FF、II、KK和MM,Hap1频率为100%,黑羽鸡的优势基因型分别为AA、CD、EF、HH、JJ和LL,Hap2频率最高为40%;突变体mut-2的活性值显著低于其对应的非突变体P2,突变体mut-1的活性值显著低于其对应的非突变体P6(P0.05)。上述6个多态位点可能是影响TYR基因启动活性的重要位点,但不是全部的作用位点。启动子活性降低可能影响TYR基因转录,从而影响黑色素合成。本研究探明了坝上长尾鸡TYR基因启动子活性区及其结构,为深入探讨该基因在毛囊组织中的表达调控提供了实验依据。     

抗菌肽基因在毕赤酵母中分泌表达及其条件优化

用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽cecropinA(1-8)-melittin(1-18)基因片段,合成片段与酵母表达载体pPIC9K重组,构建胞外分泌表达载体pPIC9K-came,电击法转化毕赤酵母(Pichiapastoris)SMD1168宿主菌,对CAME抗菌肽重组酵母菌的摇瓶发酵条件进行了优化。结果表明,酵母表达抗菌肽具有抗菌活性且溶血活性显著降低;重组酵母在含2%葡萄糖pH7.0的YPD培养液中,250r/min震荡培养24h后,重组酵母菌的A600为6.0时,经0.5%甲醇在28℃条件下诱导48h能够诱导产生较高抗菌活性的抗菌肽。     

贵州地方稻种来拢小圆粒半矮秆突变体srd-1筛选及鉴定

以贵州地方稻种来拢突变体库中能稳定遗传的小圆粒半矮秆突变体srd-1为材料,对其半矮化和小圆粒性状分子机制进行研究.暗形态建成表明srd-1突变体矮化性状与BR无关.srd-1突变体表现对GA敏感,外源GA3对突变体幼苗第2叶鞘有促进生长作用,能诱导α-淀粉酶活性,可以使倾斜方向排列的细胞微管骨架恢复至野生型横向排列方向,表明srd-1突变体矮化性状与GA信号传导途径无关.GA合成途径中关键酶基因OsKS1和OsGA2ox1表达相对于野生型差异不显著,OsCPS、OsKO2、OsKAO、OsGA20ox2和Os GA3 ox2基因表达下调,初步说明srd-1突变体的矮化性状可能是由活性GA生物合成降低所致.此外,小圆粒调控基因SRS1、SRS3和SRS5表达下调,表明srd-1突变体突变基因同时参与了籽粒大小和株高的调控,突变基因影响了活性GA的生物合成和小圆粒调控关键酶基因的表达,进而导致了矮化和小圆粒表型的产生.该研究为突变体突变基因的定位及利用研究提供了参考.     

两株抗苯菌灵稻瘟病菌突变体的若干特性

用由稻瘟病菌gp d基因启动子和终止子序列控制的、以粗糙脉孢菌的微管蛋白β-tubu lin(Bm 1)突变基因为选择标记的表达载体,转化稻瘟病菌0742野生型菌株,获得了两株具有苯菌灵抗性的菌株M 1和M 2。但Sou thern杂交表明,这两个菌株并不是由于质粒转化而获得苯菌灵抗性。对稻瘟病菌0742野生型及突变体M 1、M 2的β-tubu lin基因的序列比对分析表明,突变体M 1在内源β-tubu lin基因的第56、178、1704位置上发生了点突变,M 2在第56、899、1040、1389、1704位置上发生了点突变,导致M 1的352位氨基酸由苏氨酸变成了丙氨酸,M 2的107、154、270、352位氨基酸分别由苏氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸变为丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸。计算机分析显示M 1和M 2突变体β-tubu lin基因编码的蛋白质疏水性发生了微弱改变,结构域没有受到影响。该发现为开发新的稻瘟病菌遗传选择标记提供依据。     

禽抗菌肽—禽β-防御素的研究进展

抗菌肽为一类小分子的，含氨基酸残基少于100个的，具有广谱抗菌活性的多肽。禽抗菌肽属β-防御素，为防御素的一个亚类。目前，已从鸡、火鸡和驼鸟的血液、鸡与火鸡的上皮细胞、以及企鹅的胃内容物中分离到多种禽β-防御素。这类抗菌肽具有广谱抗菌活性，能抗包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌及囊膜病毒在内的许多病原微生物。本文主要综述了该类抗菌肽的分子特征、抗菌机理与应用前景，以期对进一步开展相关研究提供参考。     

植物源天然产物的抑菌作用、机理及在食品保藏中的应用

食源性致病菌引起的食品安全问题严重威胁着人们的身体健康,已经广泛引起人们的关注,因而如何安全有效地抑制食品中致病菌的生长成为食品领域中的研究热点。研究表明,植物源天然产物具有来源广泛、抑菌谱广、与化学防腐剂相比副作用小等特点,可作为一种天然防腐剂运用于食品中。本文综述了植物源天然产物对食源性致病菌的抑菌活性、机理以及在食品保藏中的应用,以期为减少食源性致病菌对食品的污染提供理论依据。     

花生防御素基因的克隆及原核表达

植物防御素是植物免疫系统的一员,具有防御病原菌侵染植物的功能。本文采用RACE法成功地克隆花生防御素基因,并对其原核表达蛋白进行研究。研究结果表明,采用RACE方法克隆花生防御素基因（AhORRP）,得到的cDNA全长为585bp,含一个225bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75个氨基酸;经同源分析,花生防御素蛋白与其它物种具有33％～70％的同源性。原核表达获得大小约28kD AhDRRP融合蛋白。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为花生防御素功能鉴定打下一定基础。     

石榴果皮中抑菌活性物质提取工艺优化(简报)

为了研究石榴果皮中抑菌活性物质的提取工艺,以金黄色葡萄球菌做指示菌,以抑菌圈直径为活性追踪指标,在单因素试验的基础上通过二次回归正交旋转组合设计进行工艺参数优化.结果表明,对石榴果皮抑菌活性物质提取效果的影响大小顺序为:乙醇浓度、提取温度、液固比,提取时间;其最佳提取工艺条件为乙醇浓度60%,液固比10:1,提取温度60℃,提取时间4h.在此优化条件下,石榴果皮提取液抑菌圈直径为16.30 mm.     

不同颜色蚕豆种皮酚类物质组成及抑菌活性研究

为了提高蚕豆加工副产物的综合利用率,筛选天然多酚抑菌剂的功能原料,本试验以5种不同颜色蚕豆种皮为研究对象,比较不同颜色蚕豆种皮中酚类物质的含量、组成及抑菌活性的差异,初步探讨蚕豆种皮中发挥抑菌活性的多酚物质种类。结果表明,5种不同颜色蚕豆种皮中总酚含量为165.94~8 487.62 mg·100g^-1,总黄酮含量为11.26~209.01 mg·100g^-1,花色苷含量为1.08~65.64 mg·100g^-1。紫红蚕豆种皮总酚、花色苷含量最高,黑蚕豆总黄酮含量最高。没食子酸和原儿茶酸为蚕豆种皮中的主要酚酸物质,儿茶素、杨梅素、根皮素及槲皮素为主要的黄酮类物质,矢车菊素、矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素和飞燕草素-3-葡萄糖苷为主要花色苷类物质,且深色蚕豆种皮具有较的高酚类物质含量。抑菌活性结果表明,深色蚕豆种皮对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制能力较强,且总酚、总黄酮含量与沙门氏菌抑菌活性呈显著正相关(P<0.05),而花色苷含量与大肠杆菌抑菌活性呈显著正相关(P<0.05),没食子酸及矢车菊素是发挥抑菌作用的主要物质。综上,深色蚕豆种皮含有丰富的酚类化合物,且具有较高的抑菌活性,本研究为蚕豆种皮综合加工利用提供了一定的理论基础。     

鲤鱼精蛋白的提取与抗菌稳定性研究

该文研究了采用超声波技术提取鲤鱼抗菌精蛋白的工艺条件和抗菌稳定性。实验结果表明：采用超声波技术提取鱼精蛋白硫酸用量少,提取时间短。用1.0A强度的超声波和5%的硫酸溶液提取鱼精蛋白,提取时间20 min,能得到较高活性的鲤鱼抗菌精蛋白。并进一步研究了pH值、温度、金属离子和蛋白酶对鲤鱼精蛋白抗菌活性的影响。     

西藏“灵菇”乳的发酵与抑菌机制研究（简报）

根据发酵过程中菌粒中主要微生物数量与发酵乳中主要营养物和产物含量间的关系,分析探讨了西藏"灵菇"乳的发酵机制;考察了不同发酵时期所得发酵乳对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌活性,结合化学物质模拟试验揭示了发酵乳的抑菌机制。结果显示,发酵前期,菌粒中的各微生物由于向乳中扩散及生长延滞,数量稍有减少;随着发酵的进行,菌粒中乳酸菌和酵母菌的数量一直处于相对稳定的水平,但醋酸菌含量呈明显的先升后降趋势;在整个发酵过程中,菌粒中的乳酸菌数量一直处于最高水平,其次为酵母菌,醋醋菌数量最少;乳酸是西藏“灵菇”发酵乳中的主要抑菌活性物质;乙酸和乙醇的存在对低浓度乳酸的抑菌活性有增效作用,但当乳酸浓度较高时,这种增效作用减弱。西藏“灵菇”发酵乳的总抑菌效果是微生物与其代谢产物的共同作用结果。     

入侵植物假臭草和胜红蓟提取物的抑菌活性研究

假臭草和胜红蓟是我国南方常见的入侵植物,为了防治和利用其开发植物源抑菌剂,本试验采用牛津杯法检测了不同溶剂(70%乙醇、95%乙醇、石油醚和乙酸乙酯)提取物对28种病原微生物的抑菌活性,并评估了不同器官部位提取物的抑菌活性。结果表明,不同溶剂提取物抑菌活性有差异,假臭草70%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑制活性最强,抑菌圈直径为26.28±0.75mm;胜红蓟95%乙醇提取物对腐生葡萄球菌(Staphylococcus epidermidi)抑制活性最好,抑菌圈直径为17.31±0.46 mm。此外,假臭草和胜红蓟70%乙醇不同部位提取物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌作用表现为叶部提取物(22.31±0.34 mm和19.52±0.28 mm)茎部提取物(22.25±0.65 mm和12.75±0.45 mm)根部提取物(11.78±0.69 mm和9.05±0.53 mm)。假臭草提取物对12种细菌和1种真菌黑曲霉菌(Aspergillus niger)具有抑制效果;胜红蓟提取物对9种细菌具有抑制效果。本研究结果为进一步研发具有潜力的植物源抑菌剂奠定了理论基础。     

不同海拔高度和竹龄对黄甜竹叶精油成分及其生物活性的影响

为探究海拔和竹龄对黄甜竹叶精油品质的影响,本研究采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）测定不同海拔高度下新叶和老叶精油的化学成分,并分别采用平板抑菌法和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法测定各竹叶精油的抑菌效果和抗氧化活性。结果表明,黄甜竹叶精油中的成分以烷类、醇类、萜烯类和芳香族化合物为主,中高海拔有利于萜烯类化合物的合成和积累,新叶精油中的醇类、萜烯类和芳香族化合物含量高于老叶。各竹叶精油对干腐病菌（Fusarium）和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）均有抑制效果,海拔越高竹叶的抑菌效果越好,新叶精油的抑菌效果强于老叶。各竹叶精油均表现出较高的抗氧化活性,表现为低海拔>中高海拔、新叶>老叶。本研究结果为黄甜竹叶资源的开发提供了数据支撑和新的利用方向。     

复合益生菌发酵液的功能特性及对对虾诱食效果

为探求复合菌发酵液的多种功能,该试验选择具有脱氮、产酶、抑菌等优良性能的酵母菌、乳酸菌及芽孢杆菌各1株,利用已优化的HJ培养基进行共培养,实时监测发酵过程,分时段取样,对复合菌发酵液的脱氮、产酶、抑菌、培藻及诱食等功能进行研究。结果表明,酿酒酵母菌NJ-02、屎肠球菌SC-01及枯草芽孢杆菌M7-1能够在HJ培养基中进行共发酵,连续培养24 h后3株微生物活菌数量分别达到3.88×10~8、2.41×10~(10)、5.38×10~9 CFU/mL。复合菌发酵液的脱氮、培藻性能同复合菌中枯草芽孢杆菌M7-1的活菌数相关较大,发酵至16h其降解亚硝态氮和培藻性能最为理想,亚硝态氮降解率为89%,并使小球藻叶绿素a质量分数提升49.6%。复合菌发酵液具有同枯草芽孢杆菌M7-1相当的产酶(蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶)活性及同屎肠球菌SC-01相当的抑菌(副溶血弧菌)活性。复合菌发酵液饲喂对虾,诱食效果明显好于对照组(P0.05),同化学诱食剂二甲基-β-丙酸噻亭(dimethyl-beta-propiothetin hydrochloride, DMPT)差异不显著,其肠道中乳酸菌、酵母菌数目显著高于对照组及化学诱食剂组(P 0.05)。该研究所制备的脱氮、培藻、抑菌及诱食功能复合菌发酵液,为可持续生态水产养殖提供了新的微生物资源和技术方法。