鹅膏菌产抑菌物质培养条件优化及安全性分析

经前期试验验证鹅膏菌菌株AV对杨树烂皮病病原菌金黄壳囊孢菌有抑制作用,通过比色法和生物量测定结果得出其抑菌物质产生的最佳营养条件。在供试营养物质中,乳糖为最佳碳源,蛋白胨为最佳氮源,方差分析结果表明,碳源是鹅膏菌AV生物量及其抑菌物质产生的最主要影响因素,与其他营养元素差异显著(α=0.05)。培养基最佳组合为:①乳糖30.0 g/L,蛋白胨0.5 g/L,MgSO41.5 g/L,KH2PO44.5 g/L;②乳糖10.00 g/L,蛋白胨0.50g/L,MgSO40.75 g/L,KH2PO44.50 g/L;③乳糖30.0 g/L,蛋白胨2.0 g/L,MgSO41.50 g/L,KH2PO43.0 g/L。液体发酵培养时,菌株AV产生抑菌活性物质的最适培养条件为:pH值5～6,温度25℃,接种量1.25%,装液量50%,摇床转数180 r/min,培养时间20 d。当温度超过75℃,pH大于9或小于4时,或者紫外照射时间超过4 h都会使抑菌物质活性降低。小鼠毒性试验结果表明,小鼠饲喂菌株AV菌丝体,LD50为418.70 mg/kg,95%可信限为453.11～386.90 mg/kg,抑菌物质控制在2 g/L以内对小鼠无影响,因此,在进行病原菌防治时,为减少对环境中其他生物的影响,菌株AV抑菌物质质量浓度应低于2 g/L。     

芽孢杆菌BJ-6的抗菌物质及其抑菌作用

芽孢杆菌(Bacillussp.)BJ-6菌株分离自北京市门头沟区杏树根际土壤,室内抑菌测定发现BJ-6菌株对苹果轮纹病(Physalospora piricola)、苹果斑点落叶病(Alternaria mali)和苹果树皮腐烂病(Valsa mali)、白菜黑斑病(A.brassicae)、番茄灰霉病(Botrytis cinerea)、茄子黄萎病(Verticillium dahliae)的病原菌均有较强的抑菌作用。对其代谢产生的抗菌物质的稳定性测定表明:抗菌物质在偏酸性和中性条件下能够耐受121℃高温处理20 min;但在偏碱性条件下不具备热稳定性,热处理后失去原来的抑菌活性。采用硫酸铵分级沉淀得到抗菌粗蛋白,其中饱和度在30%~40%之间沉淀的蛋白抗菌活性最强。紫外吸收测定显示只有具有274 nm附近吸收峰的蛋白液有抑菌活性,且抗菌粗蛋白可引起白菜黑斑病菌菌丝畸形。     

香蕉枯萎病拮抗菌株BS11抗真菌活性物质的研究

[目的]对枯草芽孢杆菌BS11抗真菌活性物质进行研究,为该菌株的进一步开发应用提供参考。[方法]比较了枯草芽孢杆菌BS11在LB和NB培养基上的生长情况,比较了3种方法提取该菌株活性物质的效果,并探讨了该菌株的最佳培养条件。[结果]以香蕉枯萎病菌为指示菌,发现拮抗菌在LB和NA 2种不同培养基中有很明显的差别,LB培养基中生长繁殖速度快,但上清液活性很低,NA培养基中繁殖速度较慢,上清液活性却较好;乙醇沉淀法和乙酸乙酯萃取法均不能提取到活性物质,硫酸铵沉淀法基本上可将活性物质提取出来;BS11最佳的培养条件为初始p H7,温度30℃,通气量60 ml;发酵上清液有蛋白酶、纤维素酶活性,但没有几丁质酶活性。[结论]枯草芽孢杆菌BS11株所产的抗真菌活性物质具有性质稳定、广谱、易于提取等优点,为其应用于植物病害防治提供了理论依据。     

杯伞(Clitocybe sp.)培养条件Box-Behnken法优化研究

在Plackett-Burman试验设计结果基础上,采用Box-Behnken响应曲面法(responsesurfacemethodology,RSM)对影响杯伞(Clitocybesp.)AS5.112发酵胞外多糖与生长的关键培养条件(培养温度、时间和装液量)进行了探讨。结果表明,在培养温度为24.3～25.8℃、时间为9.7～10.2d和装液量为76.0～90.0ml条件下,每毫升发酵醪可获得>1253.00μg胞外多糖;而在培养温度为23.8～24.8℃、时间为9.6～10.3d、装液量为71.0～98.0ml范围内,每毫升发酵醪可获得8.32mg菌丝生长量。通过对胞外多糖曲面方程和菌丝干重二次多项回归方程解逆矩阵得知,在培养温度、时间和装液量分别为25.0℃、9.9d和83.4ml时,杯伞AS5.112胞外多糖的最大预测值为1265.45μg·ml-1发酵醪,在上述自变量分别为24.4℃、9.9d和87.1ml时,菌丝浓度可达8.50mg·ml-1发酵醪;在24.5℃、9.9d和84.7ml的条件下,每毫升发酵醪可同时获得1261.60μg胞外多糖和8.47mg菌丝量。验证试验证实了该方程的预测值与实际值之间具有较好的拟合度。     

Optimization of Cultivation Conditions for Exopolysaccharide and Mycelial Biomass by Clitocybe sp.Using Box-Behnken Design

Response surface(RSM)methodology based on a three-level three-factor Box-Behnken design of experiment was used to optimize the exopolysaccharide content(EPC)and the mycelium biomass in submerged cultivation by Clitocybe sp. AS 5.112. The critical factors selected for the investigation were cultivation temperature,time and volume of medium,based on the results of previous Plackett-Burman design. By analyzing the response surface plots,the optimum ranges of cultivation temperature,time and medium volume for obtaining over 1 253.00μgmL-1 of EPC lie in 24.3-25.8℃,9.7- 10.2d and 76.0-90.0 mL,respectively. While for obtaining over 8.32 mg mL-1 of dry cell weight(DCW),the above variables would be in the range of 23.8- 24.8℃,9.6- 10.3 d and 71.0 - 98.0mL,respectively. By solving the inverse matrix from the quadratic regression equations,the optimal conditions to gain 1 265.45μgmL-1 of EPC were 25.0℃,9.9d and 83.4mL,to gain8.50mg mL-1 of DCW were 24.4℃,9.9d and 87.1mL. In order to obtain the maximum yield of EPC and DCW at the same time,the above conditions would be 24.5℃,9.9d and 84.7mL,respectively,in this situation,the maximum predicted EPC and DCW were 1 261.60μgmL-1and 8.47 mg mL-1,respectively.. The experimental data under various conditions have validated the theoretical values.     

鹅膏菌的抑菌作用及活性成分的FT-IR分析

对鹅膏菌AV对病原菌的抑制效果和分离物的结构进行了初步分析。结果表明:鹅膏菌AV粗提物对病原菌的菌丝生长抑制率是68.27%,孢子处理8 d后未萌发,而对照5 d内即萌发。对粗提液进行柱层析分离得3个成分,其中分离物Ⅳ对病原菌的抑制效果最好,即生长抑制率是76.73%,孢子处理8 d后未萌发;分离物Ⅳ为鹅膏菌AV主要抑制病原菌的活性物质。通过对3个分离物进行FT-IR分析,可以看出3类物质均有酰胺的特征吸收,初步推断分离物Ⅳ为伯酰胺或仲酰胺类物质。试验证明FT-IR能够简便、快速地提供某些有机化合物主要官能团特征吸收的信息。     

芽孢杆菌BJ-6产抗菌物质发酵条件初探

芽孢杆菌(Bacillus sp.)BJ-6分离自北京市门头沟区杏树根围土壤,它能够产生对多种植物病原真菌有强烈拮抗作用的抗菌物质。采用单因素试验和正交试验进行了发酵条件的筛选,发现:芽孢杆菌BJ-6产生抗菌物质的最适液体培养基配方为麦芽糖20g,蛋白胨10g,麸皮10g,CaCO310g,Na2HPO32g,KH2PO31g和水1000ml;最适发酵条件为:接种种龄10h、接种量1%、发酵温度30℃￣35℃、转速为210r/min、培养时间60h和起始pH为9。     

盐碱地中溶磷真菌的筛选及培养条件优化

为缓解板结土壤中由于不溶性磷酸盐的积累过多对土壤造成的板结问题,从东北长期板结土壤中筛选出多株具有溶磷能力的溶磷真菌。通过解磷圈测量及钼蓝比色法对分别以磷酸钙、磷酸铝及磷酸铁为主的培养物中可溶性磷含量进行测定,获得了1株溶磷能力较大的菌株P10,其对磷酸钙、磷酸铝及磷酸铁的分解能力分别为250,13,31μg/m L,经分子生物学鉴定,该菌株为具疣蓝状菌(Vorte plave gljivice)。该菌的最佳碳源、氮源、p H及底物磷酸钙用量分别为蔗糖、大豆粉、p H 6.0及10 g/kg,优化后,可溶性磷含量达378μg/m L。     

假单胞杆菌BS1培养条件的研究

为了明确假单胞杆菌BS1的适宜培养条件,采用单因素筛选方案对其最适碳源、接种量、温度、pH值、盐浓度和培养基装液量进行研究,发现假单胞杆菌BS1生长的最佳碳源为液体石蜡,生长最适接种量为3%,温度30℃,pH 7.0,NaCl浓度0%,250 mL三角瓶中培养基装量为130 mL。在此优化的培养条件下,假单胞杆菌BS1生长曲线是0~48 h为菌体生长延滞期,48~156 h为菌体快速生长繁殖期,156~240 h为菌体生长稳定期,240 h后为菌体衰亡期。通过对假单胞杆菌BS1的最佳培养条件研究,将为工业化生产提供技术参数。     

赤松和火炬松针叶提取物抗霉菌活性的比较研究

[目的]研究赤松和火炬松针叶提取物的抗霉菌活性。[方法]采用滤纸片法,检测不同质量浓度的松叶提取物对霉菌的抑制圈大小。[结果]结果表明,松叶提取物具有抗霉菌活性,最低抑菌浓度和最佳抑菌浓度因提取物种类和浓度的不同而不同;松叶提取物具有抗霉菌活性,但抑制效果与其质量浓度不成正比;3种提取物中,乙醇提取物的抗霉菌效果最好,而丙酮和水提取物的抗霉菌效果次之。2种松中,赤松的抗霉菌活性最强,火炬松次之。[结论]该研究结果为开发具有明显杀菌作用的植物源农药提供基础资料。     

蜜环菌培养条件优化

蜜环菌营养丰富,具有药用价值,同时又是人工栽培天麻及猪苓的重要营养源。利用平板培养法,研究不同碳源、氮源、pH、温度对蜜环菌菌丝体生长的影响,获得蜜环菌的最佳培养条件。结果表明:在供试条件下,蜜环菌的最适生长温度为25~30℃,最适pH为5.0~7.0,最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是蛋白胨。     

蝴蝶兰离体再生条件的优化

以蝴蝶兰花梗为试验材料,研究不同浓度的6-BA和NAA组合对腋芽诱导的影响,并应用正交试验设计,研究了基本培养基、6-BA、NAA和椰乳浓度对萌发腋芽增殖的影响,并进行了生根培养。结果表明,蝴蝶兰花梗腋芽诱导的适宜培养基为MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.2mg/L+椰乳150mL/L,诱导率可达90.7%;萌发腋芽增殖的适宜培养基为MS+6-BA8.0mg/L+NAA0.2mg/L+椰乳150mL/L,增殖倍数达6.8;适宜的生根培养基为1/2MS+NAA0.4mg/L+活性炭1mg/L,生根率达93.3%。     

S15菌株的抗菌活性及抗菌物质的特性

为开发新的用于生物防治的抗真菌微生物资源,对从荆州郊区土壤中分离到的一株对多种植物病原真菌具有显著拮抗作用的链霉菌S15,用琼脂块法和杯碟法对其抗菌谱进行测定。结果表明,产生的拮抗物质对13种植物病原菌有显著抑制效果,其产生的代谢产物具有对小麦全蚀病病菌菌丝扭曲、缢缩等致畸效应。该物质对热稳定性较好,在酸性条件下易失活,在中性偏碱条件下比较稳定,此抗真菌物质有较强的极性。     

枯草芽孢杆菌J-4菌株产抑菌物质发酵条件优化

为了提高枯草芽孢杆菌J-4菌株发酵液中抑菌物质的含量,采用单因素试验和正交试验相结合的方法,对基础发酵培养基的组成(碳源、氮源、无机盐含量)和发酵条件(发酵时间、装液量、发酵温度、接种量)进行优化。优化后的培养基组成为葡萄糖1.00%、黄豆饼粉1.00%、MgSO_40.15%、Na_2HPO_40.10%、NaH_2PO_40.10%;发酵条件为发酵时间36 h、装液量100 mL(250 mL)、发酵温度37℃、摇瓶接种量5%。在此条件下,枯草芽孢杆菌J-4菌株抑菌圈面积提高50.25%。     

哈夫尼菌降解毒死蜱条件的优化及动力学模型建立

利用响应面法优化哈夫尼菌降解毒死蜱的条件,并建立了降解模型.采用Box-Behnken设计试验,以响应面法进行优化,结果表明,哈夫尼菌降解毒死蜱的最优条件为:蔗糖浓度0.31%.毒死蜱初浓度51.33 mg·L-1,培养温度30.7℃.在该条件下理论预测毒死蜱降解率可达74.7%.通过假设和验证,得出哈夫尼菌降解毒死蜱为一级动力学模型,哈夫尼菌能水解毒死蜱P-O键,属一级酶促反应.     

防霉剂对水霉菌的抑菌效果研究

本试验研究了丙酸钙、山梨酸钾、双乙酸钠、脱氢乙酸钠、异噻唑啉酮、尼泊金乙酯等6种常用的防霉剂对水霉游动孢子及菌丝的体外抑菌效果.结果表明,异噻唑啉酮与尼泊金乙酯在浓度分别为1.5和6.3 mg/L以上时可使80％的水霉游动孢子的活性被抑制,当浓度分别为8和32 mg/L以上时对水霉菌丝具有杀灭作用.而其它四种防霉剂对水霉孢子的抑制浓度、对水霉菌丝的杀灭浓度远高于实际生产中可能的使用浓度.本试验还研究了异噻唑啉酮与尼泊金乙酯对水霉菌的后抑菌效应以及两者的联合抑菌效应,异噻唑啉酮在不低于6.25 mg/L,尼泊金乙酯在不低于25 mg/L时能够显著减缓水霉菌丝的生长速率,12.5 mg/L异噻唑啉酮和25 mg/L尼泊金乙酯还能显著改变菌丝的形态.异噻唑啉酮与尼泊金乙酯对水霉菌的抑制具有协同作用,其肌指数为0.75.     

褐藻酸降解菌株S3的筛选分离及培养条件和产酶能力

利用褐藻酸钠作为唯一碳源筛选分离得到1株具有高褐藻酸酶活性的菌株S3,初步鉴定为革兰氏阴性杆菌。对菌株S3培养条件进行优化,褐藻酸钠和蛋白胨为最佳碳、氮源,NaCl质量分数为2%,在22℃、pH值7.5条件下,发酵S3菌株18h,褐藻酸酶酶活最高。继而研究了稀土元素对海洋微生物的生长及产酶能力影响,发现某些低浓度的稀土元素对菌株S7产酶有一定的促进作用,其中0.1mmol/L硝酸铈促进作用最强,促进率约31.1%,另外0.1mmol/L硝酸镧对菌株S3产酶能力的促进率也达到16.6%,而高浓度的稀土元素均有强抑制作用。研究结果为海洋微生物褐藻酸酶的进一步开发利用打下基础。     

植酸酶产生菌的选育及产酶条件研究

从不同来源的样品中分离筛选出1株热稳定性较好的植酸酶产生菌株X19,初步鉴定为Aspergillus.sp。对其进行诱变育种获得热稳定性和酶活均得到提高的正突变株A73,所产植酸酶在90℃下作用10 min,酶活仍保留93%。对菌株A73的最适液体培养基的组成和发酵条件的研究结果表明:培养基的最佳配比为6%玉米淀粉,1.0%葡萄糖,1.0%NaNO3,0.005%KH2PO4,0.05%MgSO4.7H2O,0.05%KCl,0.001%MnSO4.4H2O和0.001%FeSO4.7H2O;最佳培养条件为初始pH值5.5,培养温度28℃,摇床转速200 r/min,发酵时间96 h。在该条件下,摇瓶发酵酶活达到2 186 U/ml。     

小鼠胚胎电转外源物质条件的优化

旨在优化电转外源物质进入小鼠胚胎的条件,为电转CRISPR/Cas9系统进入小鼠胚胎进行基因编辑奠定基础。在不同的电转条件下分别将四甲基罗丹明标记的葡聚糖(Tetramethylrhodamine-labelled dextran)、带绿色荧光蛋白标记的质粒pLL3.7和体外转录的绿色荧光蛋白mRNA导入小鼠胚胎细胞,并进行培养,在荧光显微镜下观察胚胎发育状态,分析荧光染料进入胚胎及绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,高电压使胚胎成活率显著下降,低电压使电转效率显著下降。最适电压是110V,且小鼠胚胎2细胞期较1细胞期更适合电转。     

黄粉虫幼虫抗真菌物质的诱导及其抗真菌活性研究

[目的]研究用真菌诱导黄粉虫幼虫表达抗菌物质及其对真菌的影响。[方法]用黄粉虫幼虫从土壤中诱捕真菌,培养出2种病原真菌作为诱导源分别对黄粉虫幼虫做诱导试验,每种试验分别进行对照、菌刺和菌饲3种处理,并于处理后1、2、3、4和5 d分别提取抗菌物质,用平板琼脂打孔扩散法测定其抑菌圈直径而确定其抗真菌活性。[结果]结果表明,黄粉虫幼虫受真菌诱导后抗真菌活性比对照都有不同程度的增加,同时不同真菌诱导表达样品对于相应的诱导真菌均表现明显的抗真菌活性。说明不同真菌诱导产生的抗真菌物质与诱导源有关,抗真菌物质为黄粉虫幼虫体内固有成分,诱导增加了抗真菌物质的表达量,同时刺激新的抗真菌物质的产生。[结论]用真菌直接诱导黄粉虫幼虫可以产生抗真菌物质。