Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据获得的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒（DHVⅠ）RNA聚合酶基因序列，应用Primer Premier5．0软件设计了1对引物，建立了检测DHVⅠ的RT-PCR方法。该法能从DHVⅠ中扩增到440bp的条带，而对正常鸭胚尿囊液、健康鸭肝、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、雏鹅新型病毒性肠炎病毒、禽流感病毒（H5N2亚型）、鸭病毒性肿头出血症病毒、鸭源多杀性巴氏杆菌（5：A）的扩增结果均为阴性。该法最低可以检测到30pg的DHV工核酸模板。RT-PCR对DHVⅠ强毒CHv-1株人工感染发病死亡鸭肝的检测结果与病毒分离和Dot—ELISA检测结果的阳性检出率均为100％，对脾、肺、脑病料的检出率显著（P≤0．01）高于病毒分离和Dot-ELISA。RT-PCR、病毒分离和Dot—ELSA对1987～2005年采集且保存于-20℃的经病毒分离已确诊为鸭肝炎的临床送检肝病料的检出率分别为100％（19／19）、36．84％（7／19）和57．98％（11／19），对2000-2005年采集且于-20℃保存的来源于中国18个省份发病鸭群的48份肝病料的检出率分别为100％（48／48）、56．25％（27／48）和75．00％（36／48）。结果表明，建立的RT—PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于DHVⅠ的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

应用RT-PCR检测鸭肝炎病毒Ⅰ型感染

鸭肝炎病毒Ⅰ型(duck hepatitis virus Ⅰ,DHV Ⅰ)感染是雏鸭的一种急性高度致死性传染病,主要侵害4周龄以内的雏鸭,特别是1周龄以下的雏鸭最易感染,死亡率较高,是危害养鸭业最为严重的传染病之一[1].1945年在美国首次发现,我国于1963年在上海首次报道了该病的临床病例,至今,全国各养鸭地区均有不同程度的发生和流行.目前,已有多种检测DHV Ⅰ抗原的方法,如免疫电镜、Dot-ELISA和病毒中和试验等,这些方法在DHV Ⅰ的诊断中各有优势.PCR作为一种新的分子生物学检测技术,具有灵敏度高、快速、特异、操作简单等优点[2～4].本实验通过目前已发表的DHV Ⅰ基因组序列相对保守的区域设计引物,成功建立了RT-PCR方法检测鸭肝炎病毒1型.     

新型鸭病毒性肝炎病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank上登录的新型鸭病毒性肝炎病毒(N-DHV)基因组序列,设计合成内外2对引物,优化PCR反应条件,建立了检测新型鸭肝炎病毒的巢式RT-PCR方法.结果显示,该方法对Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)、新城疫病毒(ND)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸭病毒性肠炎病毒(DEV)、鸭细小病毒(DPV)的扩增结果均为阴性;该方法第1次扩增的敏感性是10 pg,第2次扩增的敏感性是0.1 pg,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍.结果表明,建立的巢式RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以准确快速检测出极低含量的N-DHV,解决了新型鸭肝炎病毒不易在组织病料中检出困难的难题,为新型鸭病毒性肝炎的快速诊断、净化及深入研究奠定了基础.     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)是雏鸭的一种高度致死性、病毒性传染病,以发病急、传播快、病程短、死亡率高为主要特征,临床表现痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状,病理变化以肝肿胀和出血为特征性病变,严重影响着养鸭业的发展.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)的基因序列,应用Oligo软件对DHV-1的保守基因3AB设计引物,以江西分离株(JXau-F)的RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到预期大小的目的基因。通过对该方法的敏感性和特异性的检测,结果表明,建立的利用RT-PCR检测DHV-1的方法具有良好的敏感性和特异性。该法最低模板检测量为20 pg,且只能检测出DHV-1,对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒和健康的鸭肝组织均不能检出。克隆、测序证实了扩增基因的正确性。通过对临床病料检测结果表明,该方法可用于Ⅰ型鸭肝炎病毒的快速鉴别诊断。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV—Ⅰ）A66株的RNA聚合酶基因序列,设计合成了2对引物,建立了适合DHV-I快速检测的逆转录套式PCR方法（RT-nested-PCR）,采用该方法对DHV-Ⅰ A66弱毒株和R85952强毒株进行了检测。结果显示,均能扩增到304bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝组织、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100Pg,第2次扩增的敏感性是1fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10^6倍。表明,所建立的逆转录套式PCR方法可用于鸭病毒性肝炎（DVH）的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等。     

血清3型鸭甲型肝炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

通过对GenBank公布的鸭甲型肝炎病毒全序列比对,在3型鸭甲肝炎病毒（DHVA-3）5’非编码区的保守区,设计了一对检测引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的阳性重组质粒经体外转录合成的RNA作为标准品绘制标准曲线,建立了一种快速检测DHAV-3的实时荧光定量RT—PCR方法。该方法能特异性地检测出DHAV-3,而与血清1型鸭肝炎病毒（DHAV-1）、鸭瘟病毒、新城疫病毒、禽流感病毒（H9）、呼肠孤病毒、传染性支气管炎病毒无交叉反应。在1．8×10^3～1．8×10^8copies／μL的检测范围内标准曲线线性关系较好,R2为0．992。敏感性试验表明,最低检测限为36拷贝数RNA。用该方法和胚半数致死量法对尿囊液中病毒含量进行检测,表明二种方法检测结果呈正相关。本研究所建立的检测方法特异性好,灵敏度高,且操作方便,可为该病毒的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒SYBR-Green实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、特异的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV-Ⅰ）SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据GenBank已登录的DHV-Ⅰ型疫苗株C80（DQ864514.3）的非编码区基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出230bp的靶序列,并克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒;将纯化的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准阳性模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并建立标准曲线,对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果显示,建立的标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系（R2=0.998 2）,产物Tm值为87.2～87.9℃,检测灵敏度为71.5拷贝/μL。对55份疑似病料进行检测,荧光定量检测48份为阳性,而用常规PCR方法只能检出39份阳性,ELISA方法只检出30份阳性。这表明所建立的DHV-Ⅰ的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和重复性良好等优点,可用于临床DHV-Ⅰ感染的快速检测,为DHV的分子诊断、流行病学调查及定量分析奠定了基础。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒PCR-DHPLC检测方法的建立

用RT-PCR结合变性高效液相色谱技术(DHPLC),建立Ⅰ型鸭肝炎病毒的快速检测方法.根据获得的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV I)RNA聚合酶基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了1对引物,RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测.以正常鸭胚尿囊液、正常鸭肝组织、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小...     

鸭Ⅰ型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法建立及初步应用

根据GenBank中鸭Ⅰ型肝炎病毒的基因序列,设计合成一对引物和一条Taq-Man探针。进行优化后,建立了能够检测鸭Ⅰ型肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,检测敏感性达到20个模板拷贝数,比常规PCR灵敏度高100倍;该方法特异性强,对番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鹅细小病毒等6种病原体的检测全为阴性。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,结果阳性率为1.69%。结果提示:在广西地区的鸭群中,存在鸭Ⅰ型肝炎病毒的感染,建立的荧光定量RT-PCR方法可用于鸭Ⅰ型肝炎病毒的临床快速检测。     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据Genebank中I型鸭病毒性肝炎病毒的基因序列,设计合成了2对引物,以山东、江苏、广东、河南等地分离株的RNA为模板进行RT-PCR扩增,均得到预期大小的目的片段,两对引物的检测结果一致。并对其中一种方法的敏感性、特异性进行了检测,结果表明本试验建立的用于I型鸭病毒性肝炎病毒诊断的RT-PCR方法具有较高的敏感性和特异性,最低RNA模板检出量为100pg,只能特异的检测出I型DHV,不能检出NDV、IBDV、DPV和GPV。因此,所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于鸭病毒性肝炎病毒的快速鉴别诊断。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒的研究进展

鸭病毒性肝炎是鸭的五大传染病之一,由于近年鸭肝炎(Ⅰ型)发病率的不断上升,以及变异株的不断出现,养鸭比较集中的地区都遭受了巨大的经济损失和严重的威胁。随着病毒基因组的测序的完成,为该病毒的研究有了一些新的认识和思路。本文从病毒的流行病学、基因组结构和功能以及病毒的检测方法等方面,阐述了DHV-I的最新研究进展,为该病的防治提供理论基础。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立

根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针.对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法.该方法敏感性好,对鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的检测敏感性均达到200个模板拷贝数;该方法特异性强,对鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性.本研究建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒感染的检测.     

鸡病毒性关节炎实时荧光RT-PCR检测方法的建立

本文旨在建立实时荧光RT-PCR方法检测鸡病毒性关节炎病原,针对特异性的禽呼肠孤病毒S1基因设计了1对引物及探针,经优化反应体系,确定引物和探针的最优浓度配比,建立了鸡病毒性关节炎实时荧光RT-PCR检测方法。结果显示:该方法灵敏度高、特异性强、检测时间短,可应用于鸡病毒性关节炎的普查监测和检验检疫。     

1型鸭肝炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建

参考1型鸭肝炎病毒基因组序列,设计7条引物,用RT—PCR方法扩增出覆盖整个病毒基因组三个忠实性片段,并按顺序组装进载体pBR322中,获得全长cDNA克隆。测序结果表明,该克隆与母本毒序列同源性达99．6％,并且5’端的T7启动子和3’端的Mlu I线性化位点均成功引入。     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定

从福州某鸭场大批发病和死亡的15～20日龄雏鸭肝脾中分离到1株病毒，该病毒无血凝性，可使4日龄健康鸭90．6％发病、62．5％死亡，利用Ⅰ型鸭肝炎病毒（DH）标准血清进行鸡胚中和试验和血清被动免疫保护试验，证明该分离的病毒株为I型DHV。     

新型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已发表的1型鸭病毒性肝炎(duck hepatitis virus type 1,DHV-1)和新型鸭病毒性肝炎(new type duck hepatitis virus,N-DHV)全基因序列,在非同源区域设计一对新型鸭病毒性肝炎特异性引物P1/P2,对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒细胞毒、流感病毒等鸭常见病病原进行RT-PCR扩增.结果表明引物特异性良好,引物P1/P2仅能特异性扩增出N-DHV的638bp基因片段;敏感性试验结果表明:N-DHV RNA最低检出量为21 pg.同时对临床样品的检测中发现DHV-1和N-DHV存在混合感染的情况.该方法的建立为鸭病毒性肝炎病毒尤其是新型鸭病毒性肝炎病毒的鉴定及快速诊断提供了可靠的依据.     

鸭病毒性肝炎的鉴别与防治

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种病死率高的急性、接触性传染病。本病有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个血清型。这三个型病毒在血清学上有明显差异，无交叉免疫性。Ⅰ型鸭肝炎病毒又称古典株，我国流行的鸭病毒性肝炎病毒多属此型。[第一段]     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因克隆及其原核表达

根据Genbank中的Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的包含有EcoRV和xhoⅠ酶切位点的引物，用该特异性引物从Ⅰ型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1，以相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体，经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序证明目的基因正确插入了表达载体，转化宿主菌RossetaⅡ，用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达，收集菌液进行SDS-PAGE电泳，Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明，VP1在大肠杆菌RossetaⅡ中表达量较高，表达产物的分子量约为48ku、并能被Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清所识别。Ⅰ型鸭肝炎病毒VPI蛋白在大肠杆菌RossetaⅡ中表达产物具有免疫原性。     

NDRV和MDRV双重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种能够同时快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的方法,根据GenBank上已发表的2种病原S3基因保守序列,设计合成2对特异性引物。经条件优化后,建立了检测NDRV、MDRV的双重RT-PCR方法,扩增2种病毒的片段,大小分别为298 bp和189 bp。试验表明,该方法具有良好的特异性和敏感性。采用该方法对在广东省不同地区采集的42份鸭病料样品进行检测的结果与单一RT-PCR结果一致,均检出19份感染NDRV的病料和8份感染MDRV的病料,表明该方法可用于临床样品检测。