碱性磷酸酶细胞化学法检测体外培养精原细胞

 分别培养2日龄、6日龄及12日龄小鼠生精上皮细胞48～96 h,并进行碱性磷酸酶（AP）细胞化学染色,以及波形蛋白（vimentin）和c-Kit受体蛋白免疫细胞化学染色,观察细胞形态及染色特性,以研究不同日龄小鼠生精上皮细胞在体外培养时形态及AP特性,建立一种简便可行的检测精原细胞的方法。结果,管周细胞为不规则形状,呈vimentin⁺反应、c-Kit^－反应和AP⁺反应;幼稚型及正成熟的支持细胞（Sertoli cell）为大小不等的不规则形状,呈vimentin⁺反应、c-Kit^－反应和AP^－反应;6 日龄小鼠精原细胞为圆球形或近似圆球形,呈vimentin^－反应和c-Kit⁺反应。生殖细胞中,前精原细胞（性原细胞）和精原细胞均呈AP⁺反应,部分精母细胞也呈AP⁺反应。研究结果表明,在没有前精原细胞及精母细胞的培养体系中,可以借助细胞形态和AP活性两项指标检测其中的精原细胞。     

小鼠心肌细胞的体外培养

对采用组织块法和酶消化法体外培养小鼠心肌细胞的结果进行了比较,并对体外培养心肌细胞的生理活性进行了初步测定。结果表明,用组织块法分离培养胎、乳鼠心肌可得到自主节律性搏动的心肌细胞;分别用1g/L胶原酶+10g/LBSA,0.5g/L胰酶+1g/L胶原酶,1g/L胰酶分离培养胎、乳鼠心肌,均可得到大量心肌细胞,且细胞活力较好,能自主博动20d以上;用上述2种方法分离培养成年鼠心肌,结果均不理想;在载有自主节律性搏动的小鼠心肌功能性细胞团的培养皿中加入Ca2+和肾上腺素后,细胞团搏动速度加快,搏动力加强;加入K+后则细胞团搏动速度减缓,搏动力减弱,其对钾、钙、肾上腺素的反应与在体内基本一致,表明体外培养的小鼠心肌细胞具有与在体心肌细胞相似的功能。     

昆明小鼠单细胞胚胎体外培养的研究

本试验研究了葡萄糖、EDTA和小鼠血清对昆明小鼠单细胞胚体外发育的影响.结果发现:不含葡萄糖HECM-1组桑椹率为40.05％,对照组为8.14％;含EDTA的CZB组桑椹率为61.18％,对照组为47.44％;小鼠血清对昆明小鼠单细胞胚体外发育无促进作用。可见,葡萄糖抑制昆明小鼠单细胞胚胎体外发育;在不含葡萄糖的条件下,EDTA支持小鼠早期胚胎体外发育;无论有无葡萄糖小鼠血清对小鼠早期胚体外发育无促进作用。     

小鼠早期胚胎体外培养的实验研究

本试验采用国产化学试药和哈尔滨地区的天然水,制备了 Brinster 化学合成培养液。把160枚通过超数排卵获得的2-细胞期小鼠胚胎放在添加适量牛血清白蛋白或胎牛血清的 Brinster 化学合成培养液内,并在适当湿度、5%CO_2和95%空气的气相环境、37℃温度条件下培养。58小时后,大约67%4小鼠2-细胞期胚胎发育到桑椹胚阶段;大约32%的小鼠桑椹胚发育到囊胚期阶段。试验证明,用国产化学药品和哈尔滨地区水配制的培养液可以对早期小鼠胚胎进行体外培养研究。     

小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养

为了探讨小鼠卵巢颗粒细胞体外生长的特点及增殖的调控因素,分别添加2μg/mL胰岛素、50ng/mL FSH和20 ng/mL EGF的培养液培养小鼠卵巢颗粒细胞,每隔24 h对细胞进行计数,研究其对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。此外,还对培养过程中出现的卵巢颗粒细胞集落进行了AKP染色和C-kit免疫组化染色鉴定。结果显示,在培养的第4天添加EGF组和FSH组与对照组相比均具有显著的促增殖作用(P<0.05),添加胰岛素组促增殖作用不显著(P>0.05);卵巢颗粒细胞集落经AKP染色和C-kit免疫组化染色均呈阳性。提示EGF和FSH对小鼠卵巢颗粒细胞具有促增殖效应,小鼠卵巢颗粒细胞具有干细胞的部分特性。     

克服小鼠早期胚胎体外培养发育阻滞的研究

为探讨不同培养基及共培养对克服小鼠早期胚胎体外发育阻滞的影响,用不同成分组成的5种常用培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养,后以KSOM作为基础培养基,KSOMFBS为对照,分别与小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和卵丘细胞(CC)进行共培养,观察从2细胞发育到4细胞的胚胎数和囊胚数的变化。结果发现5种培养液中从2-细胞发育到4-细胞的胚胎率为30.5%~43.5%,差异不显著。KSOM组囊胚率为40.9%,显著高于其他各组(27.9%~30.0%)。共培养后,各组中克服发育阻滞的胚胎数和囊胚数均有显著提高,其中添加胎牛血清组4细胞胚胎数和囊胚数显著高于不添加组,输卵管上皮细胞组显著高于卵丘细胞组。结果显示共培养对克服小鼠2-细胞发育阻滞作用明显,添加胎牛血清效果明显好于不添加,输卵管上皮细胞共培养效果好于卵丘细胞。     

温度对冻存小鼠精原细胞的复苏效果

 采用不同温度对冻存后的小鼠精原细胞进行复苏,测定细胞复苏率。4 ℃,37 ℃,67 ℃及97 ℃时的细胞复苏率分别为29.7%,87.6%,88.8%及86.4%。37 ℃,67 ℃及97 ℃的细胞复苏率之间在统计学上无显著性差异。结果表明:37～97 ℃复苏小鼠精原细胞均可获得较好的复苏效果,而4 ℃对小鼠精原细胞复苏不利。     

体外培养小鼠生精细胞的形态学

利用姬姆萨原液和瑞-姬染色法对30～35日龄小鼠精液和睾丸组织培养后的生精细胞和精子进行形态学鉴定.结果表明,用姬姆萨原液染色鉴定,精子形态清晰,细胞膜边缘清楚,呈紫红色,未成熟精子的染色程度浅于成熟精子;经过培养的睾丸组织用姬姆萨原液染色,生精细胞形态清晰,细胞核呈颗粒状,开始呈现深紫红色,胞质粉红色且带有蓝色背景,颜色较深,一定时间后颜色变浅;瑞-姬染色生精细胞形态完整清晰,细胞核、核仁、胞质分别呈现不同颜色.     

添加物对小鼠腔前卵泡体外培养的影响

为探讨培养添加物对小鼠腔前卵泡生长成熟的影响,在培养液中分别加入不同体积分数的犊牛血清（ＦＣＳ）,牛卵泡液或添加促性腺激素,对小鼠腔前卵泡进行了培养。结果表明,５％以上犊牛血清明显提高腔前卵泡存活率,而１０％以上犊牛血清能明显促进卵泡的生长发育,２０％以上牛卵泡液可抑制卵母细胞的体外自发成熟分裂,并能促进腔前卵泡的生长发育,在不含犊牛血清的培养液中加入促卵泡素（ＦＳＨ）,促黄体素（ＬＨ）或ＦＳＨ＋     

不同浓度的FBS和hLIF对小鼠原核期受精卵体外发育率的影响

通过在mM16培养液中添加不同浓度的FBS及hLIF,探讨小鼠原核期受精卵的体外培养条件,旨在建立稳定的小鼠原核期受精卵的体外培养系统。实验结果表明:在mM16中添加10%或15%的FBS都可降低胚胎在体外的发育率,其体外囊胚发育率与对照组mM16(未加血清组)差异显著(73.3%对32.6%;73.3%对35.8%);5001、0001、500 IU/ml 3种不同浓度的hLIF都可提高小鼠受精卵体外发育率,三者之间差异不显著,但以添加1 000 IU/ml hLIF组中,桑椹胚/囊胚率及囊胚脱出率为最高。结论:在mM16中添加血清不能有效地支持小鼠受精卵在体外的发育,添加1 000 IU/ml hLIF能够很好地支持小鼠受精卵的体外发育。     

食用仙人掌离体培养的研究

对食用仙人掌茎盘组织的离体培养特性研究结果表明,茎盘组织形态学上端、中端的刺座芽(休眠芽)诱导发育率高,不同层次的刺座芽诱导发育率差异不显著.细胞分裂素6-BA和KT对刺座芽的诱导发育效果好,而单激素KT 1.0 mg/L水平对刺座芽无明显诱导发育效果.     

丽格海棠的离体培养及快速繁殖

为了探索丽格海棠杂合体母株优良性状的保存方法,以便快速有效地进行丽格海棠种苗的生产,以丽格海棠的叶片做外植体进行了离体培养和快速繁殖研究。经实验筛选出各培养阶段最适宜的培养基:①芽分化培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+GA30.2 mg/L;②芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L;③生根培养基1/2MS+NAA 0.5 mg/L,上述培养基均添加2.5%蔗糖,0.8%琼脂,pH值为5.8。     

苹果三倍体成熟胚的离体培养研究

以苹果三倍体乔纳金成熟胚为材料,在含不同激素或添加物的培养基上进行萌发出苗培养,结果表明:F14+活性炭1.0g/L+水解乳蛋白400mg/L+抗坏血酸100mg/L为最适宜培养基;光照培养比黑暗培养好;培养基中添加0.5mg/L的6-BA和0.2mg/L的NAA能有效促进萌动胚的胚根伸长和发育成苗。     

外源激素在玉米离体培养中的作用研究

以玉米自交系黄早4、综31的幼胚为材料,对外源激素在玉米离体培养中的作用进行了研究。结果表明,2.0 mg/L的2,4-D可以诱导出高频率的胚性愈伤组织,而添加高浓度的6-BA不利于胚性愈伤的诱导;6-BA(0.5 mg/L)+KT(1.0 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)的激素组合对于胚性愈伤组织的分化明显优于其他的激素组合;单独使用1.0 mg/L的NAA有利于根的生长和发育,虽然NAA1.0 mg/L+多效唑2.0 mg/L的激素组合中,根的平均数量和平均长度不如单独使用1.0 mg/L的NAA,但是幼苗的移栽成活率二者无显著差异。     

黑芝麻不同外植体离体培养研究

以黑芝麻无菌苗的下胚轴、幼根、子叶为外植体,以MS+2,4-D1.5mg/L+ZT0.5mg/L为愈伤组织诱导培养基;MS+6-BA2mg/L-IAA0.5mg/L为分化培养基;1/2MS+0.5mg/LNAA+IAA0.25mg/L为生根培养基进行培养.结果表明,幼根能产生少量愈伤组织,尚未分化出苗;子叶愈伤组织能分化出苗,但分化率低;下胚轴愈伤组织不仅可分化出苗(分化率为36%),而且可形成大量具有分化潜力的胚性愈伤组织,分化绿苗的频率可达67%.     

非洲紫罗兰组织离体培养及快速繁殖

以MS为基本培养基研究了离体条件下非洲紫罗兰叶片外植体的快速繁殖技术。结果表明 :6 -BA诱导外植体出芽的效率明显优于KT和ZT ,其中 6 -BA 0 .5mg·L-1+NAA 0 .5mg·L-1的组合诱导效率最高 ,诱导频率可达 10 0 % ;1/2MS附加NAA 0 .2mg·L-1并添加 0 .2 %活性炭的培养基诱导生根最为适宜 ,生根率达 10 0 %。     

胚胎干细胞体外培养研究进展及设想

胚胎干细胞具有高度复制能力及多向性分化潜能,近年来由于胚胎干细胞的分离、培养技术的提高,尤其是对干细胞表面分子标记和诱导分化研究的深入,胚胎干细胞展示出很好的临床应用前景,同时也将为基因功能研究、药物研究提供良好的工具。但对基因组印迹、免疫排斥及干细胞的有效定向分化仍然是亟待解决的问题。