鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗的构建及鉴定

[目的]构建含鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK抗原基因及鸡IFN-γ基因的三价DNA疫苗。[方法]应用SOE-PCR将3-1E、CD-PK和鸡IFN-γ共3个基因通过2个（GGGGS）3连接子相连,扩增出IFN-γ/3-1E/CDPK三价融合基因,将其克隆入真核表达载体proVAX中构建三价融合真核表达质粒proIEC,后用双酶切和PCR进行鉴定。阳性重组质粒提取纯化后体外转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表达情况。[结果]经双酶切和PCR鉴定证实鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗构建成功,且在PK-15细胞中获得了成功表达。[结论]鸡柔嫩艾美耳球虫IFN-γ/3-1E/CDPK三价DNA疫苗构建成功,为进一步探讨其免疫保护性奠定了基础。     

猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位

为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV-Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3。采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达。结果表明,成功构建重组表达质粒pMyc-NS3,Western blot表明,NS3蛋白在PK-15细胞和293T细胞中均得到表达,NS3在PK-15和293T细胞质中呈弥散性分布。说明,成功构建的猪瘟病毒NS3基因与Myc融合表达质粒,为验证NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株GP5基因的克隆及在293T细胞中表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCC VR-2332株GP5基因序列设计1对特异性引物,应用RT—PCR方法扩增PRRSVHn／06-1分离株GP5基因片段．将扩增片段克隆到真核表达载体pcDNA3．0中,测序后用DNAstar序列分析,构建的pcDNA—GP5重组质粒瞬时转染293T细胞,48h后用Western-blot检测。证明GP5基因在293T细胞中获得了表达,可与PRRSV阳性血清发生特异性反应．     

鸡ANP32家族蛋白亚细胞定位及其在免疫器官中的表达特征分析

【目的】明确鸡ANP32家族蛋白的亚细胞定位及在不同月龄鸡免疫器官中的表达特征,为后续研究鸡ANP32家族蛋白与新城疫病毒（NDV）复制及其致病性的关系打下基础。【方法】分别构建鸡ANP32家族基因重组真核表达载体,转染HEK-293T细胞后进行诱导表达,利用Western blotting检测融合蛋白表达情况,并通过荧光观察分析融合蛋白亚细胞定位;同时采用实时荧光定量PCR检测ANP32家族基因在1～6月龄鸡免疫器官（脾脏、胸腺和法氏囊）中的表达水平。【结果】成功构建了鸡ANP32家族基因重组真核表达载体pEGFP-C1-ANP32A、pEGFP-C1-ANP32B和pEGFP-C1-ANP32E,转染HEK-293T细胞后得到正确表达,获得携带EGFP标签的融合蛋白EGFP-ANP32A、EGFPANP32B和EGFP-ANP32E,其分子量分别为60.0、57.9和56.9 k D。亚细胞定位分析结果表明,融合蛋白EGFP-ANP32A、EGFP-ANP32B和EGFP-ANP32E的荧光与细胞核荧光完全重合,即主要定位在细胞核。实时荧光定量PCR检测结果表明,ANP32家族基因...     

鸡痘DNA疫苗pVAX-env的构建及其体内外表达

利用PCR技术将鸡痘病毒env基因亚克隆到pVAX1真核载体上,构建了含有该基因的真核表达质 粒pVAX-env。将质粒pVAX--env体外瞬时转染BHK21细胞通过间接免疫荧光检测蛋白表达。将pVAX-env质粒肌肉注射免疫14日龄雏鸡,通过RT-PCR和组织免疫荧光检测体内质粒表达。结果表明,成功构建了真核表达质...     

猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备

[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.     

新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础.     

弓形虫AMA1蛋白真核表达载体的构建及免疫活性检测

[目的]构建弓形虫AMA1基因的真核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况。[方法]运用PCR方法和克隆技术,构建pcD-NA3.1-AMA1重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK-293细胞,用Western blotting法检测其在体外的表达情况。[结果]从弓形虫RH株cDNA中扩增出AMA1基因片段,成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-AMA1,转染AMA1基因的HEK-293细胞表达产物经Western blotting鉴定,其分子量约为70kD,能被特异性免疫血清所识别。[结论]构建的真核表达质粒pcDNA3.1-AMA1能在HEK-293细胞中表达,为下一步弓形虫DNA疫苗的研究奠定了基础。     

鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达及其抗病毒活性

[目的]研究鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达并检测其抗病毒活性。[方法]将鸡的Mx基因克隆入pEGFP-C1载体,经筛选鉴定后磷酸钙法转染293T细胞,并对转染细胞进行荧光分析以及RT-PCR与Western blot鉴定,同时提取细胞蛋白质,微量细胞病变试验检测其抗新城疫病毒的活性。[结果]试验构建的pEGFP-C1-cMx真核表达载体转染293T细胞后,在胞浆中可检测到绿色荧光,RT-PCR与Western blot结果进一步证实,pEGFP-C1-cMx可在293T细胞中表达,微量细胞病变试验显示,表达的融合蛋白可保护鸡胚成纤维细胞免受新城疫病毒感染。[结论]试验构建的pEGFP-C1-cMx表达载体可在293T细胞中表达具有抗新城疫病毒活性的鸡Mx蛋白。     

丙型肝炎病毒囊膜蛋白基因疫苗的构建及其诱导小鼠体液免疫应答

将丙型肝炎病毒（HCV）H77株全长囊膜蛋白基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游，采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞，用流式细胞仪检测细胞瞬时表达的目的蛋白。将构建的重组质粒肌注BALB/c小鼠，用表达HCV囊膜蛋白的SP2/0细胞作为抗原，用流式细胞仪检测小鼠血清HCV囊膜蛋白抗体。再用原核系统表达的E2蛋白作为抗原,Western Blot检测免疫小鼠血清抗体。试验结果显示,囊膜蛋白E1E2在293T细胞膜上进行了瞬时表达，基因疫苗免疫小鼠后产生了抗HCV囊膜蛋白的抗体，该抗体能与表达HCV囊膜蛋白的SP2/0细胞特异性结合，Western Blot表明该抗体也能与原核系统表达的E2蛋白结合。     

猪瘟病毒DNA疫苗的构建及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)C株E2囊膜蛋白全长基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游,采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞,流式细胞仪(FACS)检测293T细胞瞬时表达了E2囊膜蛋白。将构建的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠,用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测证明成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体,为下一步利用DNA疫苗免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

丙型肝炎病毒囊膜蛋白基因E1E2在真核细胞中的表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将丙型肝炎病毒（HCV）H77株E1E2囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中，构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E1E2，用重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒磷酸钙共沉淀法转染293T细胞,包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞，经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞仪技术（FACS）分析，结果表明,HCV E1E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E1E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠，经FACS分析免疫鼠血清，成功诱导小鼠产生了抗HCV E1E2蛋白的抗体，Western blot检测结果表明该抗体能与原核系统表达的E2蛋白结合。     

广西巴马小型猪SP1基因克隆测序及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以pEGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照.[结果]克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与GenBank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸.广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%.构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白.[结论]广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究.     

新城疫病毒HN基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT—PCR方法扩增新城疫病毒HN基因并将其克隆至T载体,测定其核苷酸序列。尔后用PCR扩增球状头部编码区,并将其克隆至pSOC质粒soc基因3端EcoR Ⅰ位点,重组质粒pSOC—HN转化E．coli BL-21(DE3)感受态细胞。以终浓度1mmol／L的IPTG诱导表达,在SDS—PAGE凝胶上可检测到分子量约67KD的融合蛋白特异条带,west—blot证实表达产物与NDV抗血清具有良好的反应性。     

具有绿色荧光标记的表达T7 RNA聚合酶稳定细胞系的建立

[目的]建立具有绿色荧光标记表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞系。[方法]从BL21（DE3）大肠杆菌中克隆出T7RNAP基因,定向克隆质粒FG12后,构建了表达T7 RNA聚合酶基因（T7）的Lenti-virus重组质粒FG12-T7 RNAP。用此重组质粒转染293T细胞,WB可检测出瞬时表达的T7 RNAP蛋白;利用辅助质粒对表达T7的非复制型Lenti-virus病毒进行体外包装,所获得的非复制型Lenti-virus病毒感染BHK-21细胞,利用GFP通过流式细胞分选仪筛选表达T7的细胞系,并利用WB检测基因的表达。[结果]通过WB检测出不同代次的阳性细胞中均能稳定表达目的基因T7 RNA聚合酶。[结论]T7 RNA聚合酶能顺利在真核细胞内表达,并在此基础上建立的稳定细胞系为RNA病毒体内拯救技术平台的建立奠定了基础。     

具有绿色荧光标记的表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞系的建立

[目的]建立具有绿色荧光标记的表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系。[方法]从BL21（DE3）大肠杆菌中克隆出T7RNAP基因,定向克隆进质粒FG12后,构建了表达T7RNA聚合酶基因（T7）的Lenti-virus重组质粒FG12-T7RNAP。用此重组质粒转染293T细胞,WB可检测出瞬时表达的T7RNAP蛋白;利用辅助质粒对表达T7的非复制型Lenti-virus病毒进行体外包装,所获得的非复制型Lenti-virus病毒感染BHK-21细胞,利用GFP通过流式细胞分选仪筛选表达T7的细胞系,并利用WB检测基因的表达。[结果]通过WB检测出不同代次的阳性细胞中均能稳定表达目的基因T7RNA聚合酶。[结论]T7RNA聚合酶能顺利在真核细胞内表达,并在此基础上建立的稳定细胞系为RNA病毒体内拯救技术平台的建立奠定了基础。     

微小牛蜱Bm86基因的克隆与原核表达

根据已发表的Bm86基因序列,设计表达型引物,利用RT-PCR技术,从微小牛蜱饥饿幼蜱的研磨物中扩增Bm86基因,将PCR产物连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86.测序分析表明:克隆的微小牛蜱Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97%和95.6%.然后对重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86进行双酶切,获得带有粘性末端的Bm86基因片段,并将此片段定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Bm86,将其转化到BL21宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测表明表达产物为分子量为88 Ku的融合蛋白,目的蛋白约占蛋白总量的39%,表达量约为1.08 mg/mL.Western blot分析表明此表达产物能被兔抗微小牛蜱阳性血清所识别.     

重组腺病毒介导的猪瘟 E0基因在山羊乳腺中的表达

为使猪温病毒(CSFV)E0蛋白在奶山羊乳腺中得以合成和分泌,一段上游带有信号肽和His标签序列的CSFVE0基因通过腺病毒穿梭载体被插入到腺病毒质粒中,将此重组质粒转染293A细胞包装得到重组腺病毒Ad-hisE0。为证明其有效性,用Ad-hisE0感染293A细胞,实时定量PCR检测显示E0基因的表达显著提高。用Ad-hisE0分别感染牛乳腺上皮细胞和泌乳期山羊乳腺,SDS-PAGE和Western blot分析结果显示出E0蛋白分别位于26ku和48ku处的2条特异性条带。证实构建的腺病毒Ad-hisE0可以介导重组融合蛋白CSFV E0在山羊乳腺中的表达和分泌。