Erwinia chrysanthemi 分离株CSCL006 hrpN 基因的克隆与高效表达

通过构建Erwinia chrysanthemi分离株 CSCL006的DNA文库，克隆出hrpN CSCL006基因，测序结果显示该基因编码区长1 020 bp; 推导的harpinCSCL006与Erwinia chrysanthemi EC16和3937编码的harpin蛋白同源性高，但与其它软腐菌 的harpin蛋白同源性较低; 在大肠杆菌中(Escherichia coli) 高效表达了hrpN CSCL006基因，重组harpinCSCL006蛋白分子量为34 kD。以抗harpinEcc 的抗体为探针,Western blot 证实该蛋白确为harpin; 纯化的harpinCSCL006, 能引起烟叶的过敏反应。     

巴西固氮螺菌Yu62glnZ基因及其相邻基因的克隆和序列分析

通过原位杂交从巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense)Yu62的基因组文库中获得glnZ基因的阳性克隆，对该阳性克隆进行亚克隆和序列分析，结果表明glnZ基因位于3.7kb的SaLI片段上，glnZ基因编码区长336bp，编码的产物是Pz蛋白，由112个氨基酸组成，分子量为1.12kD。用Blastax软件对Pz蛋白的氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源比较，结果表明Pz蛋白与其它几种固氮菌及大肠杆菌的GlnK蛋白的同源性（identities）达66％以上；与PⅡ蛋白的同源性达64％以上。glnZ基因上游是部分ubiH-like基因，与E.coli ubjH基因（编码辅酶Q，ubiquinone)N－端有31％的同源性（identity）和50％相似性（similarity)；glnZ基因下游是aat-like基因，与E.coli和Bacillus subtilis aat基因（编码天冬氨酸氨基转移酶，aspartate aminotransferase)有同源性和相似性都为26％和42％；aat-like基因下游是部分ftsK-like基因，与E.coli ftsK基因（编码肽聚糖，peptidoglycan)N-端有42％同源性和56％相似性，这几个基因在GenBank中的登录呈是AF279917。     

RT-PCR克隆籼稻叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA及序列的in silico分析

根据日本晴cab4基因序列（GenBank：AK104499.1）设计引物,用RT-PCR的方法从籼稻9311中克隆了叶绿素a/b结合蛋白基因的全长cDNA,命名为cab-9311（cab gene from 9311）。insilico分析表明：cab-9311与cab4基因同源性为99%,编码的蛋白含有244个氨基酸,与cab4基因编码的蛋白同源性为98%。蛋白分子质量为26.9kD,理论等电点为6.52。第54位～第216位氨基酸是一个典型的叶绿素a/b结合蛋白功能域（chlorophyll a/bbinding domain）。跨膜分析和蛋白质三级预测显示,该蛋白在C端有一个典型的跨膜区。亚细胞定位分析表明该蛋白定位于叶绿体,是一个叶绿体内囊体膜上的锚定蛋白。     

洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19嗜铁素合成相关基因cepR的克隆及生物信息分析

本研究采用PCR方法克隆了洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19嗜铁素合成相关基因cepR,并对cepR基因编码蛋白的结构和功能进行生物信息学分析和预测。同源性分析表明,CAS19的cepR核苷酸序列与Burkholderiacepacia LMG1222cepR基因的同源性为99％;cepR基因全长768bp,包含一个完整的231bp的开放阅读框架,编码239个氨基酸;该基因编码蛋白分子量为26．59kD,理论的等电点为5．55,含有一个LuxR型HTH结构域,在氨基酸残基的不同区域分布有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点和N-糖基化位点,还有一个明显的跨膜结构。本研究结果将为洋葱伯克霍尔德氏菌嗜铁素合成相关研究提供调控基因信息和参考依据,并为其进一步开发和利用奠定基础。     

花生种子芽期耐低温相关基因克隆

利用GeneFishing技术获得耐低温花生品种花育44号种子在常温与低温诱导下的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)ACP20和ACP2。BLAST比对后发现ACP20基因与花生油质蛋白基因同源性达99%,ACP2基因与花生nifU-like(铁硫簇蛋白)蛋白mRNA同源性达99%,说明油质蛋白和nifU-like蛋白可能与花生对低温逆境胁迫的抗性有关。通过RACE技术从该品系获得相关基因的完整编码区,对其进行生物学功能预测,为探讨花生耐低温分子机制乃至培育耐低温花生新品种奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型SC株ORF3基因克隆及其编码蛋白的生物信息学分析

本研究根据GenBank登录的猪圆环病毒基因组序列(DQ180392.1)来设计引物,用PCR法扩增出PCV-2四川株(PCV-2SC)ORF3基因,并克隆到PMD19-T载体进行测序,同时利用在线生物信息学软件及数据库对ORF3基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。研究结果表明,成功构建了命名为P-S-PCV-2SCORF3的重组质粒;测序结果得知PCV-2SCORF3基因全长315bp,共编码104个氨基酸;BLAST比对发现该基因与GenBank中国内外参考毒株核苷酸同源性在98%~100%之间。利用在线生物信息学软件对PCV-2SCORF3编码蛋白结构特征进行分析,发现该蛋白含有12个潜在的磷酸化位点,ORF3成熟蛋白有4个主要的抗原位点;亚细胞定位分析结果表明,编码蛋白主要存在于线粒体中和细胞核中并各占43.5%和34.8%,这证实了PCV-2SCORF3编码蛋白属于胞质蛋白,抗原区位集中于胞膜,有向胞核移动的趋势,功能强大,可能与细胞凋亡有关。疏水性分析发现,该编码蛋白具有一定的疏水性,与该蛋白的表面抗原决定族和膜蛋白中穿越膜的肽片段及该蛋白的高级结构的形成有关,预示其高疏水性区又与膜蛋白的跨膜区有...     

结球甘蓝BoFBX117基因的克隆与表达分析

F-box基因在植物组织器官发育及非生物胁迫响应中起着重要的作用。为进一步探讨其作用机制,从结球甘蓝品种BoJF-16-1中利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆得到一个F-box基因BoFBX117,其cDNA全长为936 bp,编码311个氨基酸,蛋白分子量为30.14 kDa,等电点为9.71。该基因编码BoFBP7蛋白,序列同源性分析表明,BoFBP7与芜菁、萝卜、拟南芥的FBP7蛋白亲缘关系较近,同源性分别为99.36%、98.39%、92.26%;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析表明,BoFBX117基因在结球甘蓝莲座叶中最高,其次是根,幼叶中表达量最低,表现出组织特异性;在低温胁迫处理下,该基因表达量总体呈现上升趋势,说明该基因的表达受低温胁迫诱导。推测BoFBX117基因可能在结球甘蓝叶片发育及低温胁迫中发挥重要的生物学功能。本研究为深入解析F-box基因调控植物生长发育及非生物逆境胁迫的分子机制提供了依据。     

鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达研究

根据Genbank上发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了由2个外显子和1个内含子组成的鹅脂联素基因。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3 Da、5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏、肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾、肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢、间脑中低度表达。本试验结果为进一步研究脂联素的功能及作用机制奠定了基础。     

中国水仙凝集素基因NTA的克隆、序列分析及蛋白结构预测

凝集素是一种糖专一性结合蛋白,它可以识别不同的糖类。植物凝集素是植物防御系统重要的组成部分。本研究采用RT-PCR的方法,从中国水仙花蕾中克隆了凝集素基因NTA,运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析以及对其蛋白结构进行预测。结果表明,得到的NTA基因全长698bp,包含一个完整的开放阅读框516bp。该基因编码一个含有172个氨基酸的凝集素前体蛋白,该前体蛋白的等电点和分子量分别为5.84和18615.19Da。序列比对结果表明该基因编码的蛋白与其他单子叶植物如杂种水仙、雪花莲、君子兰、石蒜花和孤挺花的凝集素蛋白的同源性较高,分别为84%、80%、77%、78%以及82%。蛋白结构预测表明,中国水仙凝集素蛋白与洋水仙凝集素蛋白在结构上非常相似。对该基因编码的蛋白进行分析及蛋白结构模拟可知,该蛋白含有三个特殊的功能结构域和alpha-D-甘露糖结合表面(QXDXNXVXY)。     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中Fsr1基因的克隆及生物信息学分析

以尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种为材料,克隆其Fsr1基因的DNA及cDNA全长,并对其进行生物信息学分析。根据镰刀菌中相关基因设计简并引物,结合PCR与RT-PCR技术扩增目的片段,进行氨基酸序列推导后分析。得到结果 FoFsr1基因开放阅读框为2 474 bp,共编码824个氨基酸;FoFsr1基因编码蛋白可能是存在于细胞核中的跨膜亲水蛋白,含有54个蛋白磷酸化位点,不含有信号肽;该蛋白主要含有1个Striatin结构域及7个WD40结构域,二级结构主要由β折叠和无规则卷曲组成,其中不含有亮氨酸拉链结构;同源性分析发现其与丛赤壳菌属中的Fsr1蛋白亲缘关系最近。通过结构分析发现,推测该蛋白可能在细胞周期及细胞凋亡过程中起信号转导与转录调控的作用,从而对病原菌的致病力产生影响。     

嗜水气单胞菌aer毒素基因的克隆及核苷酸序列分析

以自行分离的嗜水单胞菌分离株AHCS02为研究对象,分析其产生的aer毒素基因结构.根据GenBank中aer毒素的基因序列（M16495）,设计扩增编码aer毒素成熟蛋白基因的引物,以AHCS02的基因组DNA为模板,PCR扩增出长度为1 332 bp的核苷酸片段,进行pMD18-T载体克隆.酶切鉴定后进行序列测定和分析,结果表明扩增的片段与M16495的同源性达92%,将测得的序列登录GenBank数据库,所得的序列编号为AY136943.分析推导其核苷酸编码的氨基酸序列显示：其编码443个氨基酸,为aer毒素成熟蛋白的基因,与M16495相比,氨基酸差异主要集中在422氨基酸残基至436氨基酸残基的位置上,在这个位置上共有8个氨基酸残基发生变化,其中在435和437氨基酸残基之间有一个氨基酸密码子丢失,氨基酸的同源性达95.5%.证明aer毒素基因的5＇端保守,3＇端变异较大.     

产过敏素的耐氨固氮工程菌的构建

阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae)E26(pMC73A）是带有耐氨质粒的固氮工程菌。本研究通过三亲杂交的方法将带有梨火疫病菌hrp基因簇的重组粘粒pCPP430导入E26(pMC73A)。接合子在番茄叶片上出现也对照DH5（pCPP430）一样典型的过敏反应症状，而出发菌E26(pMC73A)测 没有过敏反应；从接合子抽提到2条质粒DNA带，一条与pCPP430位置相同，大小约50kb，另一条与pMC73A位置相同，大小约7kb；接合子质粒DNA的酶切图谱正好是pCPP430和pMC73A酶切图谱的叠加；用地高辛标亡的hrpN DNA上进行Southerm hybridization分析，在接合子的质粒酶切产物中得到预期的杂交带，而出发菌E26（pMC73A）无任何杂交信号。通过质粒抽提、酶切验证、Southern hybridization分析以及在番茄叶片上的过敏反应测定、均表明生产植物抗性诱导蛋白的耐氨固氮工程菌构建成功。     

水稻白叶枯病菌GX1329基因组文库的构建及含编码TAL效应物基因的克隆的分离

由革兰氏阴性细菌水稻白叶枯病菌引起的水稻白叶枯病是亚洲、北美以及非洲部分地区最严重的水稻病害之一,水稻白叶枯病可使水稻减产高达50％以上。研究表明水稻白叶枯病菌的毒力主要依靠三型分泌系统所分泌的效应物。为了解水稻白叶枯病菌广西菌株GX1329中含有avrBs3／pthA家族基因的情况,本研究应用Alu I部分酶切其基因组DNA,构建了含有736个克隆的菌株GX1329的基因组文库。BamHI酶切分析随机挑取的15个文库克隆表明,克隆的外源DNA随机性良好,克隆的最小片段为27．7kb,最大为58．5kb,平均大小为39．9kb,文库克隆容量约为2．8×10^3Mb,该文库中包含基因组中任一个基因的概率为99．4％。利用来自水稻白叶枯病菌菲律宾菌株PX086的无毒基因avrXa10的第252位～第486位核苷酸序列作为探针,通过菌落原位杂交从GX1329基因组文库中筛选到37个含avrBs3／pthA家族基因的克隆。再通过Southern杂交分析,得到了17个独立克隆。这17个克隆中至少含有13个不同的avrBs3／pthA家族基因。这些基因在GX1329基因组中有的单独存在,有的两个或两个以上串联存在。本工作基本上明确了菌株GX1329基因组中avrBs3／pthA家族基因的数量,为进一步研究菌株GX1329中avrBs3／pthA家族基因的功能奠定了基础。     

猪圆环病毒2型河南分离株进化分析及ORF2基因的表达

根据GenBank中猪2型圆环病毒的核苷酸序列,设计两对引物,对来源于河南省不同地市的4株PCV2细胞培养物进行鉴定,并扩增出ORF2基因,克隆到pMD18－T载体上,获得重组质粒pMD18-T-ORF2,并对其进行测序,结果表明所克隆的ORF2基因与其它PCV2 ORF2基因核苷酸同源性在92.4%～99.6%之间,氨基酸同源性在90.6％～97.9％之间。同时采用PCR从重组质粒pMD18-T-ORF2中扩增出587bp的ORF2基因,克隆到表达载体pET-32a,成功构建了重组质粒pET-32a-ORF2,经诱导表达了ORF2基因编码的结构蛋白,表达的重组蛋白为融合蛋白,分子量为40kD,经Western-Blot检测,重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。     

阴沟肠杆菌UW4菌株ACC脱氨酶基因的克隆、序列分析及原核表达

从阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)UW4菌株提取细菌总DNA,根据已报道的阴沟肠杆菌ACC脱氨酶(1-aminocy-clopropane-1-carboxylicaciddeaminase)基因序列设计简并引物,通过PCR扩增获得1条约1.02kb特异片段,把该片段连接到pGEM-Tvector上进行测序。序列分析结果表明,该基因编码区全长为1017bp,共编码338个氨基酸残基,与报道的序列相比仅存在8个核苷酸的差异,同源性达99.1%;将其翻译成氨基酸序列后发现,仅引起了4个氨基酸残基的变化,氨基酸同源性为98.2%。利用DNASIS软件对蛋白质二级结构进行分析比较,发现其蛋白质二级结构及其单元与报道的序列完全一致。将其插入原核表达载体pET-28b进行诱导表达,发现其表达蛋白在分子量约39kD处比对照多出一明显条带;经Westernblot分析检测,发现此带即为His-ACDS融合蛋白。     

西农萨能羊骨桥蛋白基因OPN的筛选、克隆和生物信息学分析

摘　要: 采用抑制性削减杂交技术构建西农萨能羊乳腺组织在泌乳初期和泌乳高峰期的差异表达基因文库, 筛选泌乳初期和高峰期乳腺组织差异表达基因,通过RT-PCR方法克隆西农萨能羊乳腺组织OPN的CDs区序列,用实时定量PCR分析OPN基因的表达水平变化,并进行序列比对和功能预测。结果成功构建了西农萨能羊不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因文库,克隆了乳腺组织OPN基因, GenBank登录号为: EU295699, 开放读码框由834个碱基组成,编码277个氨基酸,前16个氨基酸为推定的信号肽区域。西农萨能羊OPN与绵羊(AF_152416)、牛(NM_174187)、人(DQ_846871)、小鼠(NM_009263) 相应基因核苷酸同源性分别为98%、95%、71%和70%,氨基酸同源性分别为：98%、91%、55%和54%,泌乳初期乳腺组织中mRNA表达水平是泌乳高峰期的5.03倍;预测西农萨能羊OPN较人和小鼠OPN多2个潜在功能基序。     

弹性蛋白酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

本研究以一株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的弹性蛋白基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%。将弹性蛋白酶基因连入到表达载体pPIC3.5K中,经过酶切和测序鉴定证实弹性蛋白酶基因已插入到载体启动子下游,成功构建了质粒pPIC3.5K/PAE。将pPIC3.5K/PAE线性化,通过电转化将目的基因转入毕赤酵母KM71中,利用MD培养基筛选到近400个转化子,再经G418抗性的筛选,获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子并用PCR和弹性蛋白平板验证。经过甲醇诱导表达得到高表达的重组酵母菌株,酶活为1060U/mL是出发菌株的26倍。本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础。     

西农萨能奶山羊gBTN1A1基因的筛选、克隆及序列分析

利用抑制消减杂交技术研究同一只西农萨能奶山羊泌乳中期和末期的乳腺组织差异表达基因,以泌乳中期乳腺cD-NA为测试组,末期乳腺cDNA为驱动组,构建消减文库,得到山羊(Capra hircus)嗜乳脂蛋白基因的部分序列。根据牛(Bos)和绵羊(Ovisaries L.)基因组序列进行电子拼接,并设计引物,得到山羊嗜乳脂蛋白基因的CDs区全序列,应用RT-PCR技术从山羊乳腺组织总RNA中扩增克隆了山羊嗜乳脂蛋白基因CDs区,命名为gBTN1A1,并登录GenBank(EF102891)。gBTN1A1基因开放读码框由1581个碱基组成,编码526个氨基酸,前26个氨基酸为推定的信号肽区域。gBTN1A1基因核苷酸序列与牛(NM-174508)、人(NM-001732)和鼠(AK145168)的同源性分别为97%、88%和84%,氨基酸序列的同源性分别为96%、84%和70%。其二级结构、跨膜区域及信号肽分析均与牛、人和鼠的BTN1A1基因相似。     

我国南方甘蔗病毒种类初步鉴定

依据G enB ank中已报道的甘蔗主要病毒基因组序列设计PCR引物,以采自我国广东、广西、云南、海南等地的甘蔗叶组织总RNA或总DNA抽提物为模板,采用一步法RT-PCR及PCR扩增,对预期扩增产物克隆、测序,根据序列同一性判断测定样品是否含有预期病毒,结果表明,我国南方甘蔗已受到甘蔗花叶病毒(Sugarcane m osa ic v irus,SCM V)、高粱花叶病毒(Sorghum m osa ic v irus,S rM V)、甘蔗黄叶病毒(Sugarcane ye llow leaf v irus,SCYLV)及甘蔗杆状病毒(Sugarcane B ac illiform V irus,SCBV)的侵染,未发现甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak m osa ic v irus,SCSM V)及甘蔗线条病毒(Sugarcane streak v irus,SSV)。