不同接种浓度对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种胞外多糖突变体致病性的影响

利用转座子 Tn5gus A5诱变和标记置换方法 ,构建了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种( Xanthomonas campestris pv.campestris)系列标记置换突变体 ,其中 6个突变体的胞外多糖产量显著降低。致病试验结果表明 ,胞外多糖产量对 Xcc的致病性有明显的影响 ,不同接种浓度对 Xcc胞外多糖突变体致病性亦有明显影响。     

互补野油菜黄单胞菌野油菜致病型T113突变体胞外多糖产生的DNA片段的克隆

以从野油菜黄单胞菌野油菜致病型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）胞外多糖突变体Ｔ１１３中克隆的含转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５及其两侧相邻序列的１２．３ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段为探针,从野生型菌株８００４中克隆到与突变位点相对应的６．５ｋｂＥｃｏＲＩ片段,克隆于载体ｐＬＡＦＲ３上的该片段能反式互补突变株Ｔ１１３的胞外多糖产生,说明该片段上含有至少一个与胞外多糖产生有关的基因。     

野油菜黄单胞菌XC3813报告质粒的构建及其表达的初步分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（简称Xcc）是引起十字花科作物发生黑腐病的病原菌,在以前的研究中,证实了Xcc8004菌株基因组中一个包含三个基因XC3813-3815的新位点与致病性和胞外多糖（EPS,又称黄原胶）合成有关。将XC3813的启动子与报告基因gusA融合,构建XC3813的报告质粒pRE3813gus。通过分析报告质粒在致病相关基因rpfC、opsX和clp的突变体背景下的表达,发现rpfC和opsX的失活可使报告基因的表达分别降低42．8％和55．7％。这表明XC3813的表达可能直接或间接受rpfC和opsX基因的影响。     

野油菜黄单胞菌XC3813-3815基因启动子的定位分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（简称Xcc）是十字花科作物黑腐病的病原菌,同时也是发酵工业生产黄原胶的菌种。在以前的工作中,证实了Xcc8004菌株基因组中一个包含XC3813-3815三个基因的新位点与致病性和胞外多糖（EPS,又称黄原胶）合成有关。本工作通过PCR合成包含相应ORF及其上游不同长度的DNA片段,并克隆于不带启动子的质粒载体pLAFR6后,将所获的重组质粒互补相应的突变体。通过这一功能互补的方法,确定了这三个基因在其ORF上游约50bp内分别拥有自身的启动子。     

野油菜黄单胞菌XC1892基因与致病力关系的分析

野油菜黄单胞菌野油菜变种(简称Xcc)是十字花科作物黑腐病的病原菌。在前期工作中,从Xcc8004菌株获得1株编号为XC1892的基因的转座子Tn5gusA5突变体,其致病力降低。根据基因组注释,XC1892编码1个DsbE蛋白,参与细胞色素的合成。为评估XC1892的功能,采用自杀质粒pK18mob对XC1892进行诱变,获得非极性突变体1892nk。对突变体的表型分析发现,其致病力及胞外多糖产量分别是野生型的59%和55%。用一段包含XC1892基因的DNA片段对突变体1982nk进行功能互补,其致病力和胞外多糖产量基本得到恢复。这表明XC1892基因与Xcc的致病力和胞外多糖合成产量有关。     

互补野油菜黄单胞菌野油菜致病型T113突变体胞外多糖产生的DNA …

以从野油菜黄单包菌野油菜致病型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｓｔｒｉｓ）胞外多糖突变体Ｔ１１３中克隆的含转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５及共两侧相邻序列的１２．３ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段为探针,从野生型菌株８００４中克隆以与突变位点的相对应的６．５ｋｂＥｃｏＲＩ片段,克隆于载体ｐＬＡＦＲ３上的该片段能反式互补突变株Ｔ１１３的胞外多糖产生,说明该片段上有含有至少一个与胞外多糖产生的     

胞外多糖对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种气孔入侵能力的影响

利用 Tn5gus A5插入诱变和标记置换等分子遗传学方法 ,构建了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 ( Xanthomonas campestris pv.campestris) 80 0 4菌株的系列突变体。其中有 6个突变体的胞外多糖产量显著降低。将它们喷雾接种寄主植物萝卜时 ,有 2个突变体仍具有一定的致病性 ,4个突变体无致病性。结合扫描电镜观察 ,我们认为胞外多糖产量影响着该病菌气孔入侵能力     

野油菜黄单胞菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的初步分析

野油菜黄单胞菌野油菜变种是发酵工业生产黄原胶的菌种,对该菌8004菌株全基因组序列进行分析,发现基因组中有两个编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因,编号分别为XC1977和XC4082,同源性分析显示这两个基因演绎的氨基酸序列只有36.3%的相似性。为了解这两个基因的功能,采用自杀质粒pK18 mob对XC1977和XC4082分别进行诱变,构建这两个基因的非极性突变体,对突变体表型初步分析,发现XC1977和XC4082分别突变后不影响细胞的生长繁殖,但对胞外多糖产量的影响则不相同,XC1977突变使胞外多糖产量降低56.3%,而XC4082突变基本不影响胞外多糖产量,表明8004菌株的两个zwf基因在细胞中的功能不同,XC1977与细胞的胞外多糖合成产量有关。     

野油菜黄单胞菌hpa2基因的突变和功能分析

利用自杀质粒pK18mob诱变野油菜黄单胞菌Xcc8004的hpa2基因,获得整合突变体PK3001。致病性和过敏反应检测发现,hpa2突变体PK3001过敏反应完全丧失,但致病性无明显变化。利用gus报告基因和RT-PCR检测hpa2基因的表达调控,结果表明,hpa2基因在基本培养基上高表达,且受hrpG、hrpX正向调控。     

野油菜黄单胞菌6-磷酸果糖激酶基因的初步分析

6-磷酸果糖激酶是糖酵解途径中的关键酶,它催化糖酵解途径中第一个不可逆反应。本研究利用pK18mobsacB自杀质粒采用同源双交换的方法对野油菜黄单胞菌Xcc8004中的6-磷酸果糖激酶基因（XC_0872）进行缺失突变,获得无标记的缺失突变体DM0872。表型检测结果显示DM0872突变体不影响野油菜黄单胞菌对葡萄糖和果糖的利用,不影响胞外多糖的合成,也不影响其致病性。该结果显示糖酵解途径在野油菜黄单胞菌的地位并不重要。另外,我们利用RT-PCR方法检测了XC_0872的转录情况,结果显示XC_0872在Xcc8004中是转录的。而之前曾有报道称黄单胞菌中无法检测出6-磷酸果糖激酶活性,这表明XC_0872进行了转录后调控从而使6-磷酸果糖激酶活性受到限制。本研究为野油菜黄单胞菌中糖酵解途径的调控提供了理论依据,对揭示野油菜黄单胞菌中该途径的调控机制具有一定的意义。     

转座子报告基因Tn5gusA5诱变甘蓝黑腐病菌分离与致病相关的突变体

构建携带报告基因的转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５于广谱性ｃｏｓ质粒ｐＬＡＦＲ１上，利用Ｔｎ５ｇｕｓＡ５诱变野生型甘蓝黑腐病黄单胞菌，筛选与致病性有关的因子（胞外多糖，胞外酶）突变体，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和报告基因ｇｕｓ表达验证，突变体是由转座子诱变所致。     

十字花科黑腐病菌中一个与黄色素合成相关基因的鉴定

十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）能够产生大量的胞外多糖。胞外多糖商品名又称为黄原胶,具有广泛用途,在食品生产中可作为添加剂使用。为了得到不含黄色素的黄原胶,我们采用转座子EZ-Tn5随机插入诱变的方法对8004菌株进行突变,获得了一株不产黄色素的突变体。通过对突变体的转座子EZ-Tn5插入位点进行分析,发现该突变体是由于编号为XC_4097的基因被插入突变后衍生而来。同源性分析表明XC_4097编码一种脂质酰基转移酶,它与脂质的合成有关。采用同源双交换方法构建XC_4097基因的缺失突变体。通过对野生菌、突变体以及功能回补体的表型分析进一步证实了XC_4097基因功能的丧失只影响黑腐病菌黄色素的合成,而不影响细菌生长以及胞外多糖的合成。这为工业上生产无黄色素的黄原胶提供了应用基础。     

野油菜黄单胞菌2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因的突变分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种是发酵工业生产黄原胶的菌种,通过对Xcc8004菌株全基因组序列进行搜索,发现该菌株拥有完整的ED、EMP、HMP等糖代谢途径。为评估ED途径对细胞功能的影响,选择基因组中编码ED途径的关键酶——2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的基因eda进行诱变,构建非极性突变体。通过对突变体表型进行分析,发现eda基因的突变体在培养基中能够正常生长繁殖,但其胞外多糖产量则降低77．6％。用一段包含eda基因的DNA片段对突变体进行功能互补,能基本恢复胞外多糖产量。这表明eda基因对细胞合成胞外多糖有重要影响,也暗示ED途径对细胞生长是非必要的,而对细胞大量合成胞外多糖是必须的。     

十字花科黑腐病菌RNA提取与质量鉴定

十字花科黑腐病菌,学名野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）,是一类γ-变形菌纲的革兰氏阴性细菌,能在世界范围内侵染十字花科植物,给农业生产造成重大损失。RNA是分子生物学的主要研究对象之一,提取高质量的RNA是研究十字花科黑腐病菌基因表达调控机理的基础。由于Xcc能产生大量胞外多糖及黄单胞色素,且细菌RNA半衰期较短,目前尚缺少一种大量提取Xcc高质量RNA的有效方法。该研究在参考多种RNA提取方法的基础上,建立了一种简单、有效的适合十字花科黑腐病菌RNA的提取方法。得到的RNA样品经过紫外分光光度法和甲醛变性凝胶电泳检测,证实为完整、均一的总RNA,达到了表达谱分析及cDNA文库构建的要求。     

一个可用于鉴定野油菜黄单胞菌正向调控hrpX基因的报告质粒的构建

过敏性反应与致病性基因(hrp)所编码的Ⅲ型分泌系统(T3SS)是植物病原细菌的决定性致病因子。在黄单胞菌属中,HrpG是目前已知的hrp基因表达的最高层面的调节蛋白,至今尚未鉴定到野油菜黄单胞菌调控hrpG表达的基因。本研究利用hrpX启动子和蔗糖敏感型sacB基因构建了hrpX表达报告质粒。实验结果表明该报告质粒可用于筛选鉴定正向调控野油菜黄单胞菌hrpX表达的基因。该报告质粒的构建,为研究hrp基因表达调控机制,揭示植物病原细菌的致病机制提供了有效的材料。