Cry1Ac毒蛋白对亚洲玉米螟生长发育和种群增长的影响

以含不同浓度的Cry1Ac毒蛋白的人工饲料(不加毒蛋白为对照)饲喂亚洲玉米螟幼虫,采用实验种群生命表的方法,测定了Cry1Ac毒蛋白对亚洲玉米螟的控害作用。结果显示,含2 000.0ng/g Cry1Ac毒蛋白的人工饲料处理该虫第5天的幼虫存活率为0;200.0、20.0 ng/g CrylAc毒蛋白处理第10、15天的幼虫存活率、化蛹率、成蛾率、净增长率和种群增长指数均显著低于对照,且高浓度处理显著低于低浓度处理;200.0 ng/g CrylAc毒蛋白处理的世代平均周期和种群加倍时间显著长于其它处理;而200.0 ng/g CrylAc毒蛋白处理的周限增长率显著小于2.0、0.2 ng/g处理。表明微量的Cry1Ac毒蛋白对亚洲玉米螟的种群增长有显著影响,且随着浓度的增加控制作用增强。     

亚洲玉米螟中肠类钙黏蛋白Cry1A毒素结合区对Cry1Ac毒素杀虫活性的影响

通过原核表达及亲和层析获得亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis中肠类钙黏蛋白Cry1A毒素结合区MPR及其在Cry1Ac抗性玉米螟中的突变体MPR-r2多肽片段。采用饲料混合法测定了MPR和MPR-r2及其分别与Cry1Ac毒素混合对亚洲玉米螟幼虫的杀虫效果。结果表明,MPR和MPR-r2多肽片段对亚洲玉米螟幼虫都有一定的杀虫作用;当MPR多肽片段与Cry1Ac毒素混合时,杀虫活性具有加性效应,而MPR-r2多肽片段与Cry1Ac毒素混合的杀虫效果则没有显著提高。     

Cry1Ac抗性亚洲玉米螟对四种Bt蛋白的交互抗性

种Bt蛋白Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1Ah和Cry1Ie对敏感品系ACB-BtS和抗性品系ACB-AcR的毒力,结果显示,ACB-AcR对Cry1Ah的相对抗性倍数达14.9倍,有显著的交互抗性;对Cry1Ab的相对抗性倍数为4.3倍,交互抗性水平较低;对Cry1Ie的相对抗性倍数为0.9,即无交互抗性.4种蛋白对抗、感品系的EC50表明,ACB-AcR品系对Cry1Ac蛋白产生了显著的抗性,相对抗性达到32.6倍,对Cry1Ah和Cry1Ab有低水平的交互抗性,而对Cry1Ie没有交互抗性.     

亚洲玉米螟对Cry1Ab蛋白抗性的遗传规律与分子机理

意义与目的亚洲玉米螟[Ostrinia furnaca-lis(Guene)]是长期为害玉米、高粱、谷子、棉花等作物的重要害虫。转BtCry1Ab基因抗虫玉米、棉花等在整个生育期其植株能表达Cry1Ab杀虫蛋白,为玉米螟的防治开辟了新的途径。室内汰选条件下亚洲玉米螟能对Cry1Ab杀虫蛋白产生抗性,这将严重威胁到转基因玉米、棉花等的可持续利用。研究亚洲玉米螟对Cry1Ab蛋白抗性的遗传规律与分子机理,对田间抗性监测、延缓抗性产生及抗性治理具有重要的理论和实际意义。材料与方法采自陕西省田间的亚洲玉米螟自然种群,在室内用无琼脂半人工饲料中加入一定量的…     

Cry1Ba3、Cry1Ia8蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾的杀虫活性研究

利用2种苏云金芽胞杆菌原毒素Cry1Ba3、Cry1Ia8及其组合,分别对Cry1Ac抗性种群小菜蛾幼虫进行生物活性测定。结果表明Cry1Ba3、Cry1Ia8对2种目标试虫均有高毒力,LC50分别为0.2175、0.6706μg/mL;Cry1Ba3毒力3倍于Cry1Ia8。2种蛋白混配的结果也表现出高毒力,LC50为0.4375μg/mL,没有显著的协同增效作用,也不存在拮抗。敏感与抗性小菜蛾种群生测结果统计分析比较,结果表明这2种蛋白及其组合与Cry1Ac并无交互抗性。     

Cry类和Vip3Aa类Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力和增效作用

筛选对靶标害虫高效的Bt杀虫蛋白、评价蛋白组合对靶标害虫的杀虫作用,对于转基因抗虫新品种的研发具有重要的指导意义。本文采用人工饲料混合法评价了Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ca、Cry1Ba、Cry2Aa、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19共8种Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力;同时评估了Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合蛋白对亚洲玉米螟的杀虫作用,筛选出毒力最佳的组合比例。结果表明：Cry1Ab、Cry1Fa、Cry2Aa对亚洲玉米螟的LC₅₀在0.24～0.72μg/g之间,其中Cry1Ab的毒力最强,显著高于Cry1Fa和Cry2Aa蛋白,Cry1Fa与Cry2Aa毒力无显著性差异。Cry1Ca、Cry1Ba、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19对亚洲玉米螟的LC₅₀均大于50μg/g。当Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合比例为1∶1时,增效作用最强,增效因子分别为3.18和1.58。本研究结果为多价转基因玉米的研发提供了重要依据。     

亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白的交互抗性分析

Cry9Ee是近年来发现的对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)等害虫具有高毒力的蛋白,具有良好的应用前景。为了明确亚洲玉米螟对Cry9Ee和Cry1Ab蛋白是否存在交互抗性,本文首先分别表达、活化、纯化了Cry9Ee和Cry1Ab蛋白,进而对敏感和Cry1Ab抗性亚洲玉米螟进行生物活性测定;随后对2种蛋白在敏感亚洲玉米螟中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,简称BBMVs)上的结合进行分析比较。生物活性测定结果表明,Cry9Ee和Cry1Ab蛋白的活性片段对敏感亚洲玉米螟的LC₅₀分别为3.04和0.89 μg/g;而Cry9Ee活性片段在5.00 μg/g的浓度下,对Cry1Ab蛋白抗性亚洲玉米螟致死率高达96%,与对敏感种群活性相当。竞争结合试验表明,Cry9Ee和Cry1Ab两种蛋白间不存在竞争结合,推测它们在亚洲玉米螟中肠上存在不同的受体。综合生物活性测定及体外结合试验两方面结果得出结论：亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白不存在交互抗性。cry9Ee基因可以作为理想的候选基因,用于我国新一代转基因抗虫玉米的研制,为延缓和克服亚洲玉米螟对转基因抗虫玉米抗性的产生提供重要保证。     

2015—2021年亚洲玉米螟对Cry1Ie杀虫蛋白的敏感性监测

为明确亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis田间种群对Cry1Ie杀虫蛋白的敏感性,于2015—2021年连续7年从黄淮海夏玉米区和北方春玉米区7省14地采集亚洲玉米螟田间种群,采用人工饲料混合法评价其对Cry1Ie杀虫蛋白的敏感性。结果表明,Cry1Ie杀虫蛋白对54个亚洲玉米螟田间种群的抑制中浓度LC₅₀介于0.65~6.28 μg/g之间,其中对2016年齐齐哈尔种群的LC₅₀最低,对2017年肇东种群的LC₅₀最高;LC₉₅介于4.99~70.29 μg/g之间,其中对2015年合肥种群的LC₉₅最低,对2017年松原种群的LC₅₀最高。在LC₅₀水平上,相较于室内对照种群,最敏感种群和最不敏感种群分别为2018年铁岭种群和2017年肇东种群,抗性倍数分别为0.26和1.17。虽然各地理种群对Cry1Ie杀虫蛋白的敏感性存在差异,但均处于敏感水平,且是自然选择的结果,表明Cry1Ie杀虫蛋白可用于亚洲玉米螟田间种群的防治。     

Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的最小活性区研究

为了确定Cry9Aa3蛋白对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)的最小活性区,根据NCBI BLAST比对结果与SWISS-MODEL同源建模结果,设计了12对截短引物,以cry9Aa3全长序列为模板,扩增出了12种不同截短片段,与pEB载体重组后的阳性克隆,转入大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Rosetta(DE3)诱导表达,提取蛋白。对小菜蛾和亚洲玉米螟的生物学活性测定,发现截短蛋白Cry9Aa3-45~700、Cry9Aa3-1~654,对小菜蛾和亚洲玉米螟有较高的活性,其中截短蛋白Cry9Aa3-45~700对小菜蛾和亚洲玉米螟的LC50分别为5.27、7.56μg/g,截短蛋白Cry9Aa3-1~654对小菜蛾和亚洲玉米螟的LC50分别为7.76、7.79μg/g,与阳性对照无显著差异,而截短蛋白Cry9Aa3-1~653和Cry9Aa3-46~700(LC50200μg/g)对幼虫几乎丧失生物学活性。这说明Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的杀虫活性区相同,最小活性区位于45I和654P之间。     

苏云金芽胞杆菌Cry1Ba3 蛋白定点突变对杀小菜蛾活性的影响

Cry1Ba3是由本实验室发掘的对小菜蛾有高毒力的杀虫晶体蛋白。为了寻找对杀虫活性有重要影响的氨基酸,为杀虫机理研究和改造杀虫蛋白提供理论依据,本研究利用Ple Bio Informatique Lyonnais数据库对Cry1Ba3的二级结构进行模拟;采用BioEdit软件分析Cry1Ba3的疏水区;将Cry1Ba3与Cry1Aa1、Cry2Aa1、Cry3Aa1以及Cry4Ba1进行多序列比对,从而确定了20个氨基酸突变位点。利用半重叠引物PCR的方法对Cry1Ba3进行定点突变,将突变体在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。通过浸叶法对各个突变蛋白杀小菜蛾的生物活性进行测定。获得的20个Cry1Ba3突变体均能在大肠杆菌BL21中表达,并以包涵体形式存在。杀虫活性测定结果表明M6(R192L)、M10(W303A)、M19(H485G)对小菜蛾的活性明显降低,二级结构预测表明活性降低的突变蛋白的构象均发生明显变化,其余17种突变蛋白的活性和二级结构都没有明显变化。说明第192位的精氨酸、第303位的色氨酸和第485位的组氨酸对Cry1Ba3的杀小菜蛾活性有重要影响,上述3个位点氨基酸突变引起的蛋白活性减低可能与毒素的空间结构变化有关。     

亚洲玉米螟和黏虫幼虫取食Cry1F蛋白后的中肠组织病理变化

为了明确Cry1F杀虫蛋白对亚洲玉米螟和黏虫两种重要玉米害虫的作用机制,本文通过透射电镜观察了亚洲玉米螟和黏虫4龄幼虫取食含Cry1F蛋白人工饲料后的中肠组织病理变化,并与其取食含Cry1Ab蛋白人工饲料后的组织病理变化进行了比较。亚洲玉米螟和黏虫4龄幼虫取食Cry1F蛋白48 h后中肠杯状细胞发生了明显的病变,主要表现为：细胞微绒毛肿胀、脱落;细胞核变形,质膜和核膜界限不清晰;染色质发生固缩、贴近核膜;线粒体拉伸变形数量减少,严重的发生空泡化;内质网肿胀与断裂、数量减少,与取食含Cry1Ab蛋白人工饲料相比,玉米螟和黏虫中肠组织发生的病变程度相似。本研究可为Cry1F作为转基因玉米重要的杀虫蛋白在未来亚洲玉米螟和黏虫防治中更好地发挥作用提供理论依据。     

蛋白质转导结构域增加Cry1Ac对小菜蛾的毒力研究

蛋白质转导结构域是一类能自动穿透细胞膜,并能作为载体将其他生物大分子携带进入细胞膜内的一段富含精氨酸的多肽。本研究通过遗传重组的方法,构建蛋白质转导结构域TAT与Bt杀虫蛋白Cry1Ac的融合基因及其表达载体TAT-Cry1Ac,对表达蛋白的生测结果表明,TAT极为显著地增加Cry1Ac对小菜蛾的杀虫毒力,增效倍数达到5.54倍,预示着TAT在微生物杀虫蛋白领域可能有着良好的应用前景。     

Cry1Ac的绿色荧光蛋白GFP标记及其在棉铃虫幼虫中肠的定位分布

为了明确Cry1Ac蛋白在棉铃虫体内与中肠组织的相互作用,采用重叠PCR方法将Bt-cry1Ac基因和绿色荧光蛋白GFP基因融合,构建含Cry1Ac毒蛋白和绿色荧光蛋白GFP原核表达载体,并在大肠杆菌大量表达。利用荧光显微镜观察发现,表达Cry1Ac-GFP融合蛋白的大肠杆菌在蓝光激发下发出绿色荧光。将含有融合蛋白的菌液拌入人工饲料饲喂3龄棉铃虫幼虫96h,取棉铃虫幼虫中肠做冰冻切片并在荧光显微镜下观察。结果显示,取食含有Cry1Ac-GFP融合蛋白饲料的棉铃虫幼虫中肠能够发出强烈荧光。比较Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性棉铃虫幼虫中肠的发光部位,敏感棉铃虫幼虫的中肠围食膜已经消失,肠壁细胞发出强烈的荧光,而抗性棉铃虫的围食膜较健全并发出荧光。     

马铃薯羧肽酶抑制剂与Cry1Ac毒素混用对棉铃虫中肠蛋白酶活性及杀虫活性的影响

为研发转多价抗虫棉,利用蛋白酶专性底物测定马铃薯羧肽酶抑制剂（potato carboxypeptidases inhibitor,PCI）和Cry1Ac毒素单用及混用后棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫中肠内总蛋白酶、类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和羧肽酶的活性、羧肽酶A（carboxypeptidase A,CPA）和羧肽酶B（carboxypeptidase B,CPB）基因的相对表达量及对棉铃虫的杀虫活性。结果表明,饲喂20 μg/cm² PCI+1 μg/cm² Cry1Ac、40 μg/cm² PCI+5 μg/cm² Cry1Ac含药饲料后,棉铃虫3龄幼虫中肠内CPA活性分别为0.20 U/mg和0.16 U/mg,显著低于对照;总蛋白酶活性均为0.15 OD·min^-1·mg^-1,与对照差异不显著;类胰蛋白酶活性均为0.45 μmol·min^-1·mg^-1,均显著低于其他处理,CPB基因表达量较对照显著下调。饲喂20 μg/cm² PCI、40 μg/cm² PCI、1 μg/cm² Cry1Ac、5 μg/cm² Cry1Ac、20 μg/cm² PCI+1 μg/cm² Cry1Ac、40 μg/cm² PCI+5 μg/cm² Cry1Ac含药饲料后,CPB活性分别为0.26、0.26、0.24、0.26、0.27和0.26 U/mg,与对照差异不显著;棉铃虫3龄幼虫中肠内类胰凝乳蛋白酶活性分别为0.48、0.39、0.42、0.41、0.40和0.45 μmol·min^-1·mg^-1,6者之间差异不显著,但均显著低于对照;棉铃虫3龄幼虫中肠内CPA基因表达量均较对照显著上调。饲喂20 μg/cm² PCI+0.02 μg/cm² Cry1Ac、40 μg/cm² PCI+0.02 μg/cm² Cry1Ac、20 μg/cm² PCI+0.06 μg/cm² Cry1Ac、40 μg/cm² PCI+0.06 μg/cm² Cry1Ac含药饲料后,棉铃虫初孵幼虫实际校正死亡率分别为66.54%、68.28%、77.74%和85.76%,均高于其预期校正死亡率,表明PCI和Cry1Ac两者对杀虫活性表现为独立作用和增效作用,两者可共同用于棉铃虫幼虫的防治。     

类钙粘蛋白对Cry3A毒素杀虫活性的影响

将克隆的黄粉虫类钙粘蛋白基因片段在大肠杆菌中表达纯化,并分析其对Cry3A毒素杀虫活性的影响,从而探讨黄粉虫类钙粘蛋白对Cry3A毒素杀虫活性的增效作用。黄粉虫类钙粘蛋白基因片段在大肠杆菌中表达产物为包涵体,经尿素变性后,用亲和纯化法可得到较纯的重组蛋白;随着类钙粘蛋白片段与Cry3A质量比值的升高,Cry3A毒素对黄粉虫的杀虫活性也逐步提高,当其比值为1时,活性达到最大,提高了2.5倍,而黄粉虫类钙粘蛋白片段对Cry3Am的杀虫活性却没有显著性影响。研究表明,黄粉虫类钙粘蛋白对Cry3A毒素的杀虫活性具有增效作用。