辣椒小G蛋白CaRab11基因全长cDNA的分离及序列分析

通过分析克隆获得的辣椒Rab11全长cDNA及其编码的氨基酸序列结构特征,为进一步研究辣椒Rab11功能奠定基础.通过对辣椒均一化cDNA文库的筛选分离获得了一个与葡萄Rab11小G蛋白VvRabAlf高度同源的全长cDNA,命名为CaRab11.序列分析结果表明:该cDNA包含有1164 bp的完整开放阅读框,编码217个氨基酸.该蛋白含有Rab GTP酶超家族保守的RabSF模体;Rab亚家族蛋白所特有的五个氨基酸序列RabF模体(RabF1-RabF5);参与GTP/Mg++结合及GTP水解的G结构域(G1-G5:GDSGVGKS,T,DTAGQE,GNKADL及ETSAL);两个构象变构域(Switch Ⅰ和SwitchⅡ)及与异戊二烯化相关的CCX序列.氨基酸同源性及进化分析同样表明CaRab11为辣椒小G蛋白Rab11家族新成员.     

辣椒水通道蛋白基因CaAQP的克隆与序列分析

 【目的】分析辣椒水通道蛋白基因CaAQP的序列特征,并研究其在抗寒品种P70中经4℃低温胁迫处理后的表达模式,为探讨辣椒的耐寒机理及辣椒品种耐寒性改良积累资料。【方法】利用RACE 技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并以4℃低温胁迫处理不同时间的抗寒品种P70为材料,利用Real time-PCR分析所克隆基因在辣椒低温胁迫前后的表达模式,以25℃处理为对照。【结果】在4℃低温胁迫处理后的耐寒辣椒品种P70叶片中分离到与水通道蛋白基因相关的差异表达片段,并利用RACE技术克隆得到该基因的全长cDNA,命名为CaAQP,登录号为GU116569。序列分析表明,该基因大小为1 032 bp,含5′非编码区为69 bp,3′非编码区为210 bp,CDS长753 bp,编码250个氨基酸, 蛋白分子量为25.7 kD。应用生物信息学软件对CaAQP分析表明,CaAQP含有6个跨膜区,有2个NPA单元,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致。氨基酸序列比对发现,该序列与其它物种TIP类液泡膜水通道蛋白氨基酸序列有很高的同源性。聚类分析表明,CaAQP与番茄液泡膜水通道蛋白遗传距离最近,与禾本科的玉米和大麦遗传距离相对较远。Real time-PCR分析结果证实,该基因在低温胁迫下呈现下调表达的趋势。【结论】利用cDNA-AFLP并结合RACE技术首次在耐寒辣椒品种中克隆了水通道蛋白基因CaAQP,该基因属于MIP蛋白家族的一员,具有其典型的功能域,表达模式分析表明,该基因在低温胁迫过程中具有重要的调控作用,该研究结果为进一步探讨辣椒逆境胁迫过程中基因表达调控机制提供了重要信息。     

中国水仙水通道蛋白基因cDNA克隆、序列分析与表达

以构建的中国水仙不同花期的抑制差减杂交文库(SSH)为基础,采用RACE及RT-PCR技术,分离克隆到1个水通道蛋白基因NtPIP1.此基因包含有一个867 bp完整阅读框架(ORF),编码288个氨基酸,分子量为30.68 kD,理论等电点为8.97.用生物软件对NtPIP1蛋白分析表明:NtPIP1含有6个跨膜区,...     

番茄水通道蛋白基因SlAQP的克隆与序列分析

【目的】通过分析克隆得到的番茄水通道蛋白SlAQP基因的cDNA全长序列特征、编码蛋白的细胞定位及其在番茄材料Mirco Tom中经干旱胁迫后的表达模式,为进一步研究番茄在逆境下的抗逆机制及加快番茄抗逆育种积累资料。【方法】采用RACE 技术克隆番茄水通道蛋白基因的cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因的编码蛋白特性;利用基因枪转化法将SlAQP基因与GFP融合的瞬时表达载体（SlAQP::GFP）转入洋葱表皮细胞,对该基因进行亚细胞定位;利用Real time-PCR 分析该基因在番茄品种Mirco Tom中经干旱胁迫下的表达机制。【结果】SlAQP基因（GenBank登录号：HQ433337）cDNA全长为1 107 bp,编码区含852 bp,共编码283个氨基酸。生物信息学软件分析表明,SlAQP基因含有6 个跨膜区,2 个NPA 单元,其氨基酸残基与MIP 家族蛋白保守区序列完全一致,且该基因氨基酸序列与其它物种PIP 类质膜型水通道蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。11个物种间的聚类分析表明,SlAQP基因编码的蛋白与马铃薯质膜型水通道蛋白遗传距离最近。细胞定位结果确认SlAQP基因编码蛋白在细胞质膜上发挥生物学作用。Southern杂交结果显示,SlAQP基因在番茄基因组DNA中呈单拷贝。Real time-PCR 分析结果证实,干旱胁迫下该基因表达量总体呈下降趋势。【结论】对番茄水通道蛋白SlAQP基因在干旱胁迫后的表达模式分析,预示该基因表达受逆境条件的影响,为今后进一步探讨其在干旱胁迫中发挥的作用提供了重要信息。     

番茄水通道蛋白基因SIAQP的克隆与序列分析

[目的]通过分析克隆得到的番茄水通道蛋白SIAQP基因的cDNA全长序列特征、编码蛋白的细胞定位及其在番茄材料Mirco Tom中经干旱胁迫后的表达模式,为进一步研究番茄在逆境下的抗逆机制及加快番茄抗逆育种积累资料.[方法]采用RACE技术克隆番茄水通道蛋白基因的cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因的编码蛋白特性;利用基因枪转化法将S1AQP基因与GFP融合的瞬时表达载体(S1AQP::GFP)转入洋葱表皮细胞,对该基因进行亚细胞定位;利用Real time-PCR分析该基因在番茄品种Mirco Tom中经干旱胁迫下的表达机制.[结果]S1AQP基因(GenBank登录号:HQ433337)cDNA全长为1 107 bp,编码区含852 bp,共编码283个氨基酸.生物信息学软件分析表明,SIAQP基因含有6个跨膜区,2个NPA单元,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致,且该基因氨基酸序列与其它物种PIP类质膜型水通道蛋白氨基酸序列具有很高的同源性.11个物种间的聚类分析表明,S1AQP基因编码的蛋白与马铃薯质膜型水通道蛋白遗传距离最近.细胞定位结果确认S1AQP基因编码蛋白在细胞质膜上发挥生物学作用.Southern杂交结果显示,S1AQP基因在番茄基因组DNA中呈单拷贝.Real time-PCR分析结果证实,干旱胁迫下该基因表达量总体呈下降趋势.[结论]对番茄水通道蛋白S1AQP基因在干旱胁迫后的表达模式分析,预示该基因表达受逆境条件的影响,为今后进一步探讨其在干旱胁迫中发挥的作用提供了重要信息.     

橡胶树水通道蛋白基因HbPIP1;2和HbPIP2;2的克隆及序列分析

根据GenBank中已经公布的不同植物水通道蛋白(AQPs)的保守氨基酸序列设计简并引物,结合RT-PCR和RACE技术,从橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆了2个AQP基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果获得橡胶树2个AQPs基因的全长,分别命名为HbPIP1;2和HbPIP2;2。HbPIP1;2编码273个氨基酸,理论分子量为29.15kD,等电点为8.55;HbPIP2;2编码278个氨基酸,理论分子量为29.78kD,等电点为8.20。HbPIP1;2和HbPIP2;2均具有6个跨膜区和MIP家族信号序列SGXHXNPAVT,为疏水性蛋白;HbPIP1;2和HbPIP2;2与同科蓖麻水通道蛋白基因RcPIP1-3和RcPIP2-1的同源性分别为91%和89%,并具有相同功能域。因此,推测Hb-PIP1;2和HbPIP2;2都属于水通道蛋白基因家族的新成员。     

油茶FBPase基因的全长cDNA克隆及序列分析

FBPase是调控Clavin循环的关键酶之一,加速Clavin循环有利于提高植物的光合效率.在油茶cDNA文库和EST文库构建的基础上,以油茶“湘林1号”的近成熟种子为材料,采用5'RACE和3'RACE技术克隆油茶FBPase基因的全长cDNA序列;该基因全长cDNA序列为1 356 bp,其中开放读码框为1 02...     

香椿中3个水通道蛋白基因(TsAQP)的克隆和表达分析

水通道蛋白(Aquaporins, AQP)能够促进水分和小分子物质在膜上的运输,维持细胞水分平衡。本研究利用香椿转录组数据,克隆到3个香椿水通道蛋白基因(TsAQP),即TsPIP1-5(GenBank登录号MT501152)、TsPIP2-5(GenBank登录号MT501153)和TsTIP2-1(GenBank登录号MT501154)。利用生物信息学和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,结合生理表型分析,研究TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1蛋白性质、表达模式和在香椿芽采后贮藏中的功能。结果表明：从转录组数据中鉴定出的20个TsAQP可分为5类;TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1是通过跨膜区定位于膜的疏水性稳定蛋白,含磷酸化位点,无信号肽;TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1在根、茎和叶中均有表达且有一定的器官差异性;TsPIP1-5、TsPIP2-5和TsTIP2-1在香椿芽低温贮藏过程中表达量提高,暗示TsAQP在香椿芽采后脱水过程中有调控作用。本研究结果为进一步研究香椿中TsAQP基因的功能和作用机制奠定了基础。     

多年生黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP的克隆及功能分析

【目的】研究黑麦草在逆境胁迫下水分代谢的基因调控,克隆黑麦草质膜型水通道蛋白基因的全长cDNA序列,并对其表达模式进行研究。【方法】利用RACE技术从黑麦草（品种“顶峰”）中获得LpAQP全长cDNA序列;运用生物信息学软件分析其编码蛋白;构建LpAQP与GFP融合的瞬时表达载体,采用基因枪法转入洋葱表皮细胞,观察其细胞定位;通过real time-PCR分析LpAQP的表达模式,并用Southern杂交分析其拷贝数。【结果】克隆获得LpAQP的cDNA序列,GenBank登录号为JX569791,其开放阅读框（ORF）为867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质分子量为30.7 kD。该基因含有2个NPA单元,6个跨膜区,LpAQP含有与MIP家族完全一致的蛋白质保守区,其氨基酸序列与其它禾本科PIP类质膜型水通道蛋白同源性较高。物种间聚类分析表明LpAQP与大麦、小麦质膜型水通道蛋白同源性较高。LpAQP可能定位于细胞质膜上。通过Southern杂交分析,发现LpAQP在黑麦草基因组中以单拷贝存在。real time-PCR分析表明LpAQP在黑麦草茎部表达高于叶和根,持续干旱胁迫会导致LpAQP表达量先上调后下降。【结论】克隆获得黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP,其以单拷贝形式存在,在黑麦草根、茎、叶中均有表达,尤其是茎中表达最高。其表达受干旱胁迫影响。     

绵羊YAP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆绵羊YAP1基因cDNA并分析其序列及其蛋白的遗传特性及其在不同组织中不同程度的表达情况。【方法】以湖羊为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术获得绵羊YAP1序列,并结合生物信息学方法对绵羊YAP1的序列进行深入分析。【结果】从湖羊背最长肌中克隆YAP1基因的全长cDNA序列;利用生物信息学技术,对绵羊YAP1基因与其它物种的同源性,蛋白质序列的跨膜区,亚细胞定位,亲水性,潜在信号肽剪切位点,糖基化位点,磷酸化位点,编码产物进行功能预测分析,及其编码蛋白的二级结构,三级结构等进行分析。【结论】克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1 712 bp,包括1 212 bp的编码区序列,编码403个氨基酸。同源性分析发现,绵羊YAP1核苷酸序列与推测氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高,分别达到78.77%和92.51%,而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为水溶性蛋白,相对分子量为44079.0Da,理论等电点为4.91,无信号肽序列和跨膜区;亚细胞定位主要在细胞核,不属于分泌蛋白;预测含有33个磷酸化位点,7个糖基化位点,具有两个WW结构域,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示,YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨YAP1基因在肌肉生长过程中的功能研究奠定了遗传信息基础。     

牛ME1基因cDNA编码序列的克隆与分析

在NCBI中GenBank里查询已登录的牛的ME1 mRNA序列(GenBank Accession:XM-613987),发现其1-69 bp序列与已知的人、猪和小鼠的ME1基因mRNA序列没有任何相似性,因此,认为这段序列有误。研究利用人的ME1基因mRNA序列作为电子探针共找到44段牛的相关ESTs序列,然后利用此ESTs重叠群拼接成的序列设计了三对引物。提取牛的肝脏和肌肉总RNA,从中克隆测序得到M1为525 bp、M2为1039 bp和M3为1171bp的三段序列,拼接成长度为2015 bp的序列。此段序列与前述ESTs重叠群一致序列完全相同,并与人、猪和小鼠的ME1基因mRNA序列相似性分别达89%、85%和84%,从而证实了本序列的正确性。本序列已在NCBI登录(GenBank Accession:FJ495084)。研究为进一步研究牛的ME1基因结构提供了真实的序列信息。     

广西水牛ghrelin cDNA的克隆及序列分析

[目的]克隆广西水牛ghrelin的cDNA并对其进行序列分析。[方法]以广西沼泽型水牛的真胃底组织总RNA为模板,用特异性引物扩增ghrelin的cDNA。扩增产物经凝胶回收纯化后与pMD 18-T连接并转化大肠杆菌DH5d,转化产物经PCR和双酶切鉴定后筛选出阳性克隆,阳性克隆经5×1ml LB液体培养基培养鉴定后测序。[结果]成功获得了广西水牛ghrelin的cDNA,该片段长339bp,编码113个氨基酸。BLAST分析结果表明,该片段与黄牛前原ghrelin基因仅有6个碱基的差异,同源性为98．2％;而两者ghrelin均由27个氨基酸组成,序列同源性为1013％。[结论]为进一步研究ghrelin基因的生物学功能提了供理论基础。     

兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP） 基因克隆及其同源性比较

【目的】克隆兰州大尾羊心脏型肪酸结合蛋白（H-FABP）基因全长cDNA序列,为研究绵羊H-FABP生物学作用和生产应用提供理论依据。【方法】根据已知哺乳动物H-FABP基因 cDNA 序列,设计5''和3''特异引物,运用cDNA 末端快速扩增（RACE）技术获得兰州大尾羊H-FABP基因全长 cDNA 序列。【结果】 扩增获得兰州大尾羊5''端425 bp、3''端231 bp片段和 177 bp中间片段,拼接获得748 bp兰州大尾羊H-FABP基因全长cDNA 序列（GenBank登录号：JQ780322）。 兰州大尾羊H-FABP基因ORF长 402 bp,编码 133 个氨基酸。核苷酸序列分析显示兰州大尾羊H-FABP基因序列与大多数哺乳动物相似,但其第66位发生的碱基转换（T←→G）引起所编码的第22位天门冬氨酸（N）不同于其它所有物种的赖氨酸（K）。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与山羊亲缘关系最近。预测兰州大尾羊H-FABP蛋白质的空间结构与山羊和牛H-FABP类似,由2个α螺旋和10个反向平行的β折叠组成,10 个折叠片围成一个桶状结构,疏水性残基位于桶内,用于结合脂肪酸。【结论】克隆了兰州大尾羊H-FABP基因,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

PCR快速筛选棉纤维cDNA文库分离全长cDNA序列

建立了一种利用PCR-96孔板法快速筛选棉纤维cDNA噬菌体文库,分离全长基因序列的技术体系．首先根据已知EST片段设计一至两对特异PCR引物,通过在96孔滴定板上逐级稀释cDNA文库,利用特异引物以及特异引物与通用引物组合逐级从cDNA文库中筛选目标克隆,最终可获得目标全长cDNA。     

羊驼皮肤KAP3.2基因3′端序列的cDNA克隆及序列分析

利用大规模筛选表达序列标签(ESTs)方法,从羊驼皮肤cDNA文库中筛选出角蛋白关联蛋白(Ker-atin Associated Protein,KAP)KAP3.2基因的3′端序列,Genbank序列号为EV554632。利用生物信息学方法对此序列进行分析,结果表明,该基因片段大小为454bp,完整的ORF编码35个氨基酸;通过对其功能域分析得出,不含信号肽,在系统进化上,羊驼与人和黑猩猩的遗传距离较近。     

山药SuSy基因全长cDNA序列的结构、进化和表达

 【目的】阐明山药蔗糖合成酶（SuSy,EC 2.4.1.13）基因家族的成员及其功能。【方法】利用RT-PCR和RACE技术从大薯（Dioscorea alata ）地下块茎中分离到1个SuSy基因（DaSuSy1）全长cDNA序列,并用DANSTAR和Clastal W等软件分析该序列的结构特征和分子进化,采用RT-PCR和Northern杂交对该基因的时空表达进行分析。【结果】DaSuSy1全长cDNA序列大小为2 673 bp,其中最大开放阅读框（ORF）、5′端和3′端的非翻译区分别含有2 445 bp、7 bp和221 bp,而且3′端的非翻译区含1个24 nt的Poly（A+）尾;最大ORF可编码814个氨基酸,分子量为92.76 kD,等电点为6.42,含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及两个磷酸化位点,即N端的Ser10和C端的SNLDRRET781 RR(Ser774～Thr781)。该基因在全长cDNA序列、编码区cDNA序列及其编码氨基酸序列的水平上与GenBank中所选已知物种SuSy基因相应序列的同源性分别达45.3%～71.3%、45.8%～74.8%和50%～84.7%,与禾本科植物SuSy基因家族中一些成员亲缘关系最近。DaSuSy1在非光合器官中表达,其中地下块茎表达最为强烈,而且从块茎形成初前期开始表达一直增强至盛中期,此后逐渐减弱。【结论】DaSuSy1是山药SuSy基因家族成员,归为单子叶植物SuSy基因的组别,仅在非光合器官中表达编码负责蔗糖-淀粉转化功能的SuSy同工型。     

三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因的cDNA序列克隆与表达分析

[目的]研究三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[方法]通过RACE技术,以我国重要的淡水珍珠贝——三角帆蚌为研究客体,克隆了CaM的cDNA全长,并通过Real-Time Q-PCR技术分析了该基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[结果]三角帆蚌CaM基因cDNA全长659bp,包括70 bp的5'UTR,299 bp的3'UTR和447 bp的ORF,编码149个氨基酸,预测其分子量为16.8 kDa,等电点为4.14。cDNA序列比对信息表明三角帆蚌与池蝶蚌、合浦珠母贝间均具有57%的相似度,而其蛋白具有高度的保守性,除斑马鱼外,各生物CaM相似率达97%。定量数据表明,CaM基因广泛表达于三角帆蚌各组织,外套膜内膜与腮中表达量显著升高(P0.05),其次是外套膜外膜和内脏团组织。插核育珠能增加该基因在各组织的表达,特别是在外套膜外膜和鳃组织中,育珠蚌该基因的表达显著高于非育珠蚌(P0.05)。此外,水体Ca2+浓度的增大对CaM基因表达有显著的影响,外套膜内膜该基因的表达随Ca2+浓度升高而增加,而外套膜外膜1.25 mmol/L Ca2+浓度下该基因的表达水平显著高于0.50 mmol/L、3.00 mmol/L组(P0.05)。[结论]为进一步深入研究钙调蛋白基因的在珍珠生长过程中的功能及其调控机理奠定了分子基础。