番茄果实酸性转化酶基因cDNA片段的克隆

根据酸性转化酶基因的保守序列设计引物 ,采用RT PCR方法 ,从番茄果实总RNA中扩增出目标cDNA片段 ,克隆到pMD18 T载体中。在所测的 10 38个核苷酸中 ,与GenBank中登记号为M810 81的番茄果实酸性转化酶基因高度同源 ,同源性为 99%。该基因片段在GenBank中已登记 ,登记号为AF4 90 5 30。     

甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

根据在GenBank中登录的番茄、马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物, 采用RT-PCR方法从甜瓜花后25 d的果实总RNA中扩增出目标cDNA片段, 克隆到pMD18-T载体中。序列分析表明, 该片段与番茄蔗糖磷酸合成酶氨基酸序列同源性为98.9% , GenBank中登记号为DQ355797。通过Northern blot检测其在甜瓜果实不同发育时期的表达变化, 结果表明该基因在甜瓜果实花后25 d开始表达,随着果实的成熟, 表达量升高。     

杨梅酸性转化酶基因cDNA分离及表达分析

杨梅果实富含蔗糖,酸性转化酶是蔗糖代谢关键酶,根据植物酸性转化酶基因保守区序列设计引物,提取杨梅叶片RNA,逆转录获得cDNA,以此为模板通过PCR技术扩增到长度为516bp的基因片段,克隆入pMD18-T载体中,命名为MrIVR1(GenBank:DQ339699)。测序及同源性检索表明,该基因推导氨基酸序列与君子兰、葡萄、草莓、胡萝卜等酸性转化酶基因氨基酸序列同源性为60%～69%。运用ClustalX软件对植物转化酶基因进行了系统树分析,结果显示,MrIVR1编码的蛋白质属于细胞壁酸性转化酶。半定量RT-PCR表达分析显示,MrIVR1基因在杨梅果实发育早期表达量最高,随着果实的发育表达量下降,在成熟果实中表达水平较低。     

君子兰转化酶基因片段(CMCW1)的克隆和序列分析

 分析植物酸性转化酶基因的保守区序列，设计一对PCR引物，以君子兰基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出长约500 bp的DNA片段，克隆入pGEM-TEasy载体，测序结果表明获得君子兰酸性转化酶基因家族的一个成员CMCW1，该基因片段长518 bp，不含内含子，编码172个氨基酸。其序列已在GenBank中登记(登记号为AY151269)。在GenBank中进行同源性检索的结果表明，该成员编码的氨基酸与其它植物细胞壁酸性转化酶编码的氨基酸同源性较高。     

番茄酸性转化酶cDNA片段的克隆与表达分析

 根据番茄细胞壁束缚性和可溶性酸性转化酶基因序列分别设计引物, 以普通栽培型番茄(Lycopersicon esculentum ) ‘辽园多丽’和‘桃太郎’及野生番茄(Lycopersicon chmielewskii) 的幼苗为材料提取总RNA, 采用RT2PCR方法, 扩增出目的cDNA序列的部分片段并克隆到pMD18-T载体中。经测序后发现不同基因型番茄的酸性转化酶基因具有高度同源性, 达到99.5%。进一步检测其在‘辽园多丽’果实发育不同时期的表达变化, 结果表明主要在成熟果实的胶质胎座中大量表达, 而在果实的其它部位几乎检测不到其表达。     

柑橘酸性转化酶基因片段的克隆

分析植物液泡和细胞壁转化酶基因的保守区序列，分别设计一对PCR引物，以柑橘基因组DNA为模板，采用PCR方法分别扩增出长约740 bp和530 bp的DNA片段，分别克隆入pBS－T 和pMD18－T载体，进行测序，结果表明，获得柑橘酸性转化酶基因家族的两个成员，成员A和B基因片段分别长742 bp和524 bp。其序列已在GenBank中登记（登记号分别为AF014925和AF314197）。在GenBank中进行同源性检索，结果表明，成员A编码的氨基酸与植物液泡酸性转化酶的氨基酸同源性较高，与拟南芥的最高，达76％，而成员B编码的氨基酸与植物细胞壁酸性转化酶的氨基酸同源性较高，与豌豆的最高，达71％。两成员核苷酸和氨基酸序列同源性分别为55％ 和50％，推测酸性转化酶基因成员A 和B编码的蛋白分别定位于液泡和细胞壁。     

枸杞酸性转化酶基因的克隆及组织表达分析

以"宁杞1号"枸杞为试材,通过RT-PCR及RACE技术进行枸杞酸性转化酶基因的克隆及组织表达分析,并运用MEGA 5.0软件对植物转化酶基因进行了系统树分析。结果表明:扩增获得2 193bp的枸杞酸性转化酶基因,命名为LbSAI(GenBank:KC776575),该基因推导氨基酸序列与马铃薯、番茄、梨等酸性转化酶基因氨基酸序列同源性为68%~100%;LbSAI编码的蛋白质属于液泡酸性转化酶;Real-time PCR表达分析显示,LbSAI基因在枸杞花中表达量最高,在根中表达水平较低。     

甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因全克隆及工程载体的构建

蔗糖磷酸合成酶在甜瓜果实蔗糖合成途径中起关键性的调节作用,克隆该基因并导入甜瓜低糖自交系,可改良甜瓜果实品质创新优良种质。从甜瓜幼苗叶片提取总RNA,利用RT-PCR与Southern blot方法相结合,重组子质粒经限制性内切酶酶切和PCR验证以及测序同源性比较,克隆到基因的5’(2859bp)和3’(852bp)。应用高保真Taq聚合酶PCR拼接蔗糖磷酸合成酶完整cDNA序列3692bp,该片段与GenBank中其它植物基因序列具有97%￣99%的同源性,登录号DQ364058。应用BamHⅠ、KpnⅠ、BglⅡ限制性酶切获得植物双元表达载体pROK2及基因的线性片段,通过T4连接酶反应,构建了以CaMV35S为启动子,以Tnos为终止子的工程载体pROK-SPS,该载体含有Npt-II选择标记基因。     

甜瓜果实酸性转化酶基因反义表达载体的构建(英文)

应用RNA反义技术抑制甜瓜果实发育过程中酸性转化酶活性,促进蔗糖积累,从而为培育优质品种提供了可行的新方法。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜酸性转化酶基因用BamHⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区1038bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的BamHⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜酸性转化酶cDNA反义表达载体(Anti-MAI1)。采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。利用叶盘法转化烟草,经PCR和PCR-Southern杂交检测,证明此基因已整合入烟草的核基因组中。     

柿法呢基焦磷酸合酶基因的克隆与序列分析

在萜类生物合成途径中起重要作用的关键酶—法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl Diphos-phate Synthase,FPS),对植物的生长发育、抗逆性以及次生代谢都起着重要的调节作用。通过cDNA末端快速克隆的技术(Rapid-amplification of cDNA Ends,RACE)从柿果实中克隆到法呢基焦磷酸合酶基因cDNA片段,并进行了序列的相关分析。结果表明:所克隆的FPS基因和NCBI数据库中已登录的云杉、腊梅、百合等植物FPS基因核苷酸序列的同源性分别达到88%、75%、73%,并且与香蕉、水稻、橄榄等植物FPS基因氨基酸序列的同源性分别达到72%、67%、66%。该基因已提交GenBank数据库,登录号为JN108022。     

越瓜果实发育过程中糖的变化与相关酶活性的关系

以从各地搜集的6 个越瓜品种为试材,对越瓜果实糖含量及蔗糖代谢相关酶进行了研究。结果表明：不同越瓜品种之间糖含量差异较大,凤台越瓜、田集越瓜、刘集越瓜3 个品种可溶性固形物含量及糖含量较高;随着果实的发育蔗糖磷酸合成酶活性呈递增趋势,且在果实各个发育期田集越瓜的蔗糖磷酸合成酶活性均最高;而转化酶活性则随着果实发育呈下降趋势,凤台越瓜和田集越瓜的酸性转化酶及中性转化酶活性在各个发育期均最低;中性转化酶在毛集越瓜、潘集越瓜、青皮越瓜、刘集越瓜中相对较高,且随着果实发育活性下降,至果实成熟时活性达到最小值;除刘集越瓜外,其他品种的蔗糖代谢酶活性在果实不同发育期均没有明显变化。以上结果表明,不同越瓜品种蔗糖含量差异是由蔗糖磷酸合成酶、酸性转化酶和中性转化酶活性共同决定的,其中酸性转化酶在越瓜蔗糖积累中占主导地位。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体的构建

应用反义RNA技术抑制甜瓜成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决甜瓜延熟保鲜难题的可行新方法。根据GenBank中甜瓜、黄瓜ACC合成酶基因氨基酸保守序列设计引物,从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到约0.7kb的ACC合成酶cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为777bp,编码258个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

甜瓜反义酸性转化酶基因对甜瓜的遗传转化

利用子房注射法将甜瓜反义酸性转化酶基因导入厚皮甜瓜自交系‘0123’果实, 应用PCR和Southern Blot对后代进行分子鉴定。结果表明, 330株甜瓜转化植株中, 有2株为阳性转基因植株, 转化率约为0.6%。进一步研究发现, T0代转基因甜瓜植株生长势减弱, 果实比对照小30%左右, 但可溶性糖含量比对照提高了52%。PCR和PCR - Southern Blot鉴定表明, T0-1的自交后代没有基因丢失, 反义酸性转化酶基因已在转基因植株中稳定遗传。T1代转基因植株生长势也明显减弱, 但成熟果实可溶性总糖含量提高了26% , 蔗糖含量比对照提高了2.5倍, 果糖和葡萄糖含量略有降低, 酸性转化酶活性比对照明显降低。这些结果表明, 反义酸性转化酶基因通过降低酸性转化酶活性, 调控了甜瓜果实蔗糖代谢过程, 改变了甜瓜果实糖分组成, 同时抑制了植株生长。