鸡cGAS基因的克隆、表达特性分析及FAdV-4感染前后亚细胞定位变化

cGAS作为一种新型的胞质DNA受体，在宿主抵抗DNA病毒而触发的天然免疫中起着至关重要的作用。血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是无囊膜的一种双链DNA病毒，可引起鸡肝炎-心包积液综合征。为明确鸡cGAS(chcGAS)基因功能，探究在鸡肝癌(LMH)细胞中过表达chcGAS以及FAdV-4感染前后细胞定位的变化情况。本研究针对chcGAS序列设计引物进行PCR扩增，并分析该基因序列与其他物种之间的同源性以及预测该基因的结构域，构建重组质粒pET-32a-chcGAS进行原核表达，通过SDS-PAGE和Western blot鉴定，利用激光共聚焦观察FAdV-4感染LMH细胞前后chcGAS细胞定位变化。结果表明，本试验克隆得到大小为1 317 bp的chcGAS基因，与其他物种同源性为50.5%～84.4%,SDS-PAGE分析结果显示，chcGAS蛋白主要以可溶性蛋白质的形式在上清液处表达，目的蛋白质相对分子质量为75 000,与预期大小相符。亚细胞定位结果显示，FAdV-4感染可导致定位于细胞核膜上的chcGAS蛋白转移到细胞...     

血清4型禽腺病毒Fiber-2蛋白截短表达及单克隆抗体制备

【目的】获得截短表达的血清4型禽腺病毒（FAdV-4） Fiber-2重组蛋白及其单克隆抗体，为建立快速灵敏的病毒检测方法提供基础材料。【方法】对Fiber-2基因序列进行密码子优化，截取Fiber-2蛋白抗原性集中片段， PCR扩增其基因序列，连接至pET-32a（+）构建原核表达载体。将表达的重组蛋白进行纯化，并通过Western blotting验证其在大肠杆菌中的表达情况。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠后取脾细胞与SP2/0细胞融合，利用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法筛选阳性细胞株，再利用秋水仙素裂解法、间接ELISA法和间接免疫荧光法（IFA）对其进行鉴定。【结果】成功构建Fiber-2基因截短片段的原核表达系统，获得大小约为67 kD的 Fiber-2截短蛋白，以包涵体的形式出现，经纯化后可获得单一的特异性条带，经Western blotting鉴定证明其可与FAdV-4阳性血清结合从而产生一条特异性条带。经过4次亚克隆后筛选到5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株（2C2、 4F6、 5A5、 6G10和10B5），其抗体分泌稳定性、特异性好，诱生的细胞上清液抗体效价为1:1600~1:6400，腹水抗体效价为1:320000~1:1280000，秋水仙素裂解检测染色体数目为94~110条。2C2、 4F6和10B5杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG2b亚型，轻链为Kappa链； 5A5和6G10杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG1亚型，轻链为Kappa链。5株杂交瘤细胞株与感染FAdV-4的鸡肝癌上皮细胞系 （LMH）进行IFA检测，结果均为阳性。【结论】制备的Fiber-2截短重组蛋白及单克隆抗体具有良好的反应原性和特异性，可用于FAdV-4病毒检测试剂盒研发。     

禽腺病毒流行株FAdV-4-AH-F41的分子特征及对细胞因子的诱导作用

【目的】分析1株血清4型禽腺病毒（FAdV-4）流行株的分子特征及其感染对细胞因子的影响。【方法】采集安徽省某禽类养殖场疑似心包积水 肝炎综合症的鸡肝脏组织样本,用鸡肝癌细胞（LMH）对病原进行分离,采用PCR、透射电镜（TEM）观察和间接免疫荧光试验（IFA）对分离的毒株进行鉴定。采用分段扩增后拼接的方法克隆分离毒株的全基因组,对其进行遗传进化分析和序列重组分析。基于柯赫法则,用分离毒株接种无特定病原体（SPF）鸡,检验其致病性。采用实时荧光定量PCR法,检测分离毒株对LMH细胞天然免疫相关细胞因子环鸟苷酸-腺苷酸（cGAS）、干扰素刺激因子（STING）、白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8、干扰素-α（IFN-α）、IFN-β、干扰素调节因子7（IRF7）、线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）、主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ-α、MHCⅡ-β等11种细胞因子的诱导作用。【结果】分离鉴定到1株FAdV,其在LMH细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒粒子直径为70~90 nm,符合FAdV-4的结构特征;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的LMH细胞内可观察到亮红色荧光,而对照细胞没有荧光;将该毒株命名为FAdV-4-AH-F41。采用分段扩增后拼接的策略获得了FAdV-4-AH-F41全基因组序列（43 708 bp）;遗传进化分析和序列重组分析发现,FAdV-4-AH-F41与FAdV-4株核苷酸相似性为99.6%;存在3个重组事件,第1个重组事件发生在30 453-30 674 bp,第2个发生在36 884-36 988 bp,第3个发生在43 401-43 715 bp。致病性试验显示,FAdV-4-AH-F41是导致鸡心包积水-肝炎综合症的病原。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照（DMEM/F12处理）相比,用FAdV-4-AH-F41处理后LMH细胞中11种免疫因子的表达量水平均有提升,其中cGAS、IL-6、IRF7、MHCⅡ β差异达极显著水平（P<0.01）,IL-1β、IFN-α、MAVS差异达显著水平（P<0.05）,STING、IL-8、IFN-β、MHCⅠ-α差异不显著。【结论】成功分离1株重组血清4型禽腺病毒,感染LMH细胞会诱导强烈的天然免疫反应。     

猪流产衣原体CP/12株omp-1基因的克隆与表达

为观察重组MOMP蛋白的免疫活性，揭示omp-1基因(编码MOMP蛋白)在猪流产衣原体诊断和防治中的作用，用PCR法扩增猪流产衣原体omp-1基因，将特异性扩增片段克隆入pMD18-T载体，测序比较分析序列后确认为目的基因，与GenBank中4株流产衣原体omp-1基因和氮基酸序列的相似性均达99％，与其他各型衣原体代表株的相似性为71％～88％，氨基酸序列也有较大差异。将omp-1基因亚克隆到pET-32a表达载体上，再对重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌，以IPTG诱导该重组菌，结果显示该重组菌表达了融合蛋白；用猪流产衣原体多克隆抗体对表达的重组MOMP蛋白进行Western blot试验，结果显示该重组MOMP蛋白具有结合特异性抗体的活性。     

鸡PEPT1抗原表位基因的原核表达及序列鉴定

根据GenBank的原鸡PEPT1基因保守区序列设计引物,PCR扩增得到PEPT1基因抗原表位区序列,将该序列定向克隆至pET22b(+)载体上,成功构建了pET-22b-PEPT1重组质粒。重组质粒在原核表达宿主Rosetta(DE3)中诱导表达出PEPT1抗原表位区蛋白,纯化的表达产物经过质谱分析鉴定,为进一步生产鸡肽转运载体PEPT1的特异性抗体奠定了基础。     

口疮病毒O2O基因的克隆、表达及多抗制备

羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病.O2O基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白.根据GenBank中O2O基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因.然后将其亚克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET-32a-ORF-020.鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达.表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析.最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清.SDS-PAGE结果表明,ORFV O2O基因在体外获得正确表达,大小约37 kDa.Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与O2O蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性.     

罗氏沼虾 Doublesex 基因的原核表达与蛋白纯化

【目的】Doublesex 属于 DMRT 基因家族成员之一，在控制性别特异性分化中起关键作用。克隆罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）Doublesex 基因（MrDsx）的开放阅读框序列，构建重组质粒并诱导其表达，纯化获取罗氏沼虾重组蛋白 MrDsx，可为后续开展罗氏沼虾 MrDsx 基因的功能研究提供基础数据。【方法】基于罗氏沼虾 MrDsx 的开放阅读框序列，通过特异 PCR 产物与表达载体 pET-32a（+）连接，获得重组质粒 pET-32a-MrDsx，将其转化大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞，构建罗氏沼虾 MrDsx 基因的原核表达细胞。利用异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）对阳性转化细胞进行诱导表达，并以 SDS-PAGE 电泳，Western blot 和质谱分析检测诱导表达的重组蛋白。【结果】以罗氏沼虾性腺 cDNA 为模板，利用 MrDsx 基因的特异引物，PCR 扩增获得了约 660 bp 大小的单一 DNA 条带。经测序确认为 MrDsx 基因的 ORF 序列。重组质粒 pET-32a-MrDsx转化后的感受态细胞经 IPTG 在 37 ℃条件下诱导 4 h 后获得罗氏沼虾重组蛋白 MrDsx。当 IPTG 终浓度为 0.1~0.5 mmol/L 时，重组蛋白 MrDsx 的表达量可达到峰值。可溶性分析显示，重组蛋白 MrDsx 主要以包涵体形式表达，经 8 mol/L 尿素溶解、Ni 柱纯化及透析复性后，SDS-PAGE 电泳和 Western blot 检测发现重组蛋白的相对分子量约 55 kD，且条带单一，表明重组蛋白 MrDsx 能被鼠抗 His-tag 单克隆抗体特异性识别。质谱分析结果显示，片段化肽段与理论的氨基酸序列相符，匹配度达到 100%。【结论】成功获得了 MrDsx 基因原核表达的重组质粒pET-32a-MrDsx。诱导表达的重组蛋白经溶解、纯化及复性后，可形成高纯度的活性罗氏沼虾 MrDsx 重组蛋白，为后续开展罗氏沼虾 MrDsx 基因的功能研究、互作蛋白的筛选和性别调控机制的解析提供初步依据。     

小鼠IL-1Ra蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

以小鼠脾脏cDNA为模板，用降落PCR扩增IL-1Ra基因片段，IL-1Ra基因片段长约为537 bp。将IL-1Ra扩增片段和原核表达载体pET-30a(+)连接构建重组表达质粒，在37℃诱导表达，重组表达的小鼠IL-1Ra蛋白的分子质量为19 ku。用纯度较好的小鼠IL-1Ra重组蛋白免疫兔子，制备特异性多克隆抗体；测定多克隆抗体的效价达到1∶4 096 000。经Western-Blot鉴定该抗体可与Raw264.7细胞中表达的小鼠IL-1Ra天然蛋白发生特异性结合。利用实时荧光定量PCR和Western-Blot检测表明布鲁氏菌S2弱毒株感染Raw264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞)后小鼠IL-1Ra上调表达。本研究成功制备了小鼠IL-1Ra重组蛋白和兔抗多克隆抗体，为深入探讨小鼠IL-1Ra与布鲁氏菌感染之间的关系提供工具。     

鸡传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因的克隆、表达及应用

核衣壳蛋白(N)是鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的重要结构蛋白。根据已报道的IBV基因序列扩增IBVN基因,割胶回收扩增产物并将其克隆到pET-28a( )载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的蛋白得到高效表达。分离纯化重组N蛋白并用其作为抗原建立ELISA检测抗体方法,研究了IBVM41攻毒后雏鸡血清特异性抗体消涨规律。     

鸡Prnp基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16 ℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-ChPrnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。     

基因C型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备(

采用RT-PCR方法,扩增基因C型DHV JFX08株的VP1基因,与pMD18-T载体进行连接,构建新型DHV VP1基因克隆重组质粒。然后将VP1基因定向插入到pET-32a(+)表达载体中,筛选原核表达载体pET-32a-VP1,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析表明,基因C型DHV-VP1基因可在大肠杆菌中稳定高效的表达。Western-blot检测表明,表达产物可与基因C型DHV阳性血清发生特异性反应。将纯化的重组蛋白免疫4周龄SPF鸡,以纯化的VP1重组蛋白和基因C型DHV全病毒分别包板,制备的抗血清ELISA效价分别可达1∶25 600,1∶51 200,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

兔源抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、抗体的制备及初步应用

为了原核表达兔源抗凋亡蛋白Bcl-2,并诱导表达纯化该蛋白后制备多抗,采用RT-PCR扩增Bcl-2编码序列,并将该序列克隆至pET-32a(+)载体,获得重组pET-32a-Bcl-2质粒转化BL21(DE3),筛选最佳表达条件,通过亲和层析纯化目的蛋白质,最后经Western blot鉴定后免疫小鼠。结果显示,成功扩增Bcl-2编码序列并构建了pET-32a-Bcl-2表达载体;SDS-PAGE结果显示,在16℃,5 h,0.5 mmol/L IPTG的表达条件下,重组蛋白Bcl-2能够高效可溶性表达;Western blot结果表明纯化后的表达产物为高纯度的Bcl-2重组蛋白,将该蛋白质免疫小鼠后获得了特异性抗体,该抗体能够特异性识别重组Bcl-2蛋白,并应用该抗体鉴定RK13-B细胞中Bcl-2蛋白的过表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP4蛋白的原核表达与纯化

【目的】原核表达和纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的结构蛋白GP4,为深入了解其结构和功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增PRRSV BJ-4株ORF4基因片段,将其克隆到pMD19-T载体中并进行测序。从测序正确的重组质粒pMD19-T-ORF4中扩增缺失N端及C端疏水序列的基因片段tGP4(truncated GP4),再将其亚克隆到pET-32a载体并转化到大肠杆菌BL21,IPTG进行诱导表达。对表达的重组蛋白进行可溶性分析,使用尿素梯度法进行蛋白纯化,并通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性。【结果】RT-PCR获得了537bp的ORF4。成功构建了原核表达载体pET-32a-tGP4,在IPTG诱导后重组蛋白以包涵体的形式大量表达。使用尿素梯度法获得了纯度较高的目的蛋白,纯化的目的蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。【结论】使用原核细胞成功表达了PRRSV的结构蛋白GP4,纯化后的重组蛋白具有很好的免疫原性。     

绵羊肺炎支原体延伸因子EF-P基因的克隆、表达及其重组蛋白免疫原性研究

为筛选绵羊肺炎支原体(MO)免疫相关蛋白,以MO新疆流行株基因组DNA为模板,通过PCR扩增其EF-P基因,测序后对其编码蛋白进行分子特征分析;用生物信息学软件预测其抗原表位集中区编码片段;进一步将该基因片段克隆入pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-32a(+)-EF-P,将pET-32a(+)-EF-P质粒转化至感受态细胞Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达后,检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDS-PAGE结果显示,EF-P重组蛋白分子质量为29.5ku;Western blot结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,证实其具有良好的反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该重组蛋白可诱导机体产生特异性抗体,采用正向间接血凝方法检测效价可达1∶64,提示其具有较强的免疫原性。     

山羊痘病毒P32基因的克隆、测序及在原核细胞表达

为比较山羊痘病毒贵州分离株P32基因与国内外分离株的关系,并获得P32蛋白,应用PCR方法从贵州山羊痘病毒分离株的核酸样本中扩增出P32基因片段,将PCR产物克隆至pMDl8-T载体,对重组质粒进行了基因序列测定.将测定的P32基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank中相应序列作比较,同源性分别达到99.4%和98.4%,表明山羊痘病毒的P32基因具有高度保守性.将P32基因克隆至原核表达载体pET-28a,成功构建重组表达质粒pET-28a-P32/LD,转化至大肠杆菌BL2l(DE3)进行诱导表达.SDS-PAGE检测显示,重组细菌在35.5 kDa处表达一条特异性的蛋白带,而阴性对照未见这条蛋白带;Western-Blotting检测证实,这条蛋白带能与山羊痘高免血清反应而显示其免疫学活性.     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因的真核表达及其产物的免疫原性

采用RT-PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M 41株的全长S1基因,并将其片段连接到pGEM-T载体,经酶切、PCR及序列测定表明,获得的S1基因ORF全长为1 659 bp,与G enB ank上公布的IBV M 41 S1基因序列一致。将S1基因与真核表达质粒pVAX 1连接,构建重组真核表达质粒pVAX 1-S1。将重组质粒转染COS-7细胞,采用间接免疫荧光检测转染细胞S1蛋白的表达。同时以重组质粒免疫小鼠,可诱导产生特异性针对IBV S1蛋白的抗体(P<0.01)。这为鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

鸡PERK的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(15~1 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的表达量最大.蛋白纯化结果表明,100 mmol·L-1咪唑洗脱液可较好地洗脱重组蛋白,获得较多的纯化蛋白.免疫结束后,抗体效价检测结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶32 000,可以与重组蛋白特异结合.     

TAT-Apoptin基因原核表达载体的构建及其表达鉴定

为得到TAT-Apoptin 融合蛋白,以pMD-19T-Apoptin 为模板PCR 扩增出TATApoptin 基因,构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,并对TAT-Apoptin 蛋白进行表达。PCR 和测序表明,成功构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,进一步对其进行蛋白表达,发现该蛋 白能与Apoptin 多抗发生特异性结合。以上结果证明,TAT-Apoptin 基因原核表达载体构建成 功,并能在Rosetta 中进行分泌性表达。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2部分基因的克隆及原核表达

根据发表的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)ORF2基因序列,设计合成1对特异性引物,从分离到的PCV2吉林株(JL01)中扩增出PCV2 ORF2579 bp的核苷酸片段,克隆到表达载体pET-32a中,经BamHⅠ和HindⅢ酶切及序列分析获得阳性重组表达质粒pET-32a-ORF2。将其转化到表达宿主菌BL21中,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的部分结构蛋白,分子量为40 kD。通过SDS-PAGE和Western检测表明,表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的反应原性。     

蓝舌病病毒 NS4 基因原核表达载体的构建与表达

蓝舌病病毒（Bluetounge virus，BTV）非结构蛋白4（Non-structural protein 4，NS4）拮抗干扰素的产生，在BTV逃避宿主天然免疫的过程中发挥重要作用。利用PCR扩增得到 NS4 基因，与空载体pET-32a双酶切后连接，构建pET-32a- NS4原核表达载体；将pET-32a- NS4转化至E.coli BL21感受态细胞，以IPTG诱导表达；利用SDS-PAGE确定IPTG的最佳诱导浓度、时间与重组蛋白的表达形式；利用Western blot分析重组蛋白的表达情况。结果表明，成功构建pET-32a- NS4原核表达载体；IPTG最佳诱导浓度为 0.8 mmol/L，时间为6 h，蛋白主要以包涵体形式表达；Western blot在27 ku处可见目的条带，与预期相符。本研究成功构建pET-32a- NS4原核表达载体，实现NS4蛋白的大量、高效表达，为进一步探究NS4蛋白在BTV拮抗宿主天然免疫中的作用机制提供材料。