犬ANP32蛋白多态性及其对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响

【目的】探索犬酸性核磷蛋白32(canis acidic (leucine-rich) nuclear phosphoprotein 32 ku, caANP32)对不同物种A型流感病毒(Influenza A virus, IAV) RNA聚合酶活性的影响。【方法】利用实时荧光定量PCR方法分析caANP32家族基因(caANP32A、caANP32B及caANP32E)的组织分布并对其进行扩增和克隆,评估caANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用。【结果】caANP32家族基因在不同组织中分布相似,其中caANP32B基因组织丰度显著或极显著高于caANP32A和caANP32E基因(P<0.05;P<0.01),在心脏、盲肠和大脑中caANP32E基因组织丰度极显著或显著高于caANP32A基因(P<0.01;P<0.05),在肝脏、肺脏等组织中caANP32E与caANP32A基因丰度均无显著差异(P>0.05)。在犬心脏组织和MDCK细胞中发现,caANP32A基因仅存在1个转录本,caANP32B基因存在3个不同剪接...     

A型流感病毒感染免疫应答中细胞因子的作用

A型流感病毒是引起人和禽类呼吸道疾病的重要病原体。病毒在宿主的上皮细胞和中性粒细胞中复制并刺激机体产生具有各种生物活性的细胞因子。细胞因子作为天然免疫的一部分,具有抗病毒和辅助Th1型免疫应答的作用,同时细胞因子也影响适应性免疫应答和疾病的表现型。流感病毒感染导致趋化性细胞因子、促炎性细胞因子、肿瘤坏死因子α以及抗病毒细胞因子的产生。论文综述了细胞因子在A型流感病毒感染的免疫应答中的可能作用,为更好地阐明病毒感染的发病机理奠定基础。     

小鼠孤雌激活胚胎早期发育过程中胞吞作用相关蛋白的动态表达分析

为探索哺乳动物孤雌激活胚胎早期发育过程中胞吞作用相关蛋白的动态表达,通过体外生产小鼠孤雌激活胚胎,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测不同发育时期小鼠孤雌激活胚胎胞吞作用相关蛋白Cav1、Cav2基因和蛋白相对表达水平,并采用免疫荧光技术进行不同发育时期小鼠孤雌激...     

反刍动物钠依赖性葡萄糖转运蛋白的研究

葡萄糖转运蛋白分为2类:钠依赖性葡萄糖转运蛋白和易化葡萄糖转运蛋白.高精料饲养条件下,钠依赖性葡萄糖转运蛋白影响了过瘤胃淀粉在反刍动物小肠中的消化利用.     

视黄酸诱导基因-Ⅰ在家禽天然免疫应答中作用的研究进展

家禽的天然免疫应答在抵抗病毒感染的过程中起着关键性作用,视黄酸诱导基因-Ⅰ（retinoic acid inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ）作为细胞质内一类识别病毒双链RNA的模式识别受体,与天然免疫应答密切相关。它可通过RNA配体结合病原相关分子模式监测细胞质中的病毒RNA,此过程激活了RIG-Ⅰ及下游线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）,最终导致干扰素调节因子（IRF3/7）和核因子κB （NF-κB）活化,诱导产生Ⅰ型干扰素等免疫细胞因子,进而使细胞做出相应的抗病毒天然免疫反应。但由于鸡体内缺乏RIG-Ⅰ基因,目前大多将鸭源或鹅源RIG-Ⅰ基因转染鸡成纤维母细胞（DF-1）研究RIG-Ⅰ基因在鸡感染禽类病毒时是否具有免疫功能。文章介绍了RIG-Ⅰ在家禽体内的表达及其介导的抗病毒天然免疫信号通路,并简述了RIG-Ⅰ在家禽体内抗病毒作用的研究概况,为抑制家禽病毒的感染和免疫系统研究,以及研制新型抗病毒疫苗或免疫佐剂等提供参考。     

流感病毒在诱导A549细胞凋亡过程中对MDM2和p53蛋白的影响

采用Hoechst 33258染色和流式细胞术观察了流感病毒诱导A549细胞凋亡的情况,同时应用Western-blot方法研究了MDM2和p53等蛋白表达的情况.结果表明,100 TCID50/0.1 mL剂量病毒感染A549细胞后,细胞表现出典型的凋亡特征,死亡细胞比例随感染进程逐渐增加.在流感病毒诱导细胞凋亡过程中,MDM2蛋白表达下降,p53和p-p53表达上升,其下游p21蛋白也被激活.可见,p53及其下游p21蛋白参与了流感病毒诱导的A549细胞凋亡,同时通过下调MDM2蛋白表达促进了p53蛋白诱导的细胞凋亡.     

绍鸭性成熟过程中血清IGF-I和leptin浓度的变化

试验采用放射免疫学方法（RIA）测定了绍鸭性成熟过程中血清leptin和IGF-I浓度的变化.结果显示,性成熟前30 d（90日龄）时血清leptin浓度显著升高,此后呈下降趋势;在1～150日龄期间,血清IGF-I浓度出现两个峰值,即在发育早期（30日龄）和性成熟（120日龄）时.以上结果显示：leptin和IGF-I可能是性成熟启动的两个代谢相关激素信号.     

绍鸭性成熟过程中血清IGF-I和leptin浓度的变化

试验采用放射免疫学方法(R IA)测定了绍鸭性成熟过程中血清leptin和IGF-I浓度的变化。结果显示,性成熟前30 d(90日龄)时血清leptin浓度显著升高,此后呈下降趋势;在1~150日龄期间,血清IGF-I浓度出现两个峰值,即在发育早期(30日龄)和性成熟(120日龄)时。以上结果显示:leptin和IGF-I可能是性成熟启动的两个代谢相关激素信号。     

牛副流感病毒3型HNex蛋白表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在获得牛副流感病毒3型(BPIV3)的HNex蛋白及其多克隆抗体。以提取的BPIV3细胞毒的RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增包含血凝素神经氨酸酶(HN)的基因片段,然后以此为模板扩增编码HN蛋白膜外区片段(HNex基因),并进行氨基酸序列测定。将HNex基因插入克隆载体pEASY-Blunt Simple中,经双酶切连接至pET-30a(+)表达载体中,构建重组原核表达载体pET-30a-BPIV3-HNex,转化大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS感受态细胞,IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。经亲和层析方法纯化的HNex蛋白作为免疫原,制备兔抗BPIV3-HNex多克隆抗体。结果显示,本研究成功克隆BPIV3 HNex基因。原核表达蛋白结果表明,53 ku处有特异条带出现,并且可以与鼠抗His发生特异性免疫反应。免疫兔的血清中BPIV3 HNex抗体效价为1∶819200。Western blotting结果表明,制备的兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体能与BPIV3蛋白发生特异性反应。总之,本研究利用原核表达系统表达BPIV3 HNex蛋白,并获得兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体,为进一步探索BPIV3 HN蛋白的功能及亚单位疫苗研制提供参考。     

牛副流感病毒3型HNex蛋白表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在获得牛副流感病毒3型（BPIV3）的HNex蛋白及其多克隆抗体。以提取的BPIV3细胞毒的RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增包含血凝素神经氨酸酶（HN）的基因片段,然后以此为模板扩增编码HN蛋白膜外区片段（HNex基因）,并进行氨基酸序列测定。将HNex基因插入克隆载体pEASY-Blunt Simple中,经双酶切连接至pET-30a（+）表达载体中,构建重组原核表达载体pET-30a-BPIV3-HNex,转化大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS感受态细胞,IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。经亲和层析方法纯化的HNex蛋白作为免疫原,制备兔抗BPIV3-HNex多克隆抗体。结果显示,本研究成功克隆BPIV3 HNex基因。原核表达蛋白结果表明,53 ku处有特异条带出现,并且可以与鼠抗His发生特异性免疫反应。免疫兔的血清中BPIV3 HNex抗体效价为1：819 200。Western blotting结果表明,制备的兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体能与BPIV3蛋白发生特异性反应。总之,本研究利用原核表达系统表达BPIV3 HNex蛋白,并获得兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体,为进一步探索BPIV3 HN蛋白的功能及亚单位疫苗研制提供参考。     

酵母双杂交筛选人白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的蛋白

利用酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的宿主蛋白,为研究PB1-F2蛋白的功能提供依据。构建pGBKT7-PB1-F2诱饵重组载体,在证实诱饵蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛选人白细胞文库中与PB1-F2相互作用的细胞蛋白。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。Western blot结果表明,酵母表达载体pGBKT7-PB1-F2在酵母中成功表达PB1-F2融合蛋白。酵母双杂交筛选并验证,获得了8个与流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究有助于在分子水平上探索PB1-F2蛋白的新功能,为揭示流感病毒的致病机理奠定基础。     

Asia1型FMDV非结构蛋白3A基因的克隆、表达与抗原性鉴定

为了研究Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A的抗原性,试验对Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3A基因进行扩增、亚克隆及测序,将3A克隆至表达载体pET-32a(+)中,选取阳性克隆转化Rosetta(DE3)pLysS大肠杆菌感受态细胞,用IPTG诱导表达和纯化3A蛋白,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-blot分析。结果表明:在大肠杆菌中成功地表达了3A蛋白,表达的目的蛋白能与Asia1型FMDV阳性血清发生特异性反应。说明非结构蛋白3A具有较好的抗原活性。     

脱酚棉籽蛋白在鲈鱼(Lateolabrax japonicus) 饲料中替代鱼粉的应用研究

本试验旨在研究用脱酚棉籽蛋白替代部分鱼粉后,对鲈的生长、鱼体成分、消化率、能量代谢的影响,以确定脱酚棉籽蛋白在高档水产饲料中应用的可能性,为脱酚棉籽蛋白作为水产饲料蛋白源的开发提供参考。以(5.04±0.02)g的鲈鱼(Lateolabrax japonicus)为实验对象,在饲料中分别添加0%、15.2%、30.5%、46%和46%的脱酚棉籽蛋白以替代0%(D C P0)、25%(D CP25)、50%(D CP50)、75%(D CP75A)和75%(D C P75)的鱼粉蛋白,其中D C P75A组参考D CP0组进行氨基酸平衡。经过8周的饲养,对鲈鱼的生长情况、鱼体营养成分、消化率进行了测定和分析。结果…     

雌激素诱导小鼠胸腺萎缩过程中细胞因子及凋亡相关蛋白基因表达的变化

本试验应用光镜、电镜、流式细胞术、实时定量PCR技术研究了雌激素诱导小鼠胸腺萎缩过程中胸腺指数、胸腺显微和超微结构、胸腺细胞凋亡率及部分细胞因子和凋亡相关蛋白基因表达的变化。结果注射雌激素后,小鼠胸腺指数显著下降,胸腺中凋亡细胞数量显著上升,细胞因子TGF-β1表达量显著升高,IL-6表达量略为升高,而IL-7表达量显著降低;凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、FADD表达量显著上升,FasL表达量略有上升,而Bcl-2表达量显著降低。表明雌激素可能一方面通过调节胸腺细胞因子抑制胸腺上皮细胞的增殖,另一方面通过激活Caspase级联程序的启动和执行阶段及Fas/FasL凋亡信号通路促进胸腺细胞的凋亡,从而诱导小鼠胸腺萎缩。     

骨形态发生蛋白15(BMP15)通过Smads信号通路促进雏鸡原始卵泡的激活

骨形态发生蛋白15(BMP15)在卵巢发育中发挥着重要的调节作用,然而,BMP15对雏鸡原始卵泡发育的作用尚不清楚。本试验研究了BMP15对雏鸡原始卵泡发育的影响。结果表明,BMP15和BMP受体-IB(BMPR1B)mRNA的表达变化以及BMPR1B蛋白的表达变化时间点与原始卵泡的激活时间点一致。BMP15通过促进卵母细胞和颗粒细胞的增殖和抑制细胞的凋亡来激活原始卵泡的活化,这种效应可被BMPR1B的抑制剂ML347所抑制(P<0.05)。电镜观察表明,BMP15处理可增加卵泡内卵母细胞与颗粒细胞之间的缝隙连接。与此同时,Smad1、Smad5和Smad4信号通路参与了BMP15的作用过程。以上结果表明,BMP15通过Smad1、Smad5和Smad4信号通路参与雏鸡原始卵泡的激活。     

Ghrelin对雌激素诱导小鼠胸腺萎缩过程中细胞因子及凋亡相关蛋白基因表达的影响

应用光镜和实时定量PCR技术研究了Ghrelin对雌激素诱导小鼠胸腺萎缩过程中胸腺形态学以及部分细胞因子和凋亡相关蛋白基因表达的影响。结果显示,注射Ghrelin后,雌激素诱导的小鼠萎缩胸腺在形态学上基本恢复到正常水平,胸腺中IL-6、TGF-[31、Caspase3、FADDmRNA含量显著降低,Caspase9、FasLmRNA含量略为下降,而IL-7、Bcl-2mRNA含量有所上升。结果表明,Ghrelin可能通过促进胸腺上皮细胞的增殖以及阻断Caspase级联程序和Fas／FasL凋亡信号通路抑制胸腺细胞的凋亡,从而逆转雌激素诱导的小鼠胸腺萎缩。     

信号肽对猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中分泌表达的影响

旨在通过引入信号肽序列实现猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中的高效表达。首先将内源信号肽（简称endo）、蜂素信号肽（简称mel）及gp67信号肽（简称gp67）分别引入pFastBac1载体,随后插入E2基因,构建重组质粒。随后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选得到重组黏粒,将重组黏粒转染sf21细胞以得到杆状病毒。经扩增后大量感染细胞,检测E2蛋白表达情况,利用镍填料纯化得到E2蛋白,并进行蛋白糖基化水平鉴定及蛋白免疫原性分析。PCR鉴定结果显示成功构建了重组质粒。挑选白斑进行PCR鉴定,证实得到重组黏粒。Western blot检测结果表明,E2蛋白实现了分泌表达,进一步比较细胞培养上清中E2蛋白的表达水平,确定gp67信号肽介导的E2蛋白分泌表达量最高。经镍填料纯化得到E2蛋白,SDS-PAGE结果显示其纯度较高,产率为25 mg·L^-1。通过ELISA分析其抗原性,结果表明纯化所得E2蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清中的抗体,其抗原性良好。将纯化后的E2蛋白添加ISA201佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,阻断ELISA结果显示,免疫后14 d即产生较高水平的猪瘟特异性抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。本研究为E2亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

家蚕核型多角体病毒极早期蛋白PE38与家蚕SRSF蛋白激酶的相互作用关系验证

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是家蚕血液型脓病的病原,其极早期蛋白PE38参与病毒的侵染、复制与增殖。通过酵母双杂交和荧光双分子互补(Bi FC)试验证实Bm NPV PE38蛋白和家蚕SRSF蛋白激酶(Bombyx mori SRSF protein kinase 1-like,Bm SRPK)之间存在互作关系,推测Bm NPV可能是通过影响宿主的前体mRNA组成性和选择性剪接来获得对自身增殖有利的微环境。进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析感染Bm NPV后Bm N细胞中Bm SRPK的表达变化以及正常家蚕5龄第3天幼虫体内Bm SRPK表达的组织特异性,发现感染病毒后Bm N细胞中Bm SRPK的表达量有所增加;Bm SRPK在正常幼虫的精巢、中肠和脂肪体中表达量较高,在血细胞中的表达量最低。研究结果有助于进一步深入研究Bm NPV和家蚕宿主之间复杂的相互作用关系。     

小肠代谢蛋白中赖氨酸、蛋氨酸水平对荷斯坦牛产奶性能的影响

本试验采用对比试验设计,选取头胎荷斯坦牛140头为试验组,试验阶段Ⅰ(8月19日~9月6日)饲喂MPlys和MPmet含量为7.2%、2.4%的试验日粮,试验阶段Ⅱ(9月7日~9月30日)饲喂MPlys和MPmet含量分别为6.6%、2.2%的试验日粮,试验期内监测生产性能指标,并与2012年同期的135头头胎荷斯坦牛相关生产性能指标进行比较。结果显示,当试验阶段Ⅰ结束时,期末比期初产奶量提高了3.34kg/(头·d),提高了10.48%,该阶段平均产奶量提高1.45kg/(头·d),增幅比对照组提高1.48kg/(头·d),提高了4.44%,差异极显著(P<0.01);试验阶段Ⅱ,当MPlys和MPmet水平降为6.6%、2.2%时,产奶量出现下降趋势,但平均产奶量仍较试验前提高了1.84kg/(头·d),增幅比对照组提高1.62kg/(头·d),提高了4.86%,差异极显著(P<0.01);试验组全期单产增加量比对照组多出1.55kg,提高了4.65%,差异极显著(P<0.01)。试验组干物质采食量在试验阶段Ⅰ持续增加,进入试验阶段Ⅱ则出现下降。整个试验期,试验组与对照组干物质采食量差异不显著(P>0.05),但饲料转化率由1.55提高到1.62,提高了4.52%;乳脂率、乳蛋白等理化指标也有明显改善。说明在本试验条件下,提高日粮小肠代谢蛋白中氨基酸水平可增加产奶量,改善牛奶品质,提高饲料转化率。     

长链非编码RNA在PEDV感染Vero-E6细胞中对自噬的调控作用

【目的】试验旨在研究长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viru, PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)过程中对自噬的调控作用,以期为抗PEDV新型药物靶点的开发提供新思路。【方法】根据GenBank上公布的人lncRNA-HOTAIR基因序列(登录号：NR＿047517.1),利用LongMan在线工具筛选lncRNA-HOTAIR的猴源同源序列(lncRNA-M),并利用RNAfold、LncLocator在线预测工具预测其二级结构和核质分布。建立PEDV感染的Vero-E6细胞模型,在0、6、12、24、36和48 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测微管相关蛋白1-轻链3(LC3)蛋白的表达,以明确病毒感染细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR检测lncRNA-M在PEDV感染Vero-E6细胞模型中0、6、12、24、36和48 h的表达水平。设计并合成3条lncRNA-M的干扰片段：siRNA-1、siRNA...