芸薹属物种（B. napus,B. oleracea,B. rapa） MAPK1家族的克隆、进化和表达特征

【目的】克隆甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1家族,分析3个物种MAPK1转录表达器官特异性。【方法】在电子克隆的基础上,利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术获得3个物种MAPK1全长cDNA序列和gDNA序列。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析3个物种MAPK1家族的器官特异性表达特征。【结果】从甘蓝型油菜、甘蓝和白菜中克隆了MAPK1家族共4个成员基因BnMAPK1-1、BnMAPK1-2、BoMAPK1和BrMAPK1,它们的gDNA长度为2 512—2 525 bp,均有3个外显子和2个内含子,最长标准mRNA为1 599—1 620 bp,ORF均为1 100 bp。系统进化分析表明,甘蓝型油菜MAPK1家族来自于甘蓝和白菜MAPK1之和,其中,BnMAPK1-1对应于BoMAPK1,BnMAPK1-2则对应于BrMAPK1。qRT-PCR结果显示3个物种MAPK1在所有检测器官中均有表达,但器官特异性在种间差异显著,暗示快速进化。【结论】克隆了甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1的全长cDNA序列和gDNA序列,支持甘蓝和白菜通过天然种间杂交形成异源四倍体物种甘蓝型油菜的假说,芸薹属MAPK1基因和蛋白在序列和结构上非常保守,但转录表达的器官特异性上进化极快,近缘种间差异显著。     

特早熟春性甘蓝型油菜sBnFLD基因的克隆及表达

【目的】克隆特早熟春性甘蓝型油菜A基因组上的sBnFLD基因,并对其进行表达研究,为该基因的功能及其在成花转变中的作用研究奠定基础。【方法】根据GenBank中已报道的拟南芥和白菜型油菜FLD同源基因的保守序列设计引物,采用PCR和RT-PCR扩增特早熟春性甘蓝型油菜86号品系(光周期不敏感)的FLD同源基因,用qRT-PCR技术检测sBnFLD基因在86号品系不同发育时期茎、叶和茎尖中的表达情况。【结果】克隆出了sBnFLD基因,命名为sBnFLD,在GenBank中的登录号为KR003079.1。sBnFLD基因cDNA全长2 376bp,有3个内含子,4个外显子,编码791个氨基酸残基,分子量86.5ku,等电点8.5;sBnFLD为非分泌蛋白和非膜蛋白;sBnFLD蛋白N端有2个保守的结构域α螺旋结构域(SWIRM)和NAD(P)-binding-8结构域,该蛋白有多个α螺旋和β折叠。生物信息学分析显示,sBnFLD蛋白与已报道的甘蓝型油菜未知蛋白(CDX73929.1)和电子克隆的白菜型油菜FLD(XP_009135110.1)氨基酸序列相似性达99%,与拟南芥FLD氨基酸序列相似性达87%。qRT-PCR分析结果显示,sBnFLD基因在油菜苗期和现蕾初期茎、叶、茎尖中均有表达,但在蕾期茎尖中表达量最高。【结论】克隆出的sBnFLD基因为甘蓝型油菜的FLD同源基因,该基因在春性特早熟甘蓝型油菜开花调控中可能起着重要的调节作用。     

不结球白菜BrABF3基因的克隆与功能分析

[目的]本文旨在研究BrABF3基因在不结球白菜开花时间调控中的功能。[方法]以不结球白菜‘苏州青’为材料,通过同源克隆获得BrABF3基因全长序列,再与其他物种中的同源序列进行进化树分析;利用注射法将农杆菌导入烟草叶片研究BrABF3基因的亚细胞定位;利用PlantCARE在线软件分析启动子motif元件;采用荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析BrABF3基因在早花品种‘苏州青’和晚花‘五月慢’品种不同生长期的表达情况。[结果]BrABF3基因含有1 242 bp开放阅读框,编码413个氨基酸,其蛋白定位于细胞核。在进化过程中BrABF3的氨基酸序列与甘蓝型油菜亲缘关系最近。BrABF3启动子序列中含有大量的motif元件,如光响应元件、激素响应元件和胁迫响应元件等。RT-qPCR结果表明,开花前BrABF3基因在晚花品种‘五月慢’中的表达显著高于早花品种‘苏州青’。[结论]本试验克隆并获得BrABF3基因,其蛋白定位于细胞核,而且在晚花品种中高表达,推测该基因可能参与调控不结球白菜的开花时间。     

白菜型油菜中WRKY基因的克隆与表达(英文)

[目的]为研究WRKY转录因子在ABA诱导下的表达调控。[方法]首先利用同源克隆法在白菜型油菜中克隆WRKY基因和Actin基因片段,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析;通过荧光定量PCR技术检测白菜型油菜WRKY基因在ABA处理条件下的相对表达趋势;然后利用相对定量PCR技术(real-timerelative quantificationPCR,以下简称RT-qPCR)检测WRKY基因在ABA(100μmol/L)诱导不同时段的差异表达。[结果]在白菜型油菜中克隆到一段长度为680bp的WRKY基因片段和一段长度为933bp的β-actin基因片段。RT-qPCR实验结果表明,BcWRKY能被ABA诱导表达,且在诱导1h后表达量最高。[结论]成功地克隆了白菜型油菜的WRKY转录因子基因和Actin基因片段,并证明了白菜型油菜WRKY基因的表达受ABA的影响。     

芸薹属植物MYBL2基因的克隆及其在A、B、C基因组中的PCR鉴别

【目的】MYBL2负调控拟南芥花青素和原花青素的生物合成。从芸薹属6个物种的不同叶色材料中克隆MYBL2基因,分析其序列和表达模式,探究其在芸薹属植物花青素生物合成途径中的功能,为油菜的品质、抗逆性、观赏性等性状改良提供参考。【方法】以芸薹属6个物种19份供试材料的总DNA为模板,同源克隆MYBL2基因,并进行多序列比对和进化树分析;对白菜、甘蓝型油菜、芥菜型油菜以及埃塞俄比亚芥的紫叶材料进行遮光处理,结合转录组和qRT-PCR分析MYBL2基因表达水平;对甘蓝、甘蓝型油菜、芥菜型油菜以及埃塞俄比亚芥紫、绿叶材料进行qRT-PCR分析MYBL2基因表达水平;根据克隆MYBL2-1和MYBL2-2序列的核苷酸变异位点设计特异性引物,开发能够区分MYBL2基因组来源的PCR标记。【结果】克隆获得MYBL2-1和MYBL2-2各9个同源基因共56个拷贝。其中,BcaMYBL2-1为首次获得,BcaMYBL2-1编码区序列全长为867 bp,包含2个内含子,分别为168和102 bp,编码198个氨基酸,分子量为22.69 kD,等电点（pI）为8.72。序列比对和进化分析表明,BcaMYBL...     

白菜型冬油菜铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD） 基因的克隆及表达分析

【目的】了解SOD酶蛋白家族Fe-SOD在超强抗寒冬油菜中的表达情况及其在低温胁迫下的作用。【方法】采用RT-PCR技术克隆超强抗寒白菜型冬油菜陇油7号Fe-SOD的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用半定量以及相对定量RT-PCR研究Fe-SOD在低温胁迫下的表达模式,采用氮蓝四唑（NBT）光还原法测定冬油菜叶片和根中的总SOD酶活性。【结果】获得Fe-SOD,GenBank登录号为KF178713,该基因cDNA片段全长645 bp,包含一个639 bp完整的开放阅读框,编码212个氨基酸的蛋白质,与白菜(Chiifu)的蛋白质氨基酸序列同源性高达99%。该基因编码的酶蛋白是1个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白,无信号肽,无跨膜结构域。Fe-SOD表达模式分析显示初期低温胁迫下（4℃）,该基因上调表达,继续低温胁迫处理（-4℃和-8℃）,Fe-SOD表达量受到抑制。总SOD酶活性测定显示冬油菜根中酶活性高于叶片,以利于冬油菜安全越冬。【结论】从白菜型冬油菜克隆的Fe-SOD具有已知物种Fe-SOD的特征。Fe-SOD在冬油菜品种陇油7号抗寒过程中起作用。     

白菜型油菜MPK12基因克隆及表达分析

【目的】克隆白菜型油菜‘陇油6号’MPK12基因的全长cDNA序列,研究其组织表达特异性,分析MPK12基因在低温、盐、ABA和H_2O_2处理下的表达情况,以阐明MPK12基因在油菜中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆MPK12基因cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析MPK12基因的组织表达特异性以及在低温、盐、ABA和H_2O_2逆境胁迫下的表达情况。【结果】油菜MPK12基因cDNA全长1 395bp,包括5′-UTR 69bp,3′-UTR 207bp,开放阅读框1 119bp,编码372个氨基酸,预测蛋白质分子量42.6ku,理论等电点为7.9,二级结构主要包括α-螺旋和不规则卷曲。多序列比对和系统进化分析表明,油菜MPK12与拟南芥AtMPK12具有很高的同源性,为90.7%。实时荧光定量PCR结果显示,MPK12基因在油菜根、茎、叶、芽和种子中均有表达,没有组织特异性;同时,该基因的表达受低温、盐、ABA和H_2O_2胁迫诱导。【结论】克隆得到油菜MPK12基因,其在油菜适应逆境胁迫过程中发挥作用。     

油菜BnICE1的克隆及表达分析

【目的】从超强抗寒油菜品种陇油6号中克隆抗寒转录因子BnICE1,并对其进行序列特征分析,研究BnICE1在低温胁迫下表达水平的变化,探讨BnICE1对油菜耐低温胁迫能力的影响。【方法】利用RACE技术获得油菜BnICE1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR研究BnICE1低温及不同组织表达量。【结果】cDNA片段全长1 737 bp,包含1 500 bp完整的开放阅读框,该基因编码499个氨基酸残基,分子量53.2 kD,等电点5.0。序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其它植物的ICE1蛋白具有较高的同源性,因此命名为BnICE1（GenBank登录号为JF268687）。进化树分析表明,BnlCE1同羊草和白菜亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在油菜茎、叶和下胚轴均有表达,下胚轴中表达量最高,同时该基因的表达受低温胁迫诱导。【结论】从油菜中克隆了抗寒基因BnICE1,实时荧光定量PCR分析表明其在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

甘蓝型油菜湿害相关基因BnLDH-1的克隆和表达分析

采用RACE技术从中双9号中克隆了甘蓝型油菜BnLDH-1基因全长cDNA序列和基因组序列。BnLDH-1基因的DNA序列为1 432 bp,包含1个内含子;cDNA序列全长1 319 bp,含有1个1 053 bp的ORF,其编码蛋白含350个氨基酸。经预测发现,BnLDH-1蛋白存在LDH-1保守结构域。qRT-PCR结果表明,湿害诱导BnLDH-1表达,但在不同耐湿性甘蓝型油菜品种中,BnLDH-1的诱导表达水平不同。相关分析表明,湿害胁迫后48 h的BnLDH-1表达量与12份测试的甘蓝型油菜材料的耐湿指数呈显著负相关,其相关系数为0.73。     

白菜型油菜‘陇油6号’ COR15-like基因的克隆与表达

为探究COR基因在油菜抵御逆境胁迫中的作用,采用RACE技术从白菜型油菜‘陇油6号’克隆获得1个新的COR15-like基因BrCOR15,该基因全长616bp,其中,5′非翻译区59bp,3′非翻译区167bp,开放阅读框390bp,编码129个氨基酸,推测其蛋白分子质量为13.9ku,理论等电点为5.2。该基因编码蛋白质的氨基酸序列与多种植物具有较高一致性,与拟南芥AtCOR15、AtCOR15a,高山离子芥CbCOR15,高山葶苈DaCOR15a、DaCOR15b的氨基酸序列一致性分别为74.6%、77.7%、72.3%、77.9%和76.7%。实时荧光定量PCR分析表明,BrCOR15基因在油菜的茎、叶和下胚轴均有表达,无组织特异性;该基因表达受低温、ABA和H2O2诱导,与单独处理结果相比,经MAPKK抑制剂U0126预处理12h再经低温、ABA和H2O2处理后,BrCOR15基因的表达量明显降低,表明该基因在油菜适应低温、ABA和H2O2胁迫过程中发挥作用。     

甘蓝型油菜GPDH基因克隆、表达分析及植物过表达载体构建

[目的]克隆甘蓝型油菜的甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)基因(BnGPDH),分析其表达特性并构建植物过表达载体,为研究该基因在油菜种子三酰甘油(TAG)合成和积累中的作用机制提供理论参考.[方法]以甘蓝型油菜H105为材料,采用同源克隆技术克隆与At3G07690同源的BnGPDH基因,对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BnGPDH基因在甘蓝型油菜不同组织[根、茎、叶、蕾、花及花后(DAF)7、14、21、30和40 d角果皮和种子]及高、低油含量自交系角果皮和种子中的表达情况,并将克隆获得的BnGPDH基因连接至携带napin启动子的pCAMBIA1390-NAPIN载体上构建植物过表达载体.[结果]克隆获得的BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因编码区(CDS)长度均为1338 bp,编码445个氨基酸,其编码蛋白仅有5个氨基酸差异,均具有NAD_Gly3P_dh_N和NAD_Gly3P_dh_C结构域,定位于细胞质,分别与白菜细胞质型GPDH蛋白(XP_009147040.1)和甘蓝细胞质型GPDH蛋白(XP_013585317.1)的氨基酸序列具有较高相似度,对应的相似度为100.00%和99.78%,且二者与双子叶植物GPDH蛋白亲缘关系较近,与单子叶植物GPDH蛋白亲缘关系较远.BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在甘蓝型油菜不同组织中均有表达,且表达模式总体上相似,在21DAF和30DAF种子中的表达量显著高于其他组织部位(P<0.05,下同),表明21DAF和30DAF是油菜种子TAG合成和积累的高峰期,但在角果生长发育不同时期这2个基因的表达略有不同,且在茎、蕾、种子(7DAF、21DAF、30DAF和40DAF)和角果皮(7DAF和40DAF)中,BnGPDHc2-1基因的表达量均显著高于BnGPDHc2-2基因,而在14DAF角果皮中BnGPDHc2-2基因的表达量显著高于BnGPDHc2-1基因.21DAF种子中BnGPDHc2-1基因在3个高油含量自交系中的表达量显著高于3个低油含量自交系,BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系IL130和IL594中的表达量显著高于3个低油含量自交系;在30DAF种子中,BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2在3个高油含量自交系中的表达量均显著高于3个低油含量自交系.将BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因分别连接至携带na-pin启动子的pCAMBIA1390-NAPIN载体上可成功构建获得植物过表达载体.[结论]BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在甘蓝型油菜不同发育期角果中行使的功能存在一定分化,在进化过程中可能分别来源于白菜基因组和甘蓝基因组,但均在甘蓝型油菜种子TAG合成和积累发挥重要调控作用.因此,构建的植物过表达载体可用于BnGPDH基因功能分析及油菜种子油含量基因工程改良研究.     

不结球白菜响应ABA和低温基因WRKY18的克隆及表达分析

[目的]WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物的生长发育、生物及非生物胁迫响应。克隆和鉴定不结球白菜共同响应ABA和低温的WRKY基因,对研究不结球白菜抗逆分子机制和改良其抗逆性具有重要意义。[方法]采用电子克隆的方法在NCBI数据库中进行不结球白菜WRKY18基因全长拼接,然后在不结球白菜‘苏州青’中,克隆到1个与低温及ABA响应相关的WRKY基因,通过生物信息学手段和实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析了该基因的序列结构特征及其在低温和ABA处理下的表达变化。[结果]该基因全长为1080bp,含有978bp的开放阅读框,编码326个氨基酸,与油菜及拟南芥的WRKY18直系同源,氨基酸序列相似性分别为87%和73%,命名为BcWRKY18。序列分析表明,该编码蛋白为核蛋白,不含跨膜区,无信号钛,具有WRKYGQK基序(motif)约60个氨基酸残基的WRKY保守结构域,为WRKY转录因子家族成员。系统聚类分析指出了BcWRKY18蛋白的保守性及其在开花植物中的进化关系;序列结构和同源建模分析指出了BcWRKY18蛋白的保守结构域、蛋白质的二级及三级结构分布模型;qRT-PCR检测了BcWRKY18基因在ABA和低温胁迫下的表达,表明低温和ABA都能诱导BcWRKY18基因表达,其表达模式都存在相似的过程,且BcWRKY18基因对ABA的响应比对低温的响应更快、更明显。[结论]从不结球白菜中克隆获得1个新的WRKY类转录因子基因BcWRKY18,基因表达分析发现BcWRKY18可能存在对ABA和低温的共响应及自身反馈调控。     

金银花FT基因的克隆及在不同花器官中的表达分析

在药用植物金银花中克隆了开花整合基因LjFT(Genbank登录号：OP700454)，并对其开展了生物信息学分析和不同花器官中的表达分析。结果表明：金银花LjFT基因包含4个外显子和3个内含子，编码框长度为525 bp，编码174个氨基酸残基，其所编码的蛋白质与其他植物FT序列高度保守；基于SWISS-MODEL和Alphafold 2这2种方法进行的蛋白结构预测表明金银花LjFT与拟南芥FT在蛋白质三级结构上高度保守；启动子分析表明LjFT启动子序列中含有大量激素响应元件、光响应元件和胁迫响应元件；系统进化分析表明LjFT与绣球HmFT亲缘关系最近；表达分析表明LjFT主要在花蕾期高量表达，尤其是花萼和花瓣中，开花后表达水平迅速降低。     

不结球白菜开花相关基因BcGI的克隆、亚细胞定位及基因沉默功能验证

[目的]本文旨在揭示不结球白菜GIGANTEA(GI)基因的功能,验证其与CONSTANS(CO)、FLOWERING LOCUS T(FT)基因之间的调控关系以及其在植物抽薹开花中的作用。[方法]以不结球白菜品种‘苏州青’为材料,提取RNA并反转录成cDNA,同源克隆BcGI基因,Gateway构建表达载体pEarleyGate101-BcGI-YFP,利用农杆菌介导法将表达载体注射入本氏烟草中,激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位。Gateway构建沉默载体BcGI-RNAi,利用农杆菌介导法将沉默载体导入拟南芥中,观察野生型和转基因植株抽薹期的表型变化。采用RT-qPCR技术,检测GI、CO、FT基因在转基因和野生型拟南芥植株抽薹期的基因表达量。[结果]通过同源克隆,得到BcGI基因,其含有1个3 516 bp的开放阅读框(ORF),编码1 171个氨基酸。亚细胞定位结果显示,BcGI定位于细胞核中。RT-qPCR结果表明,BcGI基因在沉默转基因植株中的相对表达量比野生型植株低;同时当GI基因表达受到抑制时,CO、FT基因在沉默转基因植株中的相对表达量也比野生型明显降低,沉默转基因植株与野生型相比表现为开花延迟且抽薹期莲座叶数明显增多。[结论]BcGI定位于细胞核,参与正向调控下游CO、FT基因的表达,进而影响不结球白菜光周期开花途径。     

白菜型春油菜新品种陇油18号选育报告

白菜型春油菜新品种陇油18号是甘肃省农业科学院作物研究所油菜课题组以门源油菜为母本、E144为父本杂交选育而成的极早熟白菜型春油菜常规种。2014—2015年参加甘肃省极早熟组春油菜区域试验,陇油18号2 a 10点次平均折合产量为2 130.15 kg/hm2,较对照品种甘南4号增产16.40%,增产油籽300.15 kg/hm2。陇油18号生育期108 d,平均株高126 cm,一次有效分枝数3～6个,单株果数268个,角粒数20.85粒,千粒重2.98 g。籽粒含油量(粗脂肪)38.89%,芥酸含量0.98%,硫苷含量22.41μmol/g,品质达到国家"双低"标准。适宜在甘肃张掖、武威、甘南、定西等海拔2 400 m以上春油菜种植区种植。     

墨兰FT同源基因的时空表达及功能分析

FLOWERING LOCUS T(FT)基因是植物开花调控途径的整合基因,整合来自光周期途径、春化途径和自主途径等不同花发育途径的信号,在植物花发育中发挥着重要作用。从墨兰品种‘企剑黑墨’中克隆了新的FT同源基因,并对其各组织部位的表达特性和生物学功能进行了分析。结果表明,墨兰FT基因c DNA全长序列为618bp,其中开放阅读框为531 bp,编码176个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、水稻中FT基因的氨基酸序列有较高的同源性。墨兰FT同源基因在‘企剑黑墨’各器官中均有表达,营养生长期FT基因在腋芽中的表达量最高,生殖生长期FT基因在腋芽,花梗,花蕾等器官中的表达量较高,在根和叶中的表达量最低。在拟南芥中超表达墨兰FT同源基因,能显著促进拟南芥开花。     

陆地棉开花整合子调控机制解析

开花是植物产生有性生殖器官的重要阶段，开花整合子整合来自环境和植物体内的信号，进而激活花芽分化，使植物在适宜的时间产生足够多的后代，保障生殖繁衍。棉花中开花整合子基因（FT、SOC1和LFY）已被克隆，但它们在棉花中的进化关系尚不清楚。参考陆地棉基因组，明确了棉属开花整合子同源基因数目，FT和LFY在棉属中进化具有保守性，而SOC1基因序列具有多样性。不同于其他物种，棉花开花整合子基因均在顶端分生组织和叶片中表达量较高，且随着棉苗的生长发育其表达量逐步升高。克隆了GhLFY-2、GhFT-2和GhSOC1-5基因，发现其促进开花的功能是保守的，但开花时间调控机制存在物种特异性。陆地棉中既存在保守的GhFT-2/GhSOC1-5/GhLFY-2线性调控路径，又进化出GhFT-1和GhSOC1-1直接调控GhAP1的路径，表明棉花开花时间调控机制的多样性可能与其对环境的适应性有关。     

不结球白菜BrCBF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中克隆到1个抗寒相关基因,命名为BrCBF,基因登陆号为DQ402470.其cDNA全长1 003 bp,含有648 bp的完整开放阅读框,编码216个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与拟南芥、荠菜、甘蓝型油菜编码的氨基酸序列有极高的同源性,且具有CBF典型的保守结构域AP2.     

不结球白菜BrCBF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中克隆到1个抗寒相关基因,命名为BrCBF,基因登陆号为DQ402470.其cDNA全长1 003 bp,含有648 bp的完整开放阅读框,编码216个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与拟南芥、荠菜、甘蓝型油菜编码的氨基酸序列有极高的同源性,且具有CBF典型的保守结构域AP2.