尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立

根据尼帕病毒(NiV)M基因和猪流感病毒(SIV)M基因序列设计引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立了一种鉴别NiV和SIV的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法,对该方法的定量线性范围、敏感性、重复性和特异性进行了评价及初步应用。结果显示,用该方法检测NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)和SIV M基因的RNA标准对照(SIV-M-RNA),定量线性范围分别为4.6×101copies/μL~4.6×108 copies/μL和5.8×101copies/μL~5.8×108 copies/μL,检出限分别为46个拷贝和58个拷贝。该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于1.6%,显示其良好的可重复性。该方法仅对NiV-M-RNA和SIV呈现特异性扩增曲线,不与猪瘟病毒(CSFV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用该方法对236份猪的鼻拭子样品进行NiV和SIV的同时检测,所有样本的NiV检测结果均为阴性,有1份样本的SIV检测结果为阳性。本研究建立的方法可为猪临床样本中NiV和SIV的鉴别检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

多重RT-PCR检测猪流感病毒及血清亚型

根据GenBank登录的猪流感病毒各血清亚型NP基因,H1、H3亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因核苷酸序列,经DNAstar软件类比选择保守区设计引物,sPCR筛选出引物对,用于扩增猪流感病毒NP基因、血凝素H1/H3亚型、神经氨酸酶N1/N2亚型基因片段。根据NP、H1N1、H3N2亚型引物扩增片段大小和反应条件的差异,将各引物配比组合,形成引物组合,建立多重RT-PCR体系。经对不同亚型模板的扩增、检验,建立的2个多重RT-PCR体系可用于猪流感病毒及H1/H3血凝素亚型、N1/N2神经氨酸酶亚型的快速鉴别、诊断。特异性试验检测多重RT-PCR不能扩增其他猪病毒核酸,核酸的最低检测量达0.2ng。采集临床具有呼吸道症状的猪肺、鼻腔棉试子等85份,与鸡胚分离及血凝/血凝抑制试验比较,阴性样品检测符合率达100%。     

双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

H1、H3亚型猪流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒（swine influence virus,SIV）的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素（hemagglutinin,HA）基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条TaqMan探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法敏感性高,可检测到最低拷贝数为10²拷贝/μL;重复性良好,重复孔Ct值的变异系数均在5%以下;特异性好,除H1和H3亚型SIV外,H4、H5、H7、H9亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒检测均为阴性;在田间样品中成功检出1株H1和1株H3亚型SIV,检出率为1.16%。该方法准确、快速、灵敏、特异,可为H1、H3亚型SIV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。     

猪流感病毒RT-PCR快速检测方法的建立

根据猪流感病毒M基因序列设计了一对扩增M基因684 bp片段的特异性引物,建立了RT-PCR快速诊断猪流感的方法,采用该方法检测出H1、H3、H5和H9 4个亚型猪流感病毒标准参考株为阳性,猪副黏病毒、圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果呈阴性.RT-PCR最少可检测到1 000EID50的病毒量核酸,可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒.     

H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法的建立与应用

为了建立适用于临床诊断的H1N1亚型猪流感病毒快速检测方法,本研究根据GenBank已登录的H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因序列设计RT-PCR扩增引物,以H1N1亚型猪流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒为试验对照,通过优化RT-PCR反应条件和反应体系,建立了H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法。同时,运用H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法和本研究建立的方法对165份猪病料样品进行了对比验证。结果表明,本研究建立的H1N1亚型猪流感病毒双重RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性,所扩增的目的基因片段大小分别为428 bp和678 bp左右,可检出最小基因组RNA浓度为2.9×10-5μg/μL。本研究建立的方法和H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法均从同一份猪肺脏样品中检测出H1N1亚型猪流感病毒,其余样品中均未检出H1N1亚型猪流感病毒,两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适用于H1N1亚型猪流感病毒双基因定型检测,可在H1N1亚型猪流感病毒流行病学调查和临床诊断中应用。     

H1亚型猪流感病毒微滴数字RT-PCR定量检测方法的建立

本研究针对H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)HA基因保守序列设计引物和探针,通过反应条件优化,建立了一种快速、准确检测H1亚型SIV的微滴数字RT-PCR定量方法。该方法特异性强,除H1亚型SIV外,H3、H5、H7亚型SIV以及猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等检测均为阴性;敏感性高,最低可检测4.7拷贝/μL;重复性好,对5个不同稀释度的H1亚型SIV RNA进行3次重复试验,每个稀释度的变异系数均小于5%。利用该方法对湖南省规模化养殖场收集的30份猪鼻拭子样品进行检测,发现与荧光RT-PCR检测结果一致。试验表明,该方法快速、准确、灵敏,可为H1亚型SIV的快速筛查及流行病学研究提供可靠的技术保障。     

塞尼卡病毒与口蹄疫病毒双重RT-PCR鉴别检测方法的建立

2014~2015年,美国、巴西等国爆发了一种症状类似于口蹄疫的水泡性疾病,病原被确定为塞尼卡病毒A(Senecavirus A,SVA)。为了鉴别和诊断塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV),本研究针对塞尼卡病毒的VP1基因和口蹄疫的5’UTR基因,合成特异性引物,优化了反应体系和扩增条件,建立了一种可同时检测塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒的双重RT-PCR方法。特异性和敏感性试验结果表明,建立的双重RT-PCR检测方法特异性好,敏感性强,对塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒最低检出量分别为104 copies/μL、103 copies/μL。本研究建立的方法对临床快速鉴别塞尼卡病毒A和口蹄疫病毒感染具有重要意义。     

H10亚型和N8亚型禽流感病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据Gen Bank中H10亚型和N8亚型禽流感病毒(AIV)的HA和NA基因保守序列,分别设计筛选出2对特异性引物,用于H10亚型和N8亚型AIV的检测,优化引物之间的浓度,建立了同时检测H10亚型和N8亚型AIV的双重RT-PCR检测方法。该方法对H10N8亚型AIV可特异性扩增出267 bp(H10亚型)和464 bp(N8亚型)目的条带,对H10Ny(y≠8)亚型AIV仅扩增出267 bp目的条带,对HXN8(x≠10)亚型AIV仅扩增出464 bp目的条带,对其他亚型AIV和常见禽病病原体均未扩增出任何条带。该方法对H10亚型和N8亚型AIV检测下限均为104拷贝数/μL。本研究建立的H10亚型和N8亚型AIV双重RT-PCR特异性强、灵敏度高,可同时快速检测H10亚型和N8亚型AIV,为其感染的快速鉴别诊断提供一种简便、快速和有效的方法。     

A型猪流感病毒TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法的建立

根据A型猪流感病毒(SIV)的基质蛋白(M)编码基因保守序列设计合成一对特异性引物和一条Taq Man探针,建立了一种检测A型SIV的荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法对H1N1、H3N2和H9N2亚型SIV均呈特异性扩增,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒等猪的其他常见病毒无交叉扩增反应;该方法对M基因RNA对照(SIV-M-RNA)的最适线性检测范围为3.8×10~1~3.8×10~8拷贝数/反应,标准曲线方程为Y=-3.4365X+40.091,相关系数(R~2)为0.999 8,最低检出限为38个拷贝数的SIV-M-RNA。对3个不同浓度(3.8×10~3~3.8×10~5 copies/μL)的SIV-M-RNA进行组间和组内重复试验,每个浓度的Ct值变异系数均小于1.5%,具有良好的重现性。用该方法对860份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪场猪鼻拭子样本进行SIV检测,结果进口猪鼻拭子样本的SIV检测均为阴性,17份国内猪场猪鼻拭子样本SIV检测为阳性。本研究提供了一种快速、敏感和特异的A型猪流感病毒检测方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪流感病毒二重RT-PCR 检测方法的建立

为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）与猪流感病毒（SIV）二重RT-PCR 方法,研究根据GenBank 登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上2 种病毒的RT-PCR 诊断方法,扩增的目的片段长度分别为364 bp（PRRSV）和981 bp（SIV）。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PRRSV 和SIV 的核酸检测最低浓度分别为 3.2×10-3 ng 和2.7×10-3 ng。应用该方法对32 、份临床样品进行检测发现PRRSV 阳性率为43.8%,SIV 阳性率为31.3%,二重感染率为9.4%。该方法的成功建立为快速高效地检测以上2 种病毒提供了有力手段。     

河南省部分地区猪流感病毒的RT-PCR检测与亚型鉴定

<正>猪流感是由猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)引起的一种急性高度接触传染性猪呼吸道疾病,临床上以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、高发病率、低死亡率为特征。当有其他病原继发或混合感染时,常引起更严重的经济损失。SIV可以感染人,因此其具有重要的公共卫生意义。有关河南省SIV的研究报道不多,笔者本次研究旨在了解河南省部分地区SIV的感染情况及其亚型,现将研究结果报道如下。     

检测H1和H3亚型猪流感病毒多重RT-PCR方法的建立

猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)危害猪体健康,影响生长性能,SIV常常与其他病毒和细菌双重或多重感染,使病情加重,死亡率增高[1].目前,猪流感(SI)已遍布美洲、亚洲和欧洲等世界各地,已成为规模化猪场的常发呼吸道传染病之一[2].特别是近年来禽源流感病毒在猪体内的发现更引起人们的关注[3].当前我国流行的SIV主要是H1和H3亚型[4-5].PCR方法特异、敏感、快速、简便,可从临床样品中直接进行诊断和鉴别,而不需要进行病毒分离和其他辅助性试验,是一种很有价值的检测手段.本研究建立的多重RT-PCR方法可同时达到对猪流感病毒诊断及H1和H3亚型鉴定目的,节约了时间和成本.     

猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立

对我国分离到的猪流感病毒和GenBank数据库中已有的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型毒株的HA、NA基因核苷酸序列进行分析,分别选出各个病毒亚型HA和NA基因中高度保守且特异的核苷酸区域,设计扩增猪流感病毒H1和H3、N1和N2亚型的2套多重PCR特异性引物,建立了猪流感H1N1、H1N2和H3N2亚型病毒多重RT-PCR诊断方法。采用该方法对H1N1、H1N2、H3N2亚型猪流感病毒标准参考株进行RT-PCR检测,结果均呈阳性,对扩增得到的片段进行序列测定和BLAST比较,表明为目的基因片段。其它几种常见猪病病毒和其它亚型猪流感病毒的RT-PCR扩增结果都呈阴性。对107EID50/0.1mL病毒进行稀释,提取RNA进行敏感性试验,RT-PCR最少可检测到102EID50的病毒量核酸。对40份阳性临床样品的检测结果是H1N1、H1N2和H3N2亚型分别为16份、1份和20份,其它3份样品同时含有H1N1和H3N2亚型猪流感病毒,和鸡胚分离病毒结果100%一致。试验证明建立的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法是一种特异敏感的诊断方法,可用于临床样品的早期快速诊断和分型。     

H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达10²拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。     

同时检测口蹄疫病毒和牛肠道病毒双重RT-PCR方法的建立

为建立同时检测口蹄疫病毒(FMDV)和牛肠道病毒(BEV)的双重RT-PCR方法,本研究根据已发表的FMDV和BEV基因的5’UTR保守区域,分别设计、筛选出一对特异性引物建立了双重RT-PCR方法,并优化了反应体系和条件。采用该方法检测其他几种牛相关病毒结果均为阴性,表明特异性良好。该方法对FMDV的最低检出限为8 TCID50/0.1 mL,对BEV的最低检出限为2 TCID50/0.1 mL,表明其具有良好的敏感性。采用该方法检测了852份临床样品,并与病毒分离方法比较,结果两种方法检测结果完全一致。本研究首次建立了同时检测FMDV和BEV的双重RT-PCR快速检测方法,该方法的建立为FMDV和BEV的检测提供了一种技术手段。     

H1和H3亚型猪流感病毒二重TaqMan-MGB探针荧光RT-PCR检测方法的建立

根据H1和H3亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)编码基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和Taq Man-MGB探针,建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法仅对H1和H3亚型SIV呈特异性扩增,对H9亚型SIV、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(SFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)无交叉扩增反应;用该方法检测H1和H3亚型SIV的HA基因的RNA标准对照(SIV-H1-RNA,SIV-H3-RNA),最适线性检测范围分别为3.7×10~1~3.7×10~8拷贝数/反应和3.4×10~0~3.4×10~8拷贝数/反应,最低检出限分别为38和34个拷贝数;该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示其具有良好的可重复性。用该方法对520份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪鼻拭子样本进行SIV检测发现,进口猪鼻拭子样本的SIV检测结果均为阴性,12份国内猪鼻拭子样本的H1亚型SIV检测结果为阳性,5份国内猪鼻拭子样本的H3亚型SIV检测结果为阳性。本方法的建立为H1和H3亚型SIV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

塞内卡谷病毒和口蹄疫病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立塞内卡谷病毒(SVV)和口蹄疫病毒(FMDV)的快速鉴别检测方法,本试验根据SVV 3D基因序列和FMDV 3D基因序列,分别设计探针和引物,建立了可同时检测SVV和FMDV的双重荧光RT-PCR法。结果表明,该方法特异性强,能准确检测出SVV核酸和FMDV核酸,与水泡性口炎病毒(VSV-IND和VSV-NJ)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)等病原核酸无交叉反应;灵敏度高,本试验中最低可检测到SVV和FMDV核酸质量浓度分别为1.35×10~(-5),1.68×10~(-5) mg/L。重复性好,Ct值变异系数小于4%。利用所建立方法对116份已知的临床样品进行检测,结果与参比方法一致。本试验建立的方法可用于SVV和FMDV的鉴别检测,为塞内卡病毒病和口蹄疫的诊断提供依据。     

数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立

试验旨在利用新型荧光探针--分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）的H3和N2基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用数字RT-PCR技术检测H3N2亚型SIV。结果显示,该数字RT-PCR检测方法与其他主要相关病毒均不发生交叉反应,重复性良好;对猪H3N2流感病毒而言,最低可检测到10⁶倍稀释的病毒株。数字RT-PCR方法能够对RNA模板定量分析。在H3N2 SIV的鉴定上,数字RT-PCR方法较实时荧光定量PCR方法更灵敏、准确。     

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为同时检测猪源临床样本中的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV),基于这两种病毒的5'UTR序列设计特异引物和TaqMan探针,建立了一种检测CSFV和BVDV的双重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、最低检出限和重复性等进行了评价。结果显示,该方法只对CSFV和BVDV呈现特异性扩增,对猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,对阳性标准对照CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA和BVDV-2-5'UTR-RNA,最低可分别检出27、36和32拷贝/μL。该方法的组内和组间试验Ct值变异系数介于0.11%～1.20%,具有良好的重现性。对152份猪组织样本用该方法进行CSFV和BVDV核酸检测,结果检出CSFV阳性样本16份,BVDV阳性样本3份,CSFV和BVDV双阳性样本1份,与国标和OIE《陆生动物诊断试验和疫苗》相应的荧光RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重荧光RT-PCR方法可用于临床样本中的CSFV和BVDV检测,从而为猪瘟防制和净化提供了一种有效的技术手段。