内蒙古羊源细粒棘球蚴Eg95基因原核表达及蛋白鉴定

在克隆内蒙古羊源细粒棘球蚴疫苗候选基因Eg95的基础上,构建原核表达载体pET-Eg95并转化E.coli BL21(DE3),优化表达体系,获得Eg95纯化蛋白.将Eg95基因从克隆质粒pMD19-T-Eg95亚克隆到原核表达载体pET44a(+)上,构建原核表达载体pET-Eg95,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,优化表达条件.纯化的 Eg95 融合蛋白经 SDS-PAGE和Western Blot鉴定其正确性和免疫学活性.原核表达载体pET-Eg95在大肠杆菌中高效表达,优化的原核表达条件为:当菌液OD600值为0.6时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,37℃,振荡培养5 h.纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定为目的蛋白并具有生物学活性.原核表达载体pET-Eg95构建正确并可高效表达可溶性Nus-Eg95融合蛋白,可作为特异性抗原应用于免疫印迹法检测血清抗体.     

鸭病毒性肝炎间接血凝诊断抗原的制备

【研究目的】建立一种便于检测鸭病毒性肝炎抗体的方法。【研究方法】将纯化的鸭病毒性肝炎I型病毒(DHV-I)致敏双醛化红细胞,制备检测DHV抗体的间接血凝诊断抗原。【研究结果】使用该抗原对9种常见的禽传染病阳性血清、15只随机抽样的非免疫鸭血清进行检测,抗体均为阴性;检测被鸭病毒性肝炎I型病毒阻断后的阳性血清,抗体为阴性;用不同批次的诊断抗原检测同一血清样品结果显示一致;敏感性是琼脂扩散试验的32～64倍;对15只随机抽样的免疫鸭进行检测,阳性率达93%。【结论】该方法敏感性较高、特异性强、重复性好,可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及鸭病毒性肝炎的流行病学调查。     

人工合成氯霉素抗原免疫血清效价的比较及多克隆抗体的制备

【研究目的】人工合成氯霉素抗原及氯霉素多克隆抗体的制备,比较氯霉素人工抗原免疫血清效价。【方法】采用重氮化法,分别以BSA、OVA为载体蛋白合成CAP-BSA,CAP-OVA两种完全抗原,并对两种合成抗原的免疫效果进行比较。分别以这两种抗原作为免疫抗原用弗氏佐剂乳化后免疫新西兰大白兔,免疫四次后,心脏采血,分离血清,再用两种抗原分别作为包被原对兔血清进行间接竞争ELISA分析。【结果】大白兔经免疫后产生了抗氯霉素特异性抗体,两种抗原得到的抗体效价均达到1:8100,氯霉素最低检出限为9ng/mL。【结论】综合比较认为,CAP-OVA作为免疫原,CAP-BSA用作包被原是比较理想的实验方案,可用于制备氯霉素抗体和研制生产氯霉素酶联免疫试剂盒。     

香蕉果实凝集素基因的克隆及原核表达

【研究目的】植物凝集素具有重要的生理功能,通过原核表达香蕉凝集素基因(BanLec)并探讨其功能具有重要意义。【方法】提取了巴西蕉果肉总RNA,利用RT-PCR方法扩增BanLec cDNA 全长序列,并对该序列进行分析。将BanLec克隆至表达载体pET-30a,并将筛选到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达。【结果】克隆到的BanLec cDNA 序列为460bp,开放读码框为426bp,编码142个氨基酸。与其它已知的香蕉凝集素基因相比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94%和93%以上。SDS-PAGE 分析结果表明,经IPTG诱导,BanLec基因以融合蛋白形式表达,相对分子量约为20kD。【结论】该研究为探讨香蕉凝集素的活性及生化功能等奠定基础。     

猪附红细胞体ORF4蛋白的空间结构与B细胞抗原表位预测

为了预测猪附红细胞体(Mycoplasma suis)ORF4蛋白的空间结构和B细胞抗原表位。选择Genebank序列号AJ504999中ORF4基因,应用生物信息软件和互联网在线程序分析ORF4的氨基酸序列预测二级结构、三级结构、亲水性、柔韧性、抗原指数及表面可及性。结果表明：ORF4蛋白二级结构没有α-螺旋,其中柔性结构以β-转角为主,潜在的优势B细胞抗原表位区段主要分布在28~34,54~61氨基酸区段。本研究预测了ORF4蛋白空间结构和B细胞抗原表位,为猪附红细胞体表位疫苗的设计研发提供了指导意义。     

C型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1基因的原核表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pET-28α(+)中,获得融合表达质粒pET-P1,转化E.coli.BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-P1获得融合表达, Western Blot 检测证实表达的融合蛋白具有免疫活性,表达产物主要以包涵体的形式存在,进一步采用纯化试剂盒纯化P1蛋白做为诊断抗原.     

猪Musclin基因片段克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析猪musclin基因；【方法】肌肉组织提取总RNA，利用设计的引物进行RT-PCR，PCR产物与pMD19-T连接后转化E. coli DH5α，检测阳性克隆并测序；【结果】克隆的猪musclin基因片段与人、大鼠、小鼠同源性分别为86%、78%、75%，预测的氨基酸序列含有“KKKR”结构和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域；【结论】克隆了猪musclin基因片段并注册GenBank (Accession.EF369511)。     

副猪嗜血杆菌间接血凝诊断液的制备

【目的】建立一种便于检测副猪嗜血杆菌抗体的方法。【方法】将分离纯化的副猪嗜血杆菌5型超声裂解后,致敏双醛处理的健康绵羊红细胞,制成副猪嗜血杆菌5型间接血凝诊断液,检测该诊断液的活力及特异性。【结果】该诊断液特异性强,仅与副猪嗜血杆菌5型阳性血清发生凝集反应。活力也比较高,达到1:512以上,可以用其进行副猪嗜血杆菌疫苗免疫后抗体检测。【结论】该间接血凝诊断液成功制备为广大兽医化验人员提供一种简单、快速、经济的检测副猪嗜血杆菌抗体的方法,为副猪嗜血杆菌病的诊断和防治提供一种有效的手段     

烟蚜茧蜂畸形细胞对寄主生理代谢的调控

【研究目的】研究畸形细胞对寄主蚜虫的生理生化的影响及其自身的发展变化。【方法】分别采用Folin-酚法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法、薄层层析法和索氏抽提法测定寄生和未寄生寄主血淋巴的蛋白质含量、蛋白质组成、糖类含量和脂肪含量变化。【结果】寄生寄主与未寄生寄主相比,生理代谢受到抑制。血淋巴蛋白和甘油酯含量随日龄逐渐增加到第3天达最大后下降,而糖含量逐渐降低,分析是畸形细胞分泌和合成的结果。同时,经SDS-PAGE电泳显示,血淋巴中新出现15.9kDa和51.1kDa两种特异的蛋白质。【结论】通过对寄主血淋巴主要成分的分析,烟蚜茧蜂畸形细胞对寄主的发育起着重要的调控作用。     

宁夏枸杞中蛋白质的提取与鉴定

采用盐溶法提取宁夏枸杞中蛋白质,用饱和(NH4)2 SO4溶液进行分级盐析、透析、浓缩后用SDS-PAGE分析,测定不同提取液中主要蛋白质的分子量.结果表明:用pH为6.0的PB缓冲液提取,用饱和度为80％的(NH4)2SO4盐析时,枸杞蛋白的提取效果最好;经SDS-PAGE电泳后,初步鉴定出7种主要蛋白质,其中分子量为63 096 Da、51 286 Da、33 884Da的蛋白质提取范围较大.     

大豆离体成熟子叶不定芽分化的某些生理生化特性

大豆成熟子叶外植体，培养在附加２．０ｍｇ／ＬＢＡ的ＭＳ培养基上，诱导不定芽的发生，培养１０天后分化出不定芽，３０天后长出无根小苗。在不定芽发生过程中，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明，１９ｋＤ、３６ｋＤ、４８ｋＤ和７２ｋＤ４条蛋白质条带在培养第５天时消失，培养第４天后出现２５ｋＤ和２７ｋＤ新条带，第５天又出现３２ｋＤ和３３．８ｋＤ新条带，同时，５５ｋＤ蛋白质含量明显增加（条带由浅变深），８２ｋＤ和低于１     

成熟期番茄果实cDNA文库的构建及SlHSP17.7互作蛋白的筛选

植物小分子热激蛋白(small heat shock proteins, s HSPs)是一种多样、古老的蛋白家族,分子量大小普遍在12~42 k D之间,包含典型的C端、N端和α晶状体蛋白域。s HSPs作为一种重要的分子伴侣在植物生长发育和响应逆境胁迫中起着重要的作用。本研究通过构建成熟期番茄果实cDNA文库,筛选与SlHSP17.7互作的蛋白,进而探索SlHSP17.7在果实发育进程中的分子机制。以Micro-Tom番茄绿熟期、转色期和完熟期果实cDNA为模板,构建番茄果实c DNA文库。构建pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体筛选与其互作的蛋白,利用酵母双杂交实验验证互作关系。经检测番茄果实cDNA文库库容是2.2×10~6CFU,工作液细胞密度是3.6×10~7cell/mL,均一化程度>106,结果符合质控要求。将pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体转化Y2HGold酵母菌株检测发现,其无毒性和自激活现象,经筛选c DNA文库、测序及序列比对分析得到钙阳离子交换体SlCCX1-like蛋白,利用酵母双杂交实验验证发现二者存在互作关系。经PCR鉴定后,所建文库质量良好,文库的库容和文库滴度均符合建库要求,用pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体筛选得到互作蛋白SlCCX1-like,为进一步研究在果实发育进程SlHSP17.7的生物学功能提供了保障。     

杜氏盐藻MAPKK激酶基因DsMAPKKK的克隆、原核表达与纯化

为了进一步研究MAPKK激酶的生理功能,利用RT-PCR技术扩增了DsMAPKKK的开放阅读框序列,并利用T4连接酶与质粒pGS21a连接,构建了原核表达载体pGS21a-DsMAPKKK。将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导成功表达了融合蛋白。经SDS-PAGE检测,融合蛋白在上清和包涵体中均存在。可溶性蛋白经过GST柱纯化,电泳分析结果表明,在68kD左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在68kD左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白就是带有GST标签的MAPKK激酶。DsMAPKKK的成功表达与纯化,为深入探讨DsMAPKK激酶的性质及功能打下了坚实的基础。     

低温胁迫对香椿幼苗蛋白质含量及特异蛋白表达的影响

摘要： 以抗寒性强弱不同的河南西峡、江苏南京和福建霞浦3个种源1a生香椿为材料,研究了不同低温处理条件下可溶性蛋白质含量及组分的变化。结果表明,低温胁迫可以引起香椿叶片蛋白质含量的变化,但不同种源在不同温度下的表现不一致,同一种源在不同胁迫时间下的动态变化也不一致。SDS-PAGE电泳结果显示,抗寒性较强的河南西峡、江苏南京种源变化规律相似,在-5℃低温胁迫1～4d过程中,可溶性蛋白质含量呈现“升高-降低-再升高”的变化趋势,即胁迫1d后蛋白质即大量表达,谱带颜色变深,随后在第2、3天含量逐 渐下降,谱带变浅,第4天含量又开始增加。两种源分别诱导表达出分子量为27.6 KD、22.5 KD的特异蛋白。抗寒性较弱的福建霞浦种源可溶性蛋白质含量呈逐渐增加的趋势,但没有诱导出新的蛋白质谱带。各种源SDS-PAGE电泳结果显示的蛋白质谱带颜色的深浅变化与蛋白质含量变化基本一致。     

双向电泳联用质谱技术研究棉苗对细极链格孢菌蛋白激发子诱导的应答

 采用双向电泳和质谱技术分析了细极链格孢菌蛋白激发子对棉苗诱导的全蛋白质组,建立二者间的差异表达图谱,并对差异蛋白进行了鉴定及分析归类。结果表明,蛋白质分子质量在10～100 kD之间、等电点3～10范围内,每块胶分离到约600个蛋白质点。得到了大约53个差异蛋白点,其中有31个为上调蛋白,22个为下调蛋白。对PEAT诱导后表达量明显增加的 7个上调蛋白点用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行肽质量指纹谱的分析,并通过检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测,获得了4个蛋白的肽质量指纹图谱,经数据库检索鉴定分析,GH-1、GH-3、GH-6推测为核酮糖1,5-二磷酸羧化酶基因家簇,GH-7推测为-S-腺苷一蛋氨酸合成酶。     

犬瘟热病毒Lederle株H,N全基因序列分析及表达研究

采用RT-PCR方法自犬瘟热病毒Lederle株基因组RNA中扩增出H基因(1 911 bp)和N基因(1 707 bp)片段,序列测定和分析表明与Onderstepoort株、CDV3株等疫苗毒株的同源性在95%以上,而与野外分离株的同源性介于90%～95%;以获得的H,N全基因片段为模板,分别扩增H基因近3′端996 bp的基因片段以及N基因中间高度保守区562 bp的基因片段,经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达,结果显示H片段和N片段分别表达大小约为57 kD和37 kD的融合蛋白,Western blotting检测结果显示,表达蛋白均可与CDV抗血清发生阳性反应,提示原核表达产物具有与CDV抗血清结合的免疫反应性。     

小麦TaSIM蛋白的原核表达与纯化及Western blotting检测

为了获得TaSIM(Salinity-induced R2R3-MYB)基因的纯化蛋白,以便研究TaSIM转录因子的DNA结合特异性.本研究以含有pET28a-TaSIM原核表达载体的大肠杆菌BL21为材料,用0.5 mmol/L IPTG,在37 ℃诱导TaSIM融合蛋白表达2 h,收集上清液,采用Ni-NTA柱纯化...     

不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒S蛋白和猪流行性腹泻病毒S蛋白免疫原性的影响

本研究旨在探究不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白和猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白免疫原性的影响。IPGT诱导重组表达菌株Rosetta(DE3)-pET28a-TGEV-S2/3和BL21(DE3)-pET28a-PEDV-S1/2/3,制备重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,将重组蛋白等量混匀分别与3种佐剂ISA 71VG、ISA 201VG和ISA 15AVG进行乳化制备免疫原免疫蛋鸡;Western blot检测蛋鸡血清抗体效价,免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体与病原的反应活性;监测鸡群平均日增重。结果显示,重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3的分子量依次为25 ku、28 ku、26 ku、24 ku和21 ku。Western blot分析显示,5种蛋白均具有良好的免疫原性;疫苗二次免疫后7天抗体效价达到高峰,ISA 201VG佐剂组、ISA 71VG佐剂和ISA 15AVG佐剂组组最高抗体效价依次为64000倍、32000倍和8000倍,对照组未检测到特异性抗体;ISA 71VG和ISA 201VG组对产蛋率下降相对较大,ISA15AVG 佐剂疫苗免疫组对产蛋率影响相对较小,免疫后7天后试验组产蛋率恢复正常。ISA 71VG佐剂组蛋鸡平均日增重显著降低,ISA 201VG和ISA 15AVG佐剂组蛋鸡平均日增重与对照组无显著差异;ISA 201VG佐剂组血清抗体与病毒反应活性良好,中和效价可达1:256。ISA 201VG佐剂配伍的疫苗免疫效果优于其他两种佐剂疫苗。     

薏米蛋白提取及其SDS-PAGE电泳分析

为了提高薏米蛋白的提取得率,确定提取pH、料液比、提取温度、提取时间对蛋白提取率的影响,进一步得到薏米蛋白SDS-PAGE电泳图谱。采用碱法提取薏米蛋白,通过响应面回归分析,得到碱法提取薏米蛋白的优化工艺条件并且进行SDS-PAGE凝胶电泳分析薏米蛋白电泳图谱。结果表明,碱法提取薏米蛋白的优化工艺条件为料液比为1:11.8,提取时间4.93 h,提取温度为35℃,提取pH 10.47。在最优条件下,薏米蛋白提取率达到43.94%。薏米蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分析,薏米蛋白电泳图谱共分离出2条蛋白亚基条带,较大薏米蛋白亚基分子量143 kD,较小薏米蛋白亚基分子量为85 kD。通过响应面碱法提取薏米蛋白,提取率明显提高,采用SDS-PAGE法对薏米蛋白进行分析,为构建薏米蛋白质指纹图谱提供理论依据。