鸡白细胞介素18基因的克隆与原核表达

白介素18(IL-18)最早被称为干扰素诱导因子(interferon-γ-inducing factor,IGIF),是近年发现的一种重要的免疫调节因子。该实验根据Gen Bank中已公布的鸡IL-18的基因序列,设计并合成了一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出IL-18基因,并将该基因克隆到p MD18-T载体中,经过质粒酶切、PCR和测序鉴定,阳性克隆命名为Chp MD18-T-IL-18。将Chp MD18-T-IL-18双酶切后与p ET32a表达载体连接,转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达鸡IL-18蛋白,结果表明,在28k D左右出现了目的条带,经west-ern blot检测确定该蛋白获得高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

鸡白细胞介素-18在鸡球虫病疫苗免疫中的作用

为了探索鸡白细胞介素-18(IL-18)在鸡球虫病疫苗免疫中的免疫佐剂作用,用鸡IL-18的重组真核表达质粒pIL-l8、柔嫩艾美耳球虫早熟株疫苗及两者联合分别接种3日龄鸡,首免后第1 d、4 d、6 d、9 d、14 d、21 d、26 d、28 d时随机抽取鸡外周血及无菌采取鸡脾脏,应用ELISA和甲基噻唑基四唑(MTT)法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平.二免后第14 d用柔嫩艾美耳球虫进行攻击.结果表明,pIL-18与鸡柔嫩艾美耳球虫早熟株疫苗联合免疫具有明显提高虫苗免疫保护的作用,pIL-18单独注射鸡体也具有明显增强鸡体抗球虫感染的作用.表明鸡IL-18能够明显增强鸡球虫病疫苗的免疫原性,显著提高免疫鸡的体液免疫和细胞免疫水平,并且能强有力地抵抗柔嫩艾美耳球虫的攻击.     

鸡白细胞介素18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR技术直接从罗曼鸡脾脏提取的总RNA中扩增鸡白细胞介素IS(ChlL-18)全基因,并克隆和测序得到序列基因全长为597 bp的ChIL-18.将ChIL-18成熟蛋白编码区(510 bp)定向插入到原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,构建重组表达质粒pGEX-ChIL-18,转化大肠杆菌B121(DE3),在IPTG诱导下可高效表达融合蛋白(GST-ChIL-18).SDS-PAGE可检测到分子质量约为46 kDa的GST-ChIL-18.Western blot证实GST-ChIL-18能与鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应.融合蛋白GST-ChIL-18经谷胱苷肽Seph-arose-4B亲和柱层析纯化后明显促进鸡T淋巴细胞转化,表明所表达的ChIL-18具有一定的生物活性.     

鸡白细胞介素18研究进展

鸡白细胞介素(IL-18)是一种新发现的细胞因子,其cDNA全长597 bp,编码198个氨基酸的前体多肽,分子量约为23 kDa,IL-18氨基端的29个氨基酸残基起胞内定位作用;鸡IL-18是IFN-γ诱生剂,通过IFN-γ发挥抗感染、促生长等作用,参与对微生物感染诱导产生细胞和体液免疫反应的初次免疫应答;鸡IL-18作为免疫佐剂,具有增强免疫和治疗作用,还具有抗肿瘤免疫作用。     

重组人白细胞介素18基因的克隆及序列测定

从正常人外周血液中提取RNA,然后反转录cDNA,应用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术,自行设计并合成一对特异性引物,成功地扩增出hIL-18cDNA基因,并定向插入PGEM-T载体中,对其进行酶切分析及序列测定.酶切分析表明一约481 bp的基因片断克隆至PGEM-T载体中,与理论设计的一致.测序结果表明克隆至PGEM-T中的IL-18cDNA包含成熟IL-18的全部编码序列,本研究结果将为今后hIL-18基因的表达及进一步在基因水平上探讨hIL-18的生物学功能提供物质基础.     

鸡α干扰素/白细胞介素18基因的融合表达及抗病毒活性研究

【目的】构建原核表达载体p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18、大肠埃希菌Escherichia coli表达及产物纯化与活性检测,研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂,以对鸡的病毒性疾病进行防治.【方法】采用融合PCR(Fusion PCR)方法,利用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸将鸡α干扰素(Chicken interferon alpha,Ch IFN-α)与鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,Ch IL-18)基因构建Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因并克隆入p ET-28a原核表达载体中进行原核表达.通过镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDSPAGE分析、Western-blot鉴定.采用细胞病变抑制法检测r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)及新城疫病毒(NDV)增殖活性.【结果和结论】成功构建并克隆了p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因.融合基因在大肠埃希菌中表达的r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白相对分子质量约为38 000,蛋白经纯化后纯度在90%以上.r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在鸡胚成纤维(CEF)细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和NDV的活性明显高于单一r Ch IFN-α、r Ch IL-18蛋白的抗病毒活性.     

海兰鸡白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR方法从用植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出海兰鸡白细胞介素18(IL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pGEM-T Easy Vector载体上, DNA序列测定表明, 克隆得到的海兰鸡ChIL-18 cDNA基因全序列包括终止密码子在内其编码区大小为510 bp,编码169个氨基酸多肽. 将该基因片段克隆到原核表达载体pQE30构建重组质粒pQE30-ChIL-18,转化大肠杆菌M15,并用IPTG 诱导. 重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为19 000的重组蛋白.     

固始鸡白细胞介素18全基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列,自行设计1对引物,应用RT-PCR技术,无需用非特异性免疫原如ConA,PHA等刺激分离的脾淋巴细胞,直接提取总RNA,扩增固始鸡IL-18基因,并进行克隆和测序.测序结果:获得了固始鸡IL-18基因全序列,其大小为597 bp;序列比较分析发现,克隆的固始鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列核苷酸同源性为99.8%,有1个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为99.5%;固始鸡与人和其他动物的LI-18基因序列分析和系统进化分析表明,IL-18基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.     

鸡白细胞介素18成熟蛋白的原核表达及抗体间接ELISA方法的建立

将鸡白细胞介素18的成熟蛋白(chicken interleukin 18 mature protein,mChIL-18)基因在原核系统表达,采用Ni-NTA亲和层析方法纯化得到该重组蛋白。纯化后重组蛋白包被反应板,通过方阵滴定确定最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数、羊抗鼠酶标二抗稀释倍数,建立检测ChIL-18成熟蛋白抗体的间接ELISA方法。经方阵滴定结果确定最佳抗原包被质量浓度为4μg/ml,阳性血清稀释比例为1∶104,羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释比例为1∶12 000,抗原抗体最佳结合时间是1.5 h,血清与二抗最适反应时间为1 h。阴性、阳性血清的判定标准为:被检样本的OD值是一组阴性样本OD值的2或3倍且OD450≥0.5,即为阳性,比值以P/N表示1,.5P/N2.0为可疑,P/N1.5为阴性。本试验结果证明该方法具有良好的稳定性、重复性和特异性,为下一步单抗的筛选鉴定奠定了必要的基础。     

犬白细胞介素-21基因的扩增和测序

无菌抽取犬外周血,分离单核细胞,经PHA刺激后收集细胞,使用Trizol提取细胞总RNA;利用自行设计的引物,反转录合成cDNA第1条链,PCR扩增出长约441 bp的白细胞介素-21(IL-21)基因带。经纯化回收,将基因克隆至pMD18-T,筛选阳性克隆测序证明扩增的cDNA的序列与已报道的序列相一致。     

鸡IL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫增强作用研究

    为进一步评价鸡IL-18的免疫增强作用,用鸡白细胞介素18(IL-18)的真核表达质粒(pCI-IL-18)与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫SPF鸡,14日龄时首免,2周后二免,二免后5周用IBDV标准强毒株BC6/85攻击.研究发现,鸡IL-18能显著促进T、B淋巴细胞的增殖反应,增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的中和抗体水平及其对强毒攻击的保护力.结果提示,鸡IL-18(200 μg)对IBDV多聚蛋白DNA疫苗具有显著的免疫增强作用(P＜0.05).     

鸡白细胞介素-2基因在Pichia methanolica酵母中的表达

鸡白细胞介素-2(chIL-2)是近年来新发现的一种禽类细胞因子.为建立用甲醇型酵母Pichia methanolica (P. methanolica)表达鸡白细胞介素-2基因(chIL-2)的新途径,将chIL-2基因插入到P. methanolica分泌型表达载体pMETαA构建了重组PMAD11表达菌株(pMETαA/rchIL-2).经SDS-PAGE、Western印迹测定,证实chIL-2基因在P. methanolica中表达成功,rchIL-2的分子量约为16 kDa,其表达量占分泌总蛋白的35%.     

鸡IL-18基因的克隆表达及对新城疫疫苗诱导的HI抗体变化的研究

通过RT-PCR方法从新城疫Ⅰ系疫苗诱导的11日龄鸡胚脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到ChIL-18全基因,其编码区大小为597bp,编码198个氨基酸多肽。将该基因片段克隆到原核表达载体pProEXTMHTb构建重组质粒pProEXTMHTb-ChIL-18转化大肠杆菌DH5α中,并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子量为28.6ku的重组蛋白。观察ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体动态变化。结果表明,同时接种ChIL-18蛋白和活疫苗的免疫鸡在接种后,所产生的HI抗体效价高于PBS和活疫苗免疫组,并且,HI抗体效价在15d及热应激24h时表现差异显著(P<0.05)。表明ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体有增强作用。     

我国集约化家禽养殖中鸡白细胞介素-2 的应用前景分析

鸡白细胞介素-2(IL-2)是由激活的T细胞分泌产生的糖蛋白,具有显著的免疫增强作用,不仅在T、B细胞的生长与分化和NK细胞的激活等方面发挥重要作用,而且与其他细胞因子一起发挥免疫功能,是一种能影响机体免疫反应各个方面的调节因子,因而在疾病的治疗上发挥着重要作用。我国集约化家禽养殖集现代遗传育种、饲料饲养、疾病防疫、环境控制等先进技术于一体,鸡IL-2的应用可实现有效的组装配套与综合利用。     

鸡白细胞介素2原核表达及多克隆抗体的制备

鸡白细胞介素2(IL-2)是一种在机体免疫调节中具有多种功能的细胞因子.本研究将萧山鸡白细胞介素2基因克隆入原核表达载体pET-28b,获得了重组表达载体pET-28b-IL-2,将此重组表达载体转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达萧山鸡IL-2.SDS-PAGE结果表明,萧山鸡IL-2在大肠杆菌中得到了表达,以此表达产物制成油乳剂苗免疫家兔,用ELISA和Western blotting检测兔血中的多克隆抗体,结果均为阳性.因而为进一步开展鸡IL-2的结构和功能研究奠定了基础.     

罗曼鸡白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

应用RT-PCR技术从罗曼鸡脾淋巴细胞RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序。结果表明,获得了ChIL-18全序列,其大小为597 bp。将其成熟蛋白基因(510 bp)亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量为约46 kDa的融合蛋白,Western blot证实该融合蛋白可与鼠抗鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。用MTT法测定表明,重组蛋白能明显促进鸡T细胞转化的活性。     

IL-18对人近端肾小管上皮细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨白细胞介素18(IL-18)对肾小管上皮细胞增殖及凋亡的作用以进一步明确其在慢性肾病进展中的作用。方法在体外实验中应用不同质量浓度(0.1、1、10、100 mg/L)的IL-18分别处理人类近端肾小管上皮细胞株(HK-2)24、36、48、72h,应用改良的MTT法检测细胞增殖,应用Hoechst33258染色法检测细胞凋亡。结果同一质量浓度不同作用时间,随时间的延长其光吸收值(A值)增加,两两比较差异有统计学意义(均P<0.05);同一作用时间不同质量浓度时的A值,各组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);IL-18作用24、36、48h随时间增加凋亡百分数与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),IL-18作用72h细胞凋亡明显增多,且随质量浓度增加而增加,凋亡百分数与对照组相比差异有统计学义(P<0.01)。结论慢性肾病状态下IL-18可能具有促进肾小管萎缩以至丢失的作用。     

NDVF基因真核表达质粒的构建及其与鸡IL-18基因联合免疫的初步研究*

 为了探索鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白的免疫原性及鸡白细胞介素-18(IL-18)的免疫增强作用,通过PCR和酶切方法将NDV F基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA-F。用质粒pcDNA-F单独或与鸡IL-18重组真核表达质粒pIL-18联合免疫14日龄SPF鸡。首免后每周采取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第14 d用NDV强毒F48E9株进行攻击。结果表明,质粒pcDNA-F与pIL-18联合免疫显著提高鸡体的细胞免疫水平,并且提供了50%免疫保护,这为ND的防治开辟了新的途径。     

重组鸡白细胞介素-7在HEK293T细胞中的表达及其条件分析

为提高重组鸡白细胞介素-7(chIL-7)在真核细胞中的表达水平,本试验分析了影响基因表达的一些因素,包括转染方法、质粒用量、转染时间及表达时间等,对重组chIL-7表达水平的影响,并通过正交试验设计方法确定了利用HEK293T细胞表达重组chIL-7的最适表达条件。结果表明,在T75细胞瓶中,由脂质体介导使用30μg质粒,转染4h,表达48h和由磷酸钙介导使用40μg质粒,转染6h,表达60h可以获得较高的表达效率,表达水平分别为(124±9)和(94.3±8)μg/106个细胞。本结果为进一步研究chIL-7的功能提供有利条件。