人CD46基因启动子的克隆和启动特性研究

为研究人CD46(hCD46)基因启动子的启动特性,研制具有hCD46组织特异性表达特征的转基因小鼠,设计扩增hCD46基因启动子的PCR引物,用HeLa细胞基因组DNA为模板扩增hCD46基因启动子DNA片段,测序结果表明:其序列与GenBank中hCD46完整基因5′端某片段的同源性高达99.9%。用此DNA片段替换表达载体pcD-NA3EGFP中的CMV启动子,且在该片段与EGFP基因之间插入兔β-球蛋白基因的第2内含子RGI。重构的表达载体在2种鼠源细胞CHO和SP2/0中均可启动EGFP表达,表达量与人体内同源组织中hCD46的相似,说明该研究克隆了结构和功能正确的hCD46基因启动子。     

piggyBac转座子介导的牛A-FABP表达载体的构建与鉴定

【目的】构建以piggyBac(PB)转座子为载体元件,绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,Neomycin(NEO)为抗性基因,alpha-肌动蛋白(α-actin)为启动子的A-FABP基因特异性表达载体pPB-AFABP,并验证其转座活性。【方法】通过PCR方法合成PB转座子骨架序列、NEO-EGFP、α-actin启动子以及A-FABP基因序列,并将各个序列连接构建成转基因载体pPB-AFABP;用脂质体法将供体质粒pPB-AFABP和辅助质粒pCAG-PBase组成的PB二元系统及质粒pPB-AFABP分别转染牛成纤维细胞,通过G418筛选得到转基因细胞。【结果】经过酶切和测序鉴定,载体pPB-AFABP构建正确;PB二元系统的阳性克隆数明显多于转座子载体pPB-AFABP的克隆数;PCR鉴定结果表明,牛成纤维细胞中存在目的基因A-FABP。【结论】成功构建了转基因表达载体pPB-AFABP,且证实PB转座子在牛成纤维细胞中具有较高的转座活性。     

家蚕丝腺生物反应器表达狂犬病病毒核蛋白

【目的】采用家蚕丝腺生物反应器这一蛋白高效表达系统,尝试建立一种高效、低廉、稳定生产狂犬病病毒核蛋白（RVNP）的技术体系,为生产基因工程疫苗奠定基础。【方法】通过RT-PCR方法克隆获得RVNP序列,采用家蚕丝胶蛋白基因（Ser1）启动子为特异性启动子,将RVNP构建到含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）筛选标记基因的piggyBac转座子表达载体（pBA3EGFP）中,并采用显微注射转基因家蚕技术构建家蚕丝腺生物反应器。【结果】G1代通过EGFP标记的筛选获得转基因家蚕阳性蛾区26个,蛾圈阳性率为59.09%。PCR实验证实RVNP已经整合到家蚕基因组中,Western blot分析表明RVNP蛋白可能附着于丝胶蛋白并随家蚕吐丝行为分泌到蚕茧中。【结论】获得了能够表达外源的RVNP蛋白的转基因家蚕品系,该系统有望成为高效、低廉、稳定地生产狂犬病基因工程疫苗的技术体系之一。     

含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒Fa株重组猪细小病毒VP2基因表达载体的构建

分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和KpnⅠ酶切含PRVFa株gI片段的质粒pPI,补平连接后得到去除EcoRⅠ、HindⅢ、EcoRⅤ、BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点的大小约5.7kb的质粒pPI-2,再以CMV早期启动子控制的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因,将其插入pPI-2中gI基因起始密码子ATG下游的StuⅠ位点,构建了以gI为同源序列含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP。然后根据AnaI.Ranz等报道的猪细小病毒(PPV)NADL-2株的序列,设计一对包含其结构蛋白VP2基因的PCR引物,扩增得到VP2基因后,将其插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,首次构建了含PPVVP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2.EGFP.VP2,为进一步构建PRV重组PPVVP2基因活载体疫苗奠定了基础,同时EGFP的引入也为进一步研究PRV在机体内的定植和感染机理打下了基础。     

家蚕中肠特异启动子BmAPN的克隆及活性分析

【目的】克隆和鉴定1个家蚕中肠特异启动子,为研究家蚕的免疫应答和应用研究提供新的工具。【方法】从家蚕品种大造中提取基因组总DNA,用PCR方法克隆家蚕中肠特异表达基因BmAPN（GenBank登录号：BAA33715.1）的上游调控序列。利用此序列构建以EGFP为报告基因的转基因表达载体pBac[BmAPN-EGFP-SV40,3×P3-DsRed],通过显微注射获得转基因家蚕,在个体水平上检测启动子的活性。【结果】所克隆的BmAPN启动子长度为1 598 bp,其驱动的EGFP仅在转基因家蚕中肠特异表达,与内源基因BmAPN的表达特征一致。该启动子在家蚕幼虫时期活性相对较高,且在起蚕期的活性要明显高于眠蚕期,推测该启动子中的特异元件受激素调控。【结论】经克隆获得的BmAPN启动子为有活性的启动子,且为家蚕中肠特异启动子。     

水稻OsN1基因5’端启动子不同区域序列分析

为了研究水稻OsN1基因启动子(OsN1p)的表达调控机理,用OsN1基因ATG(ATG中的A为0)上游-1 089 bp、-881 bp、-489 bp和-245 bp的启动子序列分别取代pBI121中的35S启动子,构建植物表达载体pBIN1.1p、pBIN0.9p、pBIN0.5p和pBIN0.2p。将这些表达载体经农杆菌介导转化水稻日本晴,获得转基因植株。对启动子的表达特点和启动活性进行了分析,结果表明,由-1 089 bp启动子、-881 bp启动子和-489 bp启动子驱动的gus基因能在愈伤组织中表达,-245 bp启动子不能驱动gus基因在愈伤组织中表达,说明启动子OsN1p具有启动活性的最小启动序列为ATG上游的-489 bp;-489 bp启动子驱动的gus基因在转基因植株根中表达,在根冠不表达;用5 mmol/L水杨酸(SA)喷施转基因植株叶片后,GUS定量分析结果表明转基因植株的GUS活性增高,转-881bp启动子植株的GUS活性比转-1 089 bp启动子植株的活性高。可见,启动子OsN1p具有组织特异性表达和受SA诱导表达的特性。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

不同启动子驱动下GL6基因表达对水稻叶表皮毛发育的影响

【目的】研究水稻茸毛发育机制及相关基因的功能与调控模式,为深入研究相关基因功能及其在生产上的应用提供理论支撑。【方法】从不同水稻品种中克隆叶片表皮毛发育相关基因GL6的启动子序列,并将具有显著表皮毛特征的突变体品种75-1-127的GL6基因启动子与叶表无显著表皮毛特征的野生型品种相应基因的启动子序列进行比对,同时克隆突变体品种75-1-127中GL6基因的CDS序列,并分别构建以玉米泛素蛋白Ubiquitin和花椰菜花叶病毒CaMV35S为启动子驱动的过表达载体,以农杆菌介导的方法转化野生型粳稻品种Kitaake。【结果】不同品种中克隆的启动子序列区存在显著的序列差异,以玉米泛素蛋白Ubiquitin启动子驱动的过表达载体获得的转基因水稻出现了显著的表皮毛特征,以花椰菜花叶病毒CaMV35S为启动子驱动的过表达载体的转基因水稻则未出现典型的表皮毛特征。【结论】目标基因GL6的表达调控受启动子的影响,突变体品种75-1-127的叶表皮毛发育特征是因启动子区序列差异所致。     

辣椒水通道蛋白基因CaTIP1-1启动子的克隆及序列分析

利用巢式PCR技术分离获得CaTIP1-1基因上游1749 bp的片段.利用PlantCARE软件预测发现该序列含有启动子典型的基本元件TATA-box、CAAT-box及非生物胁迫相关的元件和光应答元件.以PBI121载体为基础,构建CaTIP1-1启动子驱动下绿色荧光蛋白GFP报告基因植物表达载体.利用叶盘法转化烟草获得转基因植株,通过荧光显微镜能够检测到T1代烟草悬浮细胞系能够稳定表达荧光.结果表明该启动子具有驱动绿色荧光蛋白表达的活性.该研究为今后CaTIP1-1启动子在植物基因工程育种中的应用奠定基础.     

内蒙古白绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体的构建及胎儿成纤维细胞的稳定转染

 【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164（vascular endothelial growth factor 164,VEGF164）基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV（6.3 kb）。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。     

人α干扰素转基因小鼠模型的建立

[目的]建立人α干扰素（interferon-α,IFN-α）转基因小鼠,为研究IFN-α在抗病毒中的作用提供模型动物。[方法]将人IFN-α基因插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过原核显微注射法建立IFN-α转基因小鼠。[结果]通过特异性引物PCR法和South-ern杂交法检测出4只阳性转基因小鼠。分离4个转基因鼠系F1代PCR阳性小鼠血液中的淋巴细胞进行RT-PCR检测,其中3个鼠系为阳性。收集阳性小鼠血清,用ELISA方法和微量板染色测定法检测出3个转基因鼠系均有IFN-α表达。[结论]成功建立了CMV启动子启动的表达人IFN-α基因转基因小鼠,为研究干扰素抗病毒机制及对其他动物进行抗病毒感染基因工程育种研究奠定了基础。     

慢病毒生产卵泡抑素转基因绵阳PCR检测方法的建立(英文)

[目的]建立稳定快速的慢病毒转基因羊DNA水平检测方法。[方法]采集初生转基因羔羊的子叶、脐带、尾组织以及死亡羔羊的全身各组织,提取基因组DNA作为模板进行PCR检测,以Follistatin基因N+D1片段特异性引物进行PCR检测;同时,对慢病毒载体的CMV启动子、5’-LTR等结构元件进行PCR检测;提取死亡羔羊的全身组织以及转基因羔羊的活体肌肉组织总RNA,进行RTPCR检测。[结果]采用试剂盒提取的基因组DNA比常规方法提取的DNA快速、高效,且更易被检测,扩增时的引物采用载体上游与目标基因下游的组合大大增加了检测的特异性,避免了内源性目标基因的干扰而造成假阳性;初生转基因羔羊的尾组织可作为PCR检测的组织样品,其结果可靠、准确;对CMV启动子及5’-LTR等结构元件作PCR检测为转基因动物的安全性考察提供了数据,同时验证了转基因羔羊目的基因的检测结果;对转基因羔羊肌肉组织提取总RNA后进行RT-PCR检测,其中有3只羔羊没有检测到转录产物,其他均有转录。[结论]该研究建立的转基因绵羊PCR检测方法高效、快速且准确,为进一步蛋白水平检测提供试验依据,也为建立转基因绵羊系统性多层次的检测方法奠定基础,还为转基因绵羊的安全监测提供了稳定的技术平台。     

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞 #br#

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定

[目的]研究靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定：[方法]设计并人工合成靶向PRRSV核蛋白N基因的3个siRNA靶序列,将其插入CMV启动子下游,克隆到真核表达载体pSilencer4．1-CMV中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序。[结果]成功构建了靶向核蛋白基因表达的siRNA干扰重组质粒载体pSilencer—N。[结论]该研究为进一步运用RNA干扰技术进行PRRSV防治研究奠定了基础。     

番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究

在ＴＭＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因的５′和３′端分别合成寡聚核苷酸引物Ｐ１和Ｐ２，并分别引入ＣｌａＩ和ＢａｍＨＩ位点，采用ＰＣＲ技术扩增ＴＭＶＣＰ基因，用ＣｌａＩＢａｍＨＩ消化后重组到ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中，并将该基因与ＣＭＶＣＰ基因重组在同一个表达载体ｐＥ３上获得双价ＣＰ基因表达载体ｐＥＴＣ２，转化番茄，获得再生植株。通过点杂交、ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证实２、１２和１３号为转ＴＭＶ和ＣＭＶＣＰ基因的工程植株。工程植株在温室中表现正常，比对照植株表现出明显的抗性。     

Effect of the Antisense BcMF12 Driven by the BcA9 Promoter on Gene Silencing in Brassica campestris L. ssp. chinensis

The study analyzed the silencing of BcMF12 gene regulated by BcA9 promoter in the transgenic pakchoi and confirmed the effect of antisense BcMF12 gene on the pollen development. A conserved BcMF12 gene fragment was amplified from the cDNA of flower buds in pakchoi (Brassica campestris L. ssp. chinensis, syn. B. rapa L. ssp. chinensis) and was fused to the anther specific BcA9 promoter. The plant antisense expression vector was constructed and then introduced into pakchoi via Agrobacterium-mediated transformation. The transgenic plants were screened by antibiotics and molecular analysis. PCR and Southern blot revealed that the antisense BcMF12-GUS fusion gene regulated by BcA9 promoter was integrated into transgenic plants. Northern blot suggested that the expression of BcMF12 gene was down-regulated significantly. The pollen germination rate of transgenic plants with antisense BcMF12 gene decreased as compared with that of the control plants. The expression of the gene BcMF12 related to the pollen development was inhibited by the antisense BcMF12 driven by BcA9 promoter, which consequently affected the pollen development in pakchoi.