沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的研究

为获得抗旱性较强的转基因苜蓿植株,以紫花苜蓿品种中苜2号作为基因转化受体,通过对外植体选择、菌液浓度、选择压确定、侵染时间和共培养时间等因素进行优化,成功建立了农杆菌介导的遗传转化体系。在此基础上,将沙冬青脱水素基因通过农杆菌的介导,转化到中苜2号中。试验结果显示,子叶和下胚轴作为外植体愈伤组织诱导频率最高,可达100%;获得抗性愈伤组织与转基因植株的卡那霉素最佳筛选浓度为25 mg/L;外植体与农杆菌的共培养时间以5 d为最佳。试验共获得126株T0抗性株,PCR检测30株表现为阳性,表明脱水素基因已转入受体植株中。     

农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究

以东北春玉米自交系7922、340、78599、921及美国杂交种H99等幼胚愈伤组织为受体,利用农杆菌介导法转化Bt(CryIA.)基因,研究菌液预处理、愈伤组织状态、侵染培养基、侵染时间及共培养条件等因素对转化频率的影响。根据转化愈伤组织的除草剂(Basta)抗性筛选结果评估转化率,表明继代培养3￣5d的愈伤组织适于转化,其中以继代5d的7922愈伤组织转化率最高,为46.6%;不同基因型对农杆菌转化率存在差异,H99的抗性愈伤组织率为34.57%,7922为26.27%、340为21.36%、78599和921抗性愈伤组织率仅为8.02%和6.78%。基因型间差异显著;浸染培养基中加入(AS100￣200mg/L)抗性愈伤转化率明显提高;菌液浓度OD6000.5￣0.6、侵染时间5￣10min、共培养时间3d最佳。     

农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化

本研究以普通小麦品种扬麦15和Alondra's的幼胚产生的愈伤组织为受体材料,通过检测gus基因的瞬时表达情况,研究了农杆菌介导的主要影响因子的转化效率。研究结果表明,在相同条件下两个品种农杆菌侵染的最佳条件不尽相同。扬麦15的最佳优化条件为:先在不添加AS的培养基中预培养,然后在菌液浓度为OD600=0.2、AS浓度为100μmol/L条件下侵染10min,最后在25℃共培养1d;Alondra's则在菌液浓度为OD600=0.5、共培养时间为2d时,表现出最佳的gus基因瞬时表达率。为小麦的遗传转化提供参考。     

影响农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LycB转化番茄主要因子的研究

LycB(番茄红素β-环化酶)基因是类胡萝卜素生物合成过程中关键酶之一,位于合成代谢的重要分支点上,直接影响β-胡萝卜素的合成.以番茄子叶、茎段作为转化受体,通过农杆菌介导法,利用LycB基因转化重要果菜两用作物番茄,对影响转化的几个因素进行了研究.结果表明,转化受体经预培养比未预培养有利于农杆菌的侵染转化;侵染时间子叶以10min、茎段以15min为宜;农杆菌菌液浓度OD600以0.7为佳;添加AS可提高抗性愈伤的诱导率,S的添加以100μmol/L效果较好;延迟筛选有利于提高抗性愈伤诱导率.     

农杆菌介导小麦成熟胚体系的优化

针对转基因小麦成熟胚转化体系转化效率低,从提高成熟胚愈伤组织质量入手,调节小麦的基因型、成熟胚的培养时间、菌液浓度、侵染时间以及愈伤组织大小几个因素,提高成熟胚转化体系的转化效率;通过农杆菌介导,将目的基因转入到受体小麦成熟胚诱导的愈伤中,利用gus检测的方法检验转化效率;继代360d、自然生长5mm大小的受体小麦品种扬麦10,在菌液浓度OD600为0.8,侵染40min下,gus基因表达率达50%左右,接近幼胚的gus基因表达率。通过对体系的几个因素的调节,提高了农杆菌介导成熟胚转化体系的效率。     

农杆菌介导玉米遗传转化体系的研究

为了提高玉米自交系的遗传转化率,建立农杆菌介导玉米遗传转化体系。通过农杆菌菌株EHA105侵染玉米自交系7922的胚性愈伤组织,以β-葡萄糖苷酶基因(GUS)为报告基因研究几种因素对遗传转化体系的影响。结果表明：（1）当农杆菌浓度OD600=0.6时,GUS瞬时表达率最高为35.3%;（2）当侵染时间为15 min时,GUS瞬时表达率最高为37.3%;（3）当共培养时间为3天和恢复培养时间为4天时,GUS瞬时表达率最高为29.1%。因此选择农杆菌浓度OD600=0.6,侵染时间15 min,共培养3天和恢复培养4天,为最佳遗传转化条件。通过优化影响遗传转化体系的因素,初步建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

小对叶植株再生及遗传转化体系构建

为了利用生物技术方法开发及改良水生植物小对叶,以小对叶（Bacopa monnieri）叶片为外植体,建立其组织培养再生体系及根癌农杆菌介导的遗传转化体系。结果表明：小对叶叶盘最佳愈伤组织诱导培养基是MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L;最佳分化培养基是MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L;最佳生根培养基是1/2MS+IBA 0.1 mg/L。最佳的根癌农杆菌介导的小对叶遗传转化条件是：外植体预培养2天,侵染菌液OD600为0.5,侵染时间7 min、共培养4天和延迟筛选4天,可获得最高转化率21.4%。     

农杆菌介导的地黄遗传转化体系的优化

旨在通过对农杆菌介导的地黄遗传转化体系影响因子的研究,探索最佳转化条件,为建立高效地黄遗传转化体系奠定基础。利用正交实验,通过检测地黄叶片中gus基因瞬时表达情况,对地黄遗传转化效率的决定因子进行了系统研究。正交试验表明,地黄遗传转化过程对转化效率影响程度从高到低的因素依次为：共培养时间、预培养时间、菌液浓度和侵染时间;以地黄叶片为外植体,材料不经过预培养,菌液OD600值为0.6,侵染时间5 min,并在培养基中添加100 μM乙酰丁香酮,共培养3天条件下可达最高转化效率,gus基因瞬时表达率可达65.63%。通过对根癌农杆菌介导的地黄遗传转化体系的优化,建立了高效的瞬时表达转化体系。     

四川小麦优良受体基因型筛选及农杆菌转化因素优化

为了丰富栽培小麦转化受体基因型,优化农杆菌转化小麦幼胚的技术体系,本研究评价了21份四川优良小麦品种(系)的幼胚再生能力,并以筛选到的最佳受体为材料,利用正交设计研究了预培养时间、菌液浓度、侵染时间、抑菌剂浓度、共培养方式和农杆菌菌株等易互作的6个因素对幼胚抗性愈伤再生率的影响,并探讨了筛选剂卡那霉素(Kanamycin)的适宜浓度。结果表明,21份材料中‘5157’、‘川农16’、‘R364’、‘川麦42’‘、内麦8号’的绿苗率超过了30%,可作为优良转基因受体加以利用。以‘5157’为受体材料建立农杆菌转化体系,正交试验表明菌液浓度和农杆菌菌株对幼胚抗性愈伤再生率的影响达到显著水平,而其他因素影响不显著。经优化后的遗传转化体系为:农杆菌菌株用C58C1,幼胚不经预培养,在菌液OD值为0.4的农杆菌中侵染40 min,共培养介质选用培养基,抑菌剂为200 mg/L羧卞青霉素(Carbenicillin),适宜的卡那霉素筛选浓度为50 mg/L。本研究为四川小麦遗传转化提供了5个候选基因型,为建立和优化小麦幼胚转化技术体系提供了理论依据,同时初步建立了农杆菌转化小麦幼胚的技术体系。     

根癌农杆菌介导的马铃薯DM茎段遗传转化条件的优化

本研究利用以双单倍体马铃薯DM的茎段为试验材料,对影响马铃薯遗传转化的条件进行了优化,主要从对通过抗生素浓度、预培养时间、侵染时间、农杆菌浓度和共培养时间等几个因素进行了的分析,对影响马铃薯遗传转化的条件进行了优化。研究表明:头孢霉素(cef)的浓度在600 mg/L时既不影响愈伤的正常生长还能有效的抑制农杆菌的生长。潮霉素(hyg)浓度在8 mg/L时对愈伤达到半致死状态,是因为较低的潮霉素浓度无法起到对抗性愈伤的筛选作用,所以合适的浓度应为愈伤达半致死状态浓度。得到更多抗性愈伤的最佳条件为:外植体预培养时间13天,侵染时间为8 min,农杆菌浓度以OD600=0.4左右,且共培养时间3天。上述的条件的优化大大的提高了马铃薯DM的遗传转化效率。     

毛白杨85号高效遗传转化系统的建立

在建立以毛白杨85号( Populus tomentosa 85)叶片为外植体的再生系统基础上,从预培养时间、浸染菌液浓度、浸染时间、共培养时间及添加AS(乙酰丁香酮)5个方面,以卡那霉素抗性植株作为转化率的衡量指标,研究了各因素对毛白杨85号遗传转化率的影响,建立了高效的遗传转化系统。筛选的高效转化系统为：农杆菌活化菌液用MS液体培养基稀释10倍,浸染5min,共培养4d。毛白杨85号叶盘转化率可达40.0%。该研究为利用叶盘法开展毛白杨85号基因转化培育抗逆新品种奠定了良好基础。     

适用于4种玉米基因型的农杆菌转化方法的探讨

利用改良的农杆菌培养液、侵染液、共培养培养基和筛选培养基等技术体系,对4个玉米基因型Hi-Ⅱ、H99、国内2个优良自交系R18-599和齐319的新鲜幼胚、预培养幼胚、胚性愈伤组织进行了农杆菌转化研究,并比较了不同共培养方式对农杆菌侵染不同玉米组织的影响。结果表明,Hi-Ⅱ新鲜幼胚在固体培养基上共培养和滤纸上共培养后GUS基因瞬间表达率分别为83.7%和4.4%,前法优于后法;Hi-Ⅱ新鲜幼胚、预培养3 d的幼胚愈伤组织经农杆菌侵染后GUS基因瞬间表达率分别为83.7%和12.1%,新鲜幼胚比预培养的幼胚愈伤组织更适合于农杆菌转化。用上述优化的条件对另外3个不同基因型的2种不同外植体H99、齐319(新鲜幼胚)和R18-599（胚性愈伤组织）进行遗传转化,共培养3 d后的GUS基因瞬间表达率分别为65.2%、52.6%和58%,表明该转化体系适合于上述4种基因型的幼胚和胚性愈伤组织的遗传转化。此外农杆菌侵染Hi-Ⅱ新鲜幼胚后经在含巴龙霉素25~100 mg L^-1培养基上3轮选择后,抗性愈伤组织获得率为2.4%,近似反映了本研究的遗传转化率。其他3个基因型的抗性愈伤也正在筛选中。结果初步表明,本研究建立的农杆菌介导的玉米遗传转化体系可能对4种基因型均适用。     

根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立

为建立根癌农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系,以花药愈伤组织为受体,研究了农杆菌菌株、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等因素对遗传转化效率的影响。结果表明,农杆菌菌株、共培养温度和共培养时间对转化效率具有显著影响,AS不影响转化效率。2.2万个花药愈伤组织经EHA105菌株侵染后,转入未添加AS的培养基,22℃共培养6d,通过50mgL-1卡那霉素抗性筛选、叶片GUS染色、uidA和NptII基因PCR特异扩增、PCR产物测序及NptII基因Southern检测,鉴定出11株转基因植株,并通过嫁接和次生体胚发生,获得来自8个转基因株系的681株转基因植株,移栽成活253株。     

根癌农杆菌介导白细胞介素-4基因转化甘蓝(Brassica oleracea L.)研究

利用根癌农杆菌介导法,以白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)基因转化中甘11号甘蓝.本研究对可能影响il-4转化率的外植体类型、外植体的预培养时间、农杆菌的侵染时间以及外植体与农杆菌的共培养时间进行了优化.试验结果表明:il-4基因对带1～2 mm子叶柄的子叶的转化率显著高于下胚轴;带柄子叶在预培养1 d、侵染3 min、共培养1 d时,转化效果最好,转化率达23.3%;下胚轴在预培养1～3 d,侵染3～5 min,共培养1～2 d时,转化效果较好,转化率最高可达13.3%.经PCR检测及PCR-Southern杂交,初步证明目的基因il-4已经转入甘蓝的再生植株.转il-4基因甘蓝的PCR阳性再生植株已经开花并产生了后代.     

农杆菌介导谷子成熟胚遗传转化体系的建立与优化

为建立一个稳定的谷子遗传转化体系,对216份谷子种质资源进行筛选,确定材料178成熟胚为受体材料,从植物激素浓度、防褐化剂、农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（AS）浓度等方面对谷子再生及转化体系进行优化。结果表明,在MS培养基中加入生长素2,4-D 9μmol/L、细胞分裂素Kinetin 4μmol/L、硝酸银8mg/L,愈伤组织诱导率最高且能有效防止褐化。在侵染液和共培养基中加入100μmol/L AS,gus表达效果最好。农杆菌溶液OD₆₀₀为0.3~0.5,侵染15min,共培养3d时,抗性愈伤组织率最高。获得的转基因植株,经PCR检测及gus染色分析,确定外源bar基因已成功整合到谷子基因组中。初步建立了一套谷子遗传转化体系,为今后谷子遗传转化提供一些参考。     

拟青山海关杨高效遗传转化系统的建立

本实验以叶片为外植体,建立了拟青山海关杨的高频再生系统;在此基础上,利用GUS瞬时表达法研究了菌种、预培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间和乙酰丁香酮（AS）浓度5个因素对拟青山海关杨叶片遗传转化的影响。结果表明,拟青山海关杨叶片最适不定芽诱导培养基为MS添加0.5mg/L的6-BA 和0.1mg/L的NAA,叶片再生频率为95%,平均不定芽数为10.07个;该杨树的高效遗传转化体系为：叶片省去预培养,菌种使用GV3101,侵染液OD600为 0.4～0.6,侵染10min,共培养培养基中添加乙酰丁香酮 200μmol/L,在此条件下,GUS荧光定量分析结果显示叶片的GUS活性达到最大值。     

农杆菌介导的sbe2a基因RNAi载体对玉米遗传转化的研究

将淀粉分支酶基因sbe2a的RNAi表达载体转入玉米自交系H99和丹598胚性愈伤组织。探讨了不同菌浓度、不同侵染时间和不同的共培养时间对玉米转化率的影响,确定了最佳转化条件:菌液浓度OD600值为0.5～0.7,侵染时间为25min,共体培养时间为3d。对转化的愈伤组织分化诱导出苗后进行PCR检测,获得了2株阳性植株,初步证明外源基因已经整合到玉米的基因组中。