香樟延伸因子EF1a基因片段的克隆及表达分析

通过同源克隆的方法从香樟Cinnamomum camphora中分离到一个编码延伸因子EF1a的c DNA序列片段。根据已经在Gen Bank中登录的其它物种的EF1a基因的保守序列设计一对兼并引物,通过反转录PCR技术获得一个1 297 bp的基因片段。同源比对表明:Cc EF1a与Gen Bank中注册的其它植物EF1a基因核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性高达96%以上。将所获得基因片段命名为Cc EF1a并提交Gen Bank,登录号为KM086740。实时定量PCR结果显示,Cc EF1a在低温胁迫下的叶片中表达量稳定,可以在实时定量PCR分析中作为内参基因。     

巴拉圭瓜多竹CAD基因的克隆与分析

肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD,EC1.1.1.195)是木质素生物合成途径中的最后关键酶,在木质素的生物合成中发挥关键作用。本研究依据转录组数据设计特异性引物,采用RT-PCR方法成功地从巴拉圭瓜多竹中克隆得到一个全新CAD基因的c DNA全长序列,命名为GPCAD(Gene Bank登录为KJ784465)。序列分析结果表明,GPCAD基因片段包含完整的c DNA开放阅读框(ORF),序列全长1 080bp,编码含有359个氨基酸残基的蛋白质。Blast比对结果显示该蛋白质属于CAD家族蛋白;系统进化分析结果显示巴拉圭瓜多竹与禾本科植物亲缘关系较近;荧光定量PCR技术检测结果显示GPCAD在茎秆中表达量最高,叶中的表达量最低。本研究对巴拉圭瓜多竹CAD基因进行克隆与分析,为深入研究巴拉圭瓜多竹木质素代谢途径相关基因以及通过分子生物学手段对木质素的含量和单体比例进行调控提供科学依据。     

尾叶桉GLU4肉桂酰-辅酶A还原酶基因克隆及原核表达

肉桂酰-辅酶A还原酶(Cinnamoyl Co-A Reductase,CCR)是木质素合成中的关键酶,根据植物中CCR保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4嫩茎为材料克隆到其CCR基因,命名为Eu CCR。该基因g DNA长2 918bp,c DNA长1 045 bp,CDS区编码336个氨基酸。EuCCR核酸序列与Gen Bank已登录的桉属植物CCR基因同源性达到96%以上,与伞房属、杯果木属植物CCR的同源性达85%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整FR_SDR_e结构域及NADP结合位点和底物结合位点,与可可树等植物中CCR基因编码序列同源性也在84%以上,确定为CCR基因。对EuCCR蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA软件对基因序列进行系统进化树分析。采用pQE30/M15系统对EuCCR进行原核表达,重组质粒成功表达分子量约36 kD的目的蛋白。本研究从尾叶桉GLU4中克隆得到EuCCR基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

中间锦鸡儿CiDR1的克隆及干旱胁迫下的表达分析

[目的]研究并了解中间锦鸡儿CiDR1基因功能及其对干旱胁迫的响应,为抗性育种提供候选基因。[方法]通过RACE技术从中间锦鸡儿中克隆CiDR1基因的c DNA全长,利用生物信息学分析软件对其基因结构及功能进行分析和预测。再通过qRT-PCR技术对干旱胁迫后的幼苗中的CiDR1表达模式进行研究。[结果]从中间锦鸡儿中克隆到CiDR1基因的c DNA全长共计4 297 bp,Gen Bank登录号为KP277100。生物信息学分析表明,预测的CiDR1蛋白序列中含有1 243个氨基酸残基,具有抗病基因特征结构域TIR、NB-ARC、LRR等,其等电点为6.35,不稳定指数为42.91,不具备信号肽,为非分泌蛋白,定位于细胞质中。定量PCR检测发现,CiDR1基因在幼年期的茎中表达量较低,在成年期的叶片中表达量较高;在干旱胁迫处理后的幼苗中,CiDR1表达水平有明显下降,表明该基因的表达受干旱抑制,可能与中间锦鸡儿适应干旱相关。[结论]中间锦鸡儿在干旱胁迫后其根、茎和叶中CiDR1的表达均明显下降,表明CiDR1的表达受干旱抑制,可能与中间锦鸡儿适应干旱相关,进一步研究发现CiDR1在根、茎、叶中的表达水平可能受发育阶段调控。     

慈竹WRKY转录因子基因克隆及其胁迫诱导表达

为了解慈竹WRKY生物学功能以及通过基因工程手段改良竹类植物。利用已获得慈竹转录组数据,克隆获得2条WRKY转录因子,分别命名为BeWRKY1(Gen Bank:KJ462124)和Be WRKY2(Gen Bank:KJ462125),两者分别编码189和295个氨基酸残基。序列分析表明,两者编码的蛋白均含有一个完整的WRKY superfamily的保守结构域。BeWRKY1属于Ⅱc亚家族;Be WRKY2则与Ta WRKY16和AtWRKY39等聚为一枝,属于Ⅱd亚家族。定量PCR分析表明,Be WRKY1和Be WRKY2分别在茎和完全展开叶中具有较高表达量。200mmol·L~(–1)NaCl和20%PEG 6000胁迫处理激活了Be WRKY1表达,却减少了BeWRKY2的转录积累。结果表明BeWRKY1可能短时间内迅速参与逆境响应;Be WRKY2对干旱和ABA胁迫伤害更为敏感,而可能不参与高盐类胁迫保护反应。     

杉木磷转运蛋白基因ClPht1;1的克隆及表达分析

【目的】PHT1基因家族是影响植物吸收磷营养的重要磷转运子之一。从杉木32号磷高效家系c DNA中克隆得到PHT1基因家族的1个杉木磷转运蛋白基因ClPht1;1,并对不同程度磷胁迫下ClPht1;1的时空表达进行研究,为杉木PHT1基因序列特征和功能结构的研究以及磷高效利用杉木基因型的选育奠定基础。【方法】根据PHT1基因家族序列保守性设计简并引物,以32号磷高效杉木基因型根系c DNA为模板进行扩增获得目的基因ClPht1;1的c DNA序列,使用RACE技术对目的基因进行全长克隆,并对其序列特征、同源性和编码磷转运蛋白结构进行分析。实时荧光定量PCR检测ClPht1;1在32号磷高效杉木家系根、茎、叶中的表达,检测中度缺磷胁迫下ClPht1;1在不同磷利用效率杉木4号、15号、25号、27号、28号、32号家系根系中的表达差异,以及在中度、重度缺磷胁迫下ClPht1;1在32号磷高效杉木家系根系中随时间序列的表达量变化。【结果】克隆得到1个杉木磷转运蛋白PHT1基因,命名为ClPht1;1(Gen Bank登录号:KX302006),基因序列编码区长1 638 bp,编码545 aa的蛋白质。ClPht1;1所编码蛋白质由12个疏水的跨膜区域组成,1个疑似跨膜域。每个跨膜结构域基本由17~25个氨基酸残基组成螺旋,同时跨膜蛋白的N端和C端均位于细胞质内,保守序列位于第4个跨膜域。构成蛋白质的主要骨架是α-螺旋,无信号肽序列。ClPht1;1基因编码蛋白与日本柳杉PHT基因编码蛋白的氨基酸序列相似性达到87.0%,与胡杨、油茶、马尾松等PHT家族基因编码蛋白的氨基酸序列相似性均在75%以上。ClPht1;1基因在杉木的根、茎、叶组织中均有表达,其中在根中的表达量最高,在叶中的表达量最低。在中度缺磷胁迫下,ClPht1;1基因在杉木不同家系根部的表达量为25号27号4号15号32号28号。在中度和重度缺磷胁迫下,ClPht1;1基因在32号杉木家系根部的表达量随胁迫时间的延长而逐渐上升;恢复供磷后,ClPht1;1基因表达量逐渐下降至正常水平;重度缺磷胁迫下,ClPht1;1基因表达量要高于其在中度缺磷胁迫下的表达量。【结论】ClPht1;1基因具有PHT1基因家族的典型结构,其编码蛋白的氨基酸序列与日本柳杉等磷转运蛋白氨基酸序列具有高度相似性,为杉木高亲和磷转运蛋白PHT1基因家族成员。ClPht1;1基因主要在杉木的根部表达,在叶片中的表达量较低;杉木磷利用效率越强,ClPht1;1基因在其根部的表达量越高。在不同磷利用效率的杉木家系中ClPht1;1基因表达量存在较大差异。ClPht1;1基因的表达受低磷胁迫的诱导,缺磷胁迫下ClPht1;1基因表达量明显升高,恢复供磷后ClPht1;1基因表达量明显降低。     

油茶钙调素基因的cDNA克隆与表达分析

在构建油茶近成熟种子cDNA文库的基础上,分离鉴定了油茶钙调素基因CoCaM1、CoCaM2的cDNA序列(Gen Bank登录号:EU856536和FJ649316),它们的长度分别为953 bp和1024 bp,均含有447 bp的开放读码框,编码的149个氨基酸完全相同;它们编码区的核苷酸序列高度一致,仅有25个碱基替代,证实了"多个基因编码一种蛋白"的假设。该蛋白含有19种氨基酸,属于酸性亲水性蛋白,理论等电点4.10,相对分子量16.83 kDa;它含有EF-手臂、半胱氨酸等结构域。该蛋白的亲水性/疏水性、柔性、抗原性具有较好的一致性,并表现高度的柔性。Blast及遗传进化分析表明:该蛋白的氨基酸序列与其它植物钙调蛋白的氨酸序列同源性较高。油茶CoCaM1在花芽到子房形成中的表达量较高;而CoCaM2在果实形成、膨大、油脂积累过程中的表达量较多,而在叶片和成熟种子中较少。这表明它们在花芽发育、果实形成、种子油脂合成积累中发挥着不同的调控作用。     

干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片SSH文库构建及CkWRKY1基因克隆

为研究柠条锦鸡儿抗旱的分子机制,挖掘干旱响应相关基因,成功构建干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片的抑制性差减杂交(SSH)文库,获得1 286条高质量的EST序列,平均长度475 bp,拼接得到Unigenes 645条.对这些Unigenes进行Blast比对注释后发现很多抗旱相关基因,例如LEA蛋白、DHN蛋白编码基因,MYB、bZIP、WRKY、NAC和bHLH转录因子等.通过RACE技术克隆其中1个WRKY转录因子的cDNA全长,命名为CkWRKYI,GenBank登录号为JX987095.CkWRKY1编码330个氨基酸的蛋白质,氨基酸序列中有1个“WRKYGQK”的WRKY转录因子家族保守序列,属于第Ⅱ类WRKY转录因子.利用实时荧光定量PCR技术检测发现,CkWRKY1基因在干旱处理后mRNA的表达水平明显上升,预示该转录因子可能与柠条锦鸡儿抗旱的分子机制相关.     

白蜡虫β1-微管蛋白基因cDNA克隆及序列分析

采用RACE和RT-PCR对白蜡虫雌成虫β1-微管蛋白基因进行了克隆,获得的cDNA全长序列为1 492 bp,完整开放阅读框为1 341 bp,编码447个氨基酸残基,包含β微管蛋白的保守区域和GTP结合位点,理论分子量约为50.20 Kda,等电点为4.75。同源性分析表明:所获得的β1-微管蛋白与其它昆虫的β微管蛋白基因在氨基酸水平上是高度同源的,该基因cDNA序列已经递交到Genbank,获得的登录号为JF731244。     

板栗CmAPs基因的克隆及在芽变短雄花序中的表达分析

利用RT-PCR与RACE扩增方法,分别从板栗正常雄花序和芽变短雄花序cDNA中分离出编码板栗天冬氨酸蛋白酶cDNA全长的序列,序列分析表明:克隆的cDNA片段总长分别为1 822 bp和1 909 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小均为1 539 bp,可编码长度为513个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与蓖麻、可可和葡萄的天冬氨酸蛋白酶的蛋白质氨基酸序列相似性分别为83%,80%和75%.正常与芽变短雄花序中天冬氨酸蛋白酶的氨基酸序列存在6个氨基酸的差异,其中有3个位于活性区.后证实分离出的2个天冬氨酸蛋白酶基因在正常雄花序和芽变短雄花序中共同存在,命名为CmAPs1和CmAPs2(GenBank登录号分别为GQ984143和GQ084144).实时荧光定量PCR结果显示:在雄花序原基形成期、花簇原基形成期和花朵原基形成期,芽变花序中的CmAPs的总表达量均高于正常花序中的总表达量,而在发育的花被原基形成期即程序性死亡发生期,CmAPs在芽变花序中表达量远远低于正常花序中表达量.初步推测CmAPs与短雄花序发育过程中的程序性死亡有关.     

牛角瓜5β黄体酮还原酶基因(Cgp5Br)克隆与序列分析

5β黄体酮还原酶是强心苷合成途径中的第一个关键酶,在强心苷合成中起着重要的调控作用。为了研究牛角瓜中强心苷生物合成途径的关键酶基因,本研究依据牛角瓜转录组数据设计特异性引物,采用RT-PCR方法从牛角瓜中克隆得到关键酶基因p5Br(5β黄体酮还原酶基因)的2个开放阅读框(ORF),分别命名为Cgp5Br1(GeneBank登录号MH094753)和Cgp5Br2(GeneBank登录号MH094754)。序列分析结果表明,Cgp5Br1的序列长1 164bp,编码387个氨基酸,Cgp5Br2的序列长1 158bp,编码385个氨基酸。进化树分析发现,Cgp5Br1和Cgp5Br2在进化上属于旁系同源。qRT-PCR分析表明,Cgp5Br1和Cgp5Br2在牛角瓜的根、茎、叶、花和种子中均有表达。Cgp5Br1在根中相对表达量最高,而Cgp5Br2在根、茎、叶和花中的表达量都相对较高,种子中最低。本研究为今后利用代谢工程提高强心苷含量提供了重要的基因资源。     

茶树2个MYB转录因子基因的克隆及表达分析

MYB类转录因子是一类包含一段保守的DNA结合结构域的基因家族,广泛地参与植物发育和植物次生代谢的调节。根据前期芯片杂交和文库筛选得到的2个MYB转录因子的部分序列,采用RT-PCR和RACE技术分离得到它们的全长基因:CsMYB1和CsMYB2,在GenBank的登录号分别为HQ660373和HQ660374。序列分析表明:CsMYB1基因全长1132bp,开放阅读框长879bp,编码292个氨基酸,推测的蛋白分子量约为32.9ku,理论等电点为8.13;CsMYB2基因全长1020bp,其中开放阅读框长675bp,编码224个氨基酸,推测的蛋白分子量约为25.4ku,理论等电点为9.05。2个基因编码的蛋白均具有明显的R2R3MYB结构域,且在R3结构域的下游都含有1个相对保守的C1(LIXXGIDPXTHR)基序。同源性分析表明:茶树CsMYB1和CsMYB2编码的氨基酸序列与其他植物的MYB类转录因子具有较高的相似性,其中CsMYB1编码的氨基酸序列与陆地棉MYB1的相似性为57%,CsMYB2编码的氨基酸序列与葡萄MYBC2的相似性为75%。利用荧光定量PCR技术检测2个转录因子基因在遮荫处理条件下的表达规律,及其在茶树不同组织中的表达特性,结果表明:CsMYB1和CsMYB2在不同组织中均有表达,但表达量具有明显区别,其中CsMYB2在叶片中的相对表达量是根中的100多倍;而遮荫处理能明显降低叶片中的花青素含量,并提高CsMYB1的表达,但对转录因子CsMYB2的影响不大。     

中华大节竹耐盐基因Is SOS1的克隆与序列分析

通过RACE技术,从中华大节竹根中克隆出一个质膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因,并命名为Is SOS1(基因登录号:KC113048)。Is SOS1序列分析结果显示,Is SOS1的全长为3 516 bp,其中开放读码框为3 105 bp,编码了1 035个氨基酸多肽。氨基酸同源性和聚类分析证实,Is SOS1氨基酸序列与拟南芥At SOS1和水稻Os SOS1的氨基酸序列同源性较高,分别为50. 3%和76. 63%,但是与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列同源性较低。     

银杏叶绿素a/b结合蛋白基因(GbLhcb4)及其启动子克隆

为了探究银杏中叶绿素a/b结合蛋白基因(Gb Lhcb4)的结构及其相关的转录调控元件,基于Roche454高通量测序获得的Gb Lhcb4基因片段,采用RACE技术分离得到该基因的c DNA序列,并通过染色体步移技术获得该基因启动子序列,结合生物信息学技术分析基因序列的特征、系统进化地位及启动子区域的转录调控元件。序列分析表明,Gb Lhcb4基因全长1 200 bp,含有一个834 bp开放阅读框,编码277个氨基酸,相对分子量为30.65 k D,等电点为5.17。同源分析表明,该基因编码蛋白与北美云杉Ps Lhcb4蛋白(Gen Bank登录号:ABK21281.1)相似性最高,为74.7%。启动子顺式作用元件预测表明,启动子区域包含多个光响应元件及逆境响应元件,同时还存在激素响应、组织特异性表达、细胞周期等相关调控元件。此研究分离得到银杏Gb Lhcb4基因及启动子序列,并进行了相关的生物信息学分析,为探究银杏Gb Lhcb4基因应答环境信号的转录调控机制提供了分子基础。     

超表达牛奶子EutPDS提高番茄果实番茄红素含量

【目的】牛奶子果实中富含番茄红素,八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是番茄红素生物合成上游的重要酶。特异性超表达牛奶子Eut PDS基因(Gen Bank登录号:GQ254067),以期提高番茄果实中的番茄红素含量。【方法】通过RT-PCR方法从牛奶子果实中分离EutPDS基因cDNA及基因组全长,Southern杂交分析基因的拷贝数,专用软件分析此基因及蛋白结构。采用番茄2A11启动子构建果实特异性超表达载体,转化根瘤农杆菌GV3101后,借助农杆菌介导的叶盘法转化至‘中蔬四号’番茄。半定量RT-PCR检测转基因植株果实EutPDS基因的表达,高效液相色谱仪、实时定量PCR分别用于分析转基因番茄果实主要类胡萝卜素组分含量和内源类胡萝卜素代谢相关基因表达的变化。【结果】从牛奶子中克隆的EutPDS基因长度为1 920 bp,含有1 749 bp ORF。其基因组序列无内含子,单拷贝。EutPDS编码1个582个氨基酸的蛋白,该蛋白与其他植物PDS有很高的同源性,具有典型的二核苷酸结合域、类胡萝卜素结合域。采用农杆菌介导方法转化番茄叶盘,PCR检测,潮霉素筛选,成功获得了2个EutPDS转基因番茄株系,其果实颜色较对照更红。半定量分析显示外源EutPDS基因在转基因番茄果实中超表达,实时定量PCR分析表明番茄红素生物合成上游2个内源基因Sl PSY和Sl ZDS受影响显著上调,同时1个下游基因Sl LCY-e的表达则显著下调,使得转基因番茄果实中番茄红素含量为野生型的2倍,但β-胡萝卜素含量无显著变化。【结论】在番茄果实中特异性超表达牛奶子EutPDS基因可有效促进番茄果实中番茄红素的合成和积累。     

油茶丙二酰单酰CoA:ACP转酰基酶基因的克隆与原核表达

【目的】油茶种仁含油率较低且易遭逆性环境等的影响,这些都严重影响和制约了油茶产业的快速发展。丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶是脂肪酸合成酶(FASⅡ)复合体的组成酶之一,在脂肪酸合成中起着装载作用,它的酶促反应产物丙二酰单酰ACP是脂肪酸合成关键组成部分。开展该基因的功能研究,能为油茶的分子遗传育种奠定基础。【方法】以油茶品种‘华硕’种子为材料,借助其种子转录组和表达谱数据库,通过RACE技术,克隆丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因并对该基因进行生物信息学分析。利用常规的酶切连接技术构建基因的原核表达载体,并利用α酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性。【结果】丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因的全长c DNA 1 867 bp,含有1 131 bp的开放读码框,编码376个氨基酸,具有58个氨基酸长度的叶绿体转运肽,该基因被命名为Co MCAT(Gen Bank登录号KJ910337)。在malonyl-Co A结合位点和ACP结合位点上分别存在高度保守的基序"GQGXQ"和"GXSXG"。原核表达载体p ET30a-Co MCAT在BL21(DE3)细胞中被成功地诱导表达,目的重组蛋白分子量约为40 k Da。酶活性分析表明,重组蛋白Co MCAT的最佳催化温度为30℃,最佳p H为7.0,比酶活性约为2.384 U·μg-1。【结论】以本实验室构建的油茶转录组数据库为基础,首次克隆获得油茶MCAT基因的全长c DNA序列,构建其原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达目的蛋白,并对重组蛋白进行初步的酶活性分析。研究结果为今后进一步深入开展和揭示油茶MCAT基因在油脂合成的代谢过程中的作用奠定基础。     

滇牡丹类黄酮7-O-葡萄糖基转移酶基因的鉴定与表达分析

以野生滇牡丹为试验材料,以其转录组数据为基础,采用反转录PCR技术克隆得到一个具完整开放阅读框的类黄酮7-O-葡萄糖基转移酶基因(Pd7GT),并通过生物信息学分析手段、基因表达对该基因进行分析。结果显示:该基因全长1 446bp (Gen Bank登录号为KX394687),可编码481个蛋白氨基酸;生物信息学分析发现Pd7GT蛋白C末端含有典型糖基转移酶识别区(WAPQV)和UDP-葡萄糖基配体绑定位点(HCGWNS)的PSPG盒子,其蛋白序列GWAPQVMILEHEAVGGFVTHCGWNSTLEGISAGLPLVTWPIFAEQFYNEK,与可可(XP_007042481)、Herrannia umbratica (XP_021298085)、毛果杨(XP_006379195)、巨桉(XP_010066837)等以葡萄糖为糖基配体的类黄酮7-O-糖基转移酶聚为一类; Pd7GT基因在组织茎中表达量最高、不同花发育时期的花谢期表达量最高、不同颜色花瓣中黄花花瓣表达量最高。本研究为滇牡丹糖基转移酶异源表达、分子育种等研究提供一定的基础,为未来通过基因工程培育具新颖花色和抗性的滇牡丹新品种提供必要材料。     

美国白蛾HcSID-1基因的克隆、表达模式分析及其在幼虫中的功能验证

【目的】克隆美国白蛾系统性RNA干扰缺失基因序列,对该基因进行序列特征分析和时空表达模式检测,并研究其在美国白蛾幼虫系统性RNA干扰中的功能。【方法】通过RT-PCR和RACE技术从美国白蛾幼虫中进行基因克隆,并进行生物信息学分析;利用qPCR技术检测该基因在美国白蛾不同发育阶段和幼虫不同组织中的相对表达量;利用RNAi和qPCR技术验证外源dsRNA对该基因的干扰效率,以及干扰该基因表达后对其他靶标基因干扰效率的影响。【结果】从美国白蛾幼虫中克隆得到一个美国白蛾系统性RNA干扰缺失基因并命名为HcSID-1(Gen Bank登陆号:MG696730)。该基因全长2 761 bp,开放阅读框(ORF) 2 613 bp,编码870个氨基酸,预测蛋白分子量为97. 08 kD,理论等电点(pI) 6. 81,有1个19 aa的信号肽。氨基酸序列分析表明,Hc SID-1蛋白有1个长N末端(308 aa),序列中后段309—855位氨基酸之间具有典型的11个跨膜结构域;系统进化分析表明HcSID-1与鳞翅目昆虫同源性较高,和家蚕的Bm SID-3亲缘关系最近;时空表达分析表明,HcSID-1在美国白蛾各发育阶段和幼虫各组织中均有表达,在幼虫中肠组织表达量最高。注射HcSID-1 dsRNA可显著降低该基因在转录水平的相对表达量,且该基因的下调能降低HcChi dsRNA在美国白蛾幼虫中的RNA干扰效率。【结论】获得具有典型家族特征的美国白蛾SID-1基因序列,该基因的下调能够影响其他靶标基因dsRNA的RNAi效率,表明该基因可能具有与其他SID基因在系统性RNAi过程中相同的功能。     

樟叶越桔糖基转移酶VdUGT1基因克隆及序列分析

根据樟叶越桔Vaccinium dunalianum叶芽转录组测序实验获得的糖基转移酶Vd UGT1基因部分c DNA序列设计引物,采用RACE-PCR技术克隆了全长1 620 bp c DNA序列的Vd UGT1基因,包括1 398 bp c DNA序列的完整开放阅读框,推测编码由465个氨基酸残基组成、相对分子质量为50.89 k D的糖基转移酶Vd UGT1。序列分析表明,Vd UGT1理论等电点为5.53,负电荷残基(Asp+Glu)总数为53个,正电荷残基(Arg+Lys)总数为41个,不稳定系数为48.38,属于不稳定蛋白;其二级结构的主要构件为α-螺旋和随机卷曲,无跨膜结构域,属于亲水性蛋白质。Vd UGT1位于C末端含有尿嘧啶核苷二磷酸糖基转移酶所特有UDPGT功能域,推测与尿嘧啶核苷二磷酸糖的结合有关。该研究为后期Vd UGT1的异源表达和功能研究奠定了基础。     

桑树查尔酮异构酶基因的克隆与原核表达分析

以果叶兼用新桑品种‘嘉陵30号’的果实为材料,采用同源克隆法和抑制PCR法克隆桑树查尔酮异构酶基因(MaCHI)全序列.该基因的基因组序列全长2 402 bp,包含2 112 bp长的ORF和290 bp长的3'UTR序列,ORF由4个外显子和3个内含子组成,该基因编码219个氨基酸.预测MaCHI编码蛋白质的分子质量为23.8 ku,理论等电点为5.29.采用RT-PCR法分析MaCHI在不同组织中的表达水平,在叶片和果中的表达量较高,在根中表达量较低.构建pET-28a(+)-MaCHI原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中诱导表达.