鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原表位的串联表达及间接ELISA方法的建立

本研究旨在建立一种快速、简便的鸡传染性支气管炎抗体的检测方法.通过生物信息学软件对传染性支气管炎病毒(IBV) ZY3株的S1蛋白进行分析后,筛选出4段S1蛋白抗原表位优势区域(FI～F4),将4段表位串联成1条新基因F,对F基因编码的蛋白质进行二级结构预测·结果表明该蛋白抗原指数性高且具有良好的柔韧性.构建重组表达载体pET-32a(+)-F,并在原核表达系统中表达,获得大小为42 ku的融合蛋白,经Western blot 分析表明表达的串联蛋白具有良好的反应原性.以纯化的串联蛋白作为包被抗原,建立了一种检测IBV抗体的间接ELISA方法.利用建立的ELISA方法对采集来175份血清样品进行检测,并与商品化试剂盒进行对比,显示其阳性符合率为90.2％,阴性符合率为85.7％,总体符合率为89.7％o,表明建立的ELISA方法具有良好的特异性、重复性和敏感性.     

TGEV S基因原核表达及表达蛋白间接ELISA方法的建立与初步应用

为了建立检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),试验参照GenBank公布的TGEV TH-98株S基因序列,设计合成1对引物,RT-PCR扩增相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-32a中,以大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞为表达菌株进行诱导表达。再以纯化重组蛋白作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等参数建立检测TGEV S蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明:试验成功克隆了TGEV S基因,扩增片段长度为4 003 bp;构建了重组表达质粒pET-S,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中获得高效表达,表达蛋白分子质量约为148 ku;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blot分析显示,重组蛋白具有良好的抗原性;以纯化的S重组蛋白作为包被抗原,建立了TGEV S蛋白抗体检测间接ELISA方法;该ELISA方法的抗原最佳包被浓度为18.85μg/mL,最适血清稀释比例为1∶40。     

基于狂犬病病毒重组蛋白的ELISA检测方法比较研究

原核表达狂犬病病毒的基质蛋白(M),并以此作为包被抗原建立间接ELISA检测方法,与以狂犬病病毒磷蛋白(P)作为包被抗原建立的间接ELISA方法进行比较。根据GenBank中公布的狂犬病病毒LEP-Flury株M基因序列设计特异性引物并引入SmaⅠ和NotⅠ酶切位点,经RT-PCR扩增得到目的基因,连接pCR 2.1载体,构建重组质粒pCR-RV-M,重组质粒用SmaⅠ和NotⅠ进行双酶切,酶切产物定向克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-RV-M。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使用IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析表明蛋白表达量较大,且主要以可溶性的形式表达。亲和层析纯化目的蛋白,Westernblot表明融合蛋白具有良好的反应原性,使用纯化的融合蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法并检测了95份血清,同时使用带有His标签的重组狂犬病病毒磷蛋白P(RV-His-P)建立的ELISA方法和商品化的ELISA试剂盒检测该血清。结果表明:与商品化的以全病毒作为包被抗原的ELISA检测试剂盒相比,使用重组P蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测方法具有更高的符合率,能够代替全病毒作为诊断抗原建立检测方法。     

利用IBV重组N蛋白建立ELISA抗体检测试剂盒的研究

利用表达鸡传染性支气管炎病毒Gray株N蛋白的基因工程重组菌，表达IBV—N蛋白，并利用表达载体上带有组氨酸标记的特点，应用金属螯合填料将其纯化。用纯化的IBV—N蛋白作为包被抗原，成功地建立了一种检测血清中IBV抗体的间接ELISA方法。确定抗原最佳包被浓度为0．58μg／ml；被检血清的最佳稀释度为1：100；酶标二抗的工作浓度为1：1000。确定了血清样品阴、阳性临界0D值为0．14。与IDEXX公司IBV抗体检测试剂盒比较，结果表明自建ELISA试剂盒具有较高的敏感性和特异性。     

鹅源新城疫病毒F基因的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立

参照GenBank公布的鹅源新城疫病毒NA-1株F基因(DQ659677)的核苷酸序列设计1对引物,通过PCR扩增F基因全长,将其克隆到pET-22b( )载体中,构建了原核表达载体pET-22b( )-F,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化了重组蛋白,Western-blot证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为0.21μg/孔,建立了检测鹅源新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。     

含鸡源启动子的真核表达载体的构建及IBV S1蛋白抗原表位的表达

利用PCR方法扩增出鸡β-肌动蛋白(β-actin)启动子基因序列,克隆至pcDNA3.1和pCIneo载体中以替代CMV启动子,获得含鸡源启动子的真核表达载体pcDNA-act和pCIneo-act。将IBV ZY3S1蛋白抗原表位基因亚克隆到启动子替换前后的质粒中,然后将重组质粒转染至鸡胚成纤维细胞(CEF)中,采用间接免疫荧光试验检测转染细胞对S1蛋白抗原表位的表达。将重组质粒以150μg/只的剂量肌注免疫SPF雏鸡,同时设立IBV灭活疫苗组及PBS空白对照组,经间接ELISA检测免疫前后血清中IBV特异性抗体,最后使用ZY3强毒株给各组实验动物攻毒,观察鸡群的发病死亡情况,计算攻毒保护率。结果显示,替换启动子后的表达载体在CEF中对S1蛋白抗原表位的表达量以及实验动物的抗IBV抗体水平均高于未更换启动子的相应载体,攻毒后鸡群的发病率和死亡率均比替换前降低,说明外源基因的表达和启动子的来源有密切的关系。     

不同包被抗原检测PRRS抗体间接ELISA方法的建立

为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法,本研究利用RT-PCR方法分别扩增出PRRSV VR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因,将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中,成功构建重组质粒pET-32a-GP4、pET-32a-N和pET-32a-GP4-N。将3种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出GP4蛋白、N蛋白和GP4-N融合蛋白,并对表达出的蛋白进行纯化。将3种已纯化的重组蛋白分别作为间接ELISA的包被抗原,通过不断优化反应条件,最终建立了检测抗PRRSV抗体的间接ELISA方法。分别使用该3种方法检测从河南省多个地区收集的200份猪血清样品中的抗PRRSV抗体,并与商品化试剂盒进行比较,结果显示,GP4蛋白做抗原时检测阳性符合率为82.7%,N蛋白做抗原时检测阳性符合率为87.2%,GP4-N融合蛋白做抗原时检测阳性符合率为85.5%;因此,N蛋白是间接ELISA方法检测抗PRRSV抗体的优势包被抗原。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性的初步分析

拟构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QS10株S1蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒,并在本动物上进行初步的免疫学试验。通过RT-PCR获得S1基因,插入腺病毒表达系统穿梭质粒,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-S1,转染293AD细胞获得表达S1蛋白的重组腺病毒。PCR检测显示,S1基因已重组到腺病毒基因组;间接免疫荧光和Western blot检测证明该重组病毒在293AD细胞中真实表达了具有免疫反应性的IBV S1糖蛋白。重组病毒培养滴度可达到107 TCID50.mL-1。免疫接种SPF鸡后,通过ELISA检测,免疫鸡产生了针对IBV的特异性抗体。作者成功构建了表达IBV S1蛋白的重组腺病毒,该重组病毒可在SPF鸡体内诱导产生IBV特异性抗体。     

鸡传染性法氏囊病血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可检测鸡传染性法氏囊病血清抗体的间接ELISA检测方法,本研究经RT-PCR扩增IBDV VP2（1nt-708nt）基因片段,并应用pET28a载体进行原核表达,亲和层析纯化重组蛋白作为包被抗原,建立检测IBDV血清抗体的间接ELISA方法。应用所建方法和IDEXX试剂盒,对采自不同地区的156份鸡血清样品进行平行检测和比较。结果表明,RT-PCR扩增获得708bp的VP2基因片段;含重组表达质粒pET28a-VP2的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后,表达了约27kDa的VP2重组蛋白,表达量约占菌体蛋白的30.1%;建立的间接ELISA检测方法与IDEXX试剂盒比较,其特异性、敏感性和符合率分别达到90.24%、95.65%和94.23%。由此可见,本研究所建立的间接ELISA方法敏感、特异,适用于IBDV血清抗体的检测。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

RT—PCR及RFLP分析技术对鸡传染性支气管炎病毒的诊断和S1基因分型的研究

本研究使用分别扩增整个S1整个S1糖蛋白基因（引物A）和S1糖蛋白基因N-端高变区I（引物B）的2对引物对3个IBV标准株M41、Connecticut、Arkansas及5个地方分离株（C60，D41A，D41B，A1121，A1171）进行RT-PCR扩增，用引物A时，有5个IBV毒株扩增到目的片段（1720bp)；用引物B时，所有8个IBV毒株均得到与预丈夫大小相符的目的产物（228bp)，对1720bp的PCR产物用限制性内切酶HaeⅢ进行酶切，结果得出3个不同的RFLP图谱，其中M41、Connecticut、D41B具有相同的HacⅢ酶切图谱，Arkansas和D41A则分别具有互不相同的图谱；对228bp的PCR产物进行DdeI、RsaI限制性内切酶消化，根据它们的RFLP图谱，8个IBV毒株可分为5个基因型，综合2对引物的PCR产物的PCR产物的RFLP分析结果，8个IBV毒株可分为7个基因型，分型的结果与传统的血清学方法吻合，本研究建立的方法和技术具有快速、简单、特异灵敏等优点，为现场流行毒株的定型（基因型/血清型）及其S1基因变异的跟踪研究以及更有效防制传染性支气管炎奠定了基础。     

IBV荧光定量PCR检测方法的建立及对感染鸡体内病毒的检测

IBV（infectious bronchitis virus）属于冠状病毒γ群，可以引起鸡的呼吸道疾病，造成严重的损失，现在对IBV诊断方法的研究进行得十分广泛，建立了多种方法。本研究建立了IBV的Real-Time PCR检测方法，最低检测灵敏度为10 copies/μL，可以有效地区别其他禽源病毒，板内差异为0.1%～0.7%，板间差异为0.7%～1.6%，证明该方法具有较高的灵敏性、特异性和稳定性，并对分离到的野毒株ck/HHLJ/HH13进行了病毒感染试验的检测，在鸡体内的气管肺脏肾脏中都具有较高的浓度，其中气管和肾脏中病毒的滴度一直维持很高的水平，至感染后21 d才逐渐消失，病理组织学可见肾脏和气管病变最严重，证实了所分离到的野毒株ck/HHLJ/HH13是具有很强毒力的肾型IBV毒株。     

鸡传染性支气管炎野毒感染的诊断

疾病的诊断可以通过对鸡群病史、临床症状、血清学及病原分离与鉴定相结合的评价来完成。血清学监测在确定野毒感染的时间和性质上很有帮助。     

IBV野毒感染的诊断

疾病的诊断可通过综合评价鸡群的病史、临床症状、血清学特征及病原分离和鉴定来完成。血清学监测在一定程度上有助于鉴别出野毒感染的时间和特性。。     

鸡腺胃型传染性支气管炎病毒（QX IBV）的分离和鉴定

１９９６年９月份以来,青岛地区鸡群发生一种新病,通过鸡胚育５代－６代,电镜观察,动物回归和免疫保护试验,用气管环组织培养进行理化特性测定,毒价测定,中和试验,证明目前流行的以腺胃肿大为主要特征的传染病的病原是冠状病毒,因为引起腺胃的特征性的病理变化,将此病暂定名为腺胃型传染性支管炎,将青岛分离株定主要特定的ＯＸ株。     

鸡传染性支气管炎病毒的快速检测

本试验建立了一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒的通用性PCR方法。通过对纯化后IBV核蛋白基因进行的直接PCR及套式PCR扩增表明，两次PCR产物的大小为0.7kb和0.5kb，与实际设计相符。而对照的NDV主IBDV的PCR扩增产物均为阴性。用IBV HB（华北）株感染SPF鸡后，应用我们所建立的PCR方法去检测不同时期所采集的肾脏、气管、盲肠扁桃体、肺脏和肝脏中的IBV，在SPF鸡感染IBV后的21天仍然能够检测到IBV的基因组，Southern blot杂交试验证明了我们获得的PCR产物为IBV的核蛋白基因。对30份自然感染病料的检测表明，本实验所建立的PCR方法检测阳性数为15份，阳性率为50％（15／30）；鸡胚接种检测的阳性数为17份，阳性率为56．7％（17／30）；IFA检测的阳性数11 ，阳性率为36．7％（11／30）。PVR检测法与鸡胚接种方法的阳性符合率为93．3％（14／15），统计学分析表明，P＞0．05，差异不显著，而PCR检测法与IFA的阳性符合率为60％（9／15）。结果证明本实验所建立的PCR检测方法具有敏感、特异、快速等特点，适用于不同来源及不同血清型IBV的检测。     

DNA免疫防制鸡传染性支气管炎的探索研究

ＯＲＦ完整的ＩＢＶ类Ｍ４１株Ｓ１基因ｃＤＮＡ插入真核表达质粒ｐＣＩ ＣＭＶ启动子下游我隆位点，构成ｐＣＩＳ１用于１周龄ＳＰＦ雏鸡的ＤＮＡ免疫试验。试验鸡生疏腿部肌肉注射ｐＣＩＳ１ＤＮＡ１００ｇ，２周后加强免疫一次。二次免疫２周后，代感染ＩＢＶ Ｈ５２株。结果，ＩＢＶ人工感染后第４天气管－泄殖腔棉拭子鸡胚病毒分离阳性者，免疫试验组为１／６，而对照组为６／６，鸡胚病毒中和试验显示，二次免疫后临感染前及     

鸡传染性支气管炎病毒N蛋白研究进展

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)是严重危害养鸡业的重要病原之一.近年来国内外学者在分子生物学领域方面的研究不断深入,在病毒基因组的结构与功能及其N蛋白的研究方面取得了重要进展.对N蛋白如何特异性地识别病毒基因组RNA、参与病毒RNA的复制和包装、诱导IBV体液和细胞免疫应答的机制、IBV新型基因工程疫苗研制以及IBV的抗体水平监测等方面的研究,为IBV基因工程疫苗设计及其免疫防控提供了科学依据.     

IBV M基因与IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)的M基因和禽白介素18(IL-18)基因分别插入双顺反子质粒pIRES-EGFP/DsRed中,构建IBV M和IL-18基因的共表达质粒pIRES-M/IL18及表达M基因的pIRES-M质粒。通过脂质体转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测质粒在体外的表达。将构建的质粒用脂质体包裹后,通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄雏鸡,28日龄加强免疫1次;免疫前后均采血检测ELISA抗体效价和外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量;二免后2周用IBV肾型强毒进行攻毒。结果显示,pIRES-M/IL18、pIRES-M质粒均在Vero细胞中有效地转录并表达目的蛋白。从免疫后7 d起,pIRES-M/IL18免疫组产生的抗体水平及外周血T淋巴细胞亚群数量均高于pIRES-M组。pIRES-M/IL18、pIRES-M组对强毒的攻击保护率分别为65%和40%。以上结果表明,禽源IL-18基因与IBV M基因共表达可增强鸡体对DNA疫苗的免疫应答,提高对IBV强毒的抵抗力。