枯草芽孢杆菌B-916胞外抗菌蛋白质的性质

用硫酸铵分级沉淀枯草芽孢杆菌B-916胞外抗菌蛋白质,共获得8个蛋白质粗提物,其中硫酸铵饱和度为40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质具有较强的抑菌活性,研究结果表明:硫酸铵饱和度40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质浓度分别为17.261μg/m l和18.899μg/m l,上述两者对水稻纹枯病菌和水稻恶苗病菌有较强的抑菌活性,对马铃薯晚疫病菌则没有抑菌活性;当温度高于40℃时抑菌活性均降低,但在120℃时仍有部分抑菌活性;对pH值适应范围较宽,但在pH值为13.6时抑菌活性均丧失;经蛋白酶K、蛋白酶E、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后,抑菌活性均下降。SDS-PAGE电泳结果表明枯草芽孢杆菌B-916能分泌多种蛋白质,其中硫酸铵饱和度40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质中相对分子质量为48 000的蛋白质可能为抗菌蛋白质。硫酸铵饱和度40%~50%和50%~60%提取的粗蛋白质经Sephadex G-100层析后检测到4个蛋白质吸收峰。     

枯草芽孢杆菌BS-1菌株抑菌活性研究

对1株枯草芽孢杆菌BS-1进行了抑菌活性测定研究。以苹果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、水稻恶苗病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫霉病原菌、玉米小斑病菌7种植物病原菌为指示菌,采用对峙培养法、杯碟法以及菌丝生长速率法测定了枯草芽孢杆菌及其无菌发酵液对7种植物病原菌的拮抗活性,结果表明,枯草芽孢杆菌及其发酵液对番茄灰霉病菌生长有较强的抑制作用,对苹果炭疽病菌没有抑制作用。     

香蕉根际促生菌的抑菌活性及对作物生长的促进作用

【目的】研究4种香蕉根际促生菌对香蕉枯萎病镰刀菌和几种重要作物病原菌的抑菌活性,及其对番茄和玉米的促生作用.【方法】在培养皿中测定根际促生菌对作物病原菌的拮抗作用,通过盆栽试验测定根际促生菌发酵液对作物生长的促进作用.【结果和结论】从健康香蕉根际土中分离获得的枯草芽孢杆菌Bacillus.subtilis、解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens、耳炎假单胞菌Pseudomonas.otitidis和绿针假单胞菌Ps.choloeaphtis对香蕉枯萎病镰刀菌4号小种Fusarium oxysporum f.sp.cubense具有强烈的抑菌活性,对番茄早疫病菌Alternaria solani、玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani、荔枝炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.、香蕉炭疽病菌C.musarum Cooke et Mass、青瓜枯萎病菌F.oxysporum(Schl.)f.sp cucumerinum Owen、小麦赤霉病菌F.graminearum和荔枝霜霉病菌Penorophythora litchi Chen等作物病原菌也具有很好的抑菌活性;4种香蕉根际土壤细菌中耳炎假单胞菌生长最快、抑菌效果最好,其生长半径分别是枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、绿针假单胞菌的2.75、2.61和2.70倍,其对香蕉枯萎病、番茄早疫病菌、玉米纹枯病菌、荔枝炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、青瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌和荔枝霜霉病的抑菌率分别达到50.70%、62.95%、70.85%、68.10%、58.58%、59.30%、51.34%和63.08%;用耳炎假单胞菌发酵液培养植物使番茄和玉米株高分别提高16%和33%,并且使番茄叶片总叶绿素含量增加40%.以上结果表明,香蕉根际微生物耳炎假单胞菌对作物病原菌有很好的抑菌活性,并且促进番茄和玉米的生长.     

枯草芽孢杆菌离子突变菌株H-74脂肽类抗菌物质对水稻抗性诱导作用

通过离子注入技术对枯草芽孢杆菌生防菌Bs-916突变选育,得到一株拮抗性能比出发菌Bs-916提高15 %以上的突变菌株H-74.通过对其抗菌物质的高效液相色谱(HPLC)分析表明,H-74分泌的脂肽类抗菌物质主要是表面活性素.在PDA平板上的水稻纹枯病菌菌丝抑制试验中,它能有效抑制新生菌丝的生长,并使细胞内含物外泄.盆栽控病试验表明,它对水稻纹枯病菌的相对防效达到73.35 %.将H-74分泌的脂肽类抗菌物质单喷于水稻植株上,测定与植物抗病相关的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的变化,发现其对植物抗病相关酶活性表达有明显的诱导作用.结果还显示同时接种脂肽类抗菌物质和水稻纹枯病菌处理对3个酶活性影响最大.     

嘧霉胺与枯草芽孢杆菌B-916协同防治梨黑斑病

室内测定28种化学药剂和枯草芽孢杆菌B-916对梨黑斑病菌的毒力,将毒力最强的化学药剂与拮抗细菌枯草芽孢杆菌B-916进行复配,探讨复配剂对梨黑斑病的室内毒力效果和田间防治效果。室内测定结果显示:28种常见化学药剂中嘧霉胺能有效抑制梨黑斑病菌菌丝生长,当嘧霉胺浓度大于或等于0.10 mg/L时,抑制率为100.00%;枯草芽孢杆菌B-916对梨黑斑病菌菌丝生长具有较强的抑制作用,抑菌圈直径达55 mm;将枯草芽孢杆菌B-916(2.00×108CFU/ml)与嘧霉胺(10 000 mg/L)复配,配比为2∶1时对病菌抑制的增效比达4.18。该复配剂稀释20倍(6.67×106CFU/ml B-916+167 mg/L嘧霉胺)对梨黑斑病的田间防治效果为58.26%,显著优于嘧霉胺(500 mg/L)和B-916(1.00×107CFU/ml)单剂。     

枯草芽孢杆菌对棉花枯、黄萎病的抑制作用研究

[目的]研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生物学特性,测定枯草芽孢杆菌对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的抑菌效果,对枯草芽孢杆菌的抑菌机理进行初步研究.[方法]菌丝生长速率法,平极对峙培养法,定期观察和显微镜法.[结果]枯草芽孢杆菌对温度和酸碱度的适应范围广,营养条件与枯黄萎病菌菌丝生长需要一致;棉花枯萎病菌培养至第7 d时,抑菌效果为88.8;,棉花黄萎病菌菌丝培养至20 d时,抑菌效果为86.5;;该菌对枯黄萎病菌具有明显的营养竞争和空间竞争作用,可以溶解致菌菌丝和导致菌丝畸形.[结论]该菌是一种适应性较强的微生物,枯草芽孢杆菌对棉花枯萎病菌和黄萎病菌具有明显抑制作用,枯草芽孢杆菌可用于新疆地区棉花枯萎病菌和黄萎病的防治.     

芽孢杆菌BJ-6的抗菌物质及其抑菌作用

芽孢杆菌(Bacillussp.)BJ-6菌株分离自北京市门头沟区杏树根际土壤,室内抑菌测定发现BJ-6菌株对苹果轮纹病(Physalospora piricola)、苹果斑点落叶病(Alternaria mali)和苹果树皮腐烂病(Valsa mali)、白菜黑斑病(A.brassicae)、番茄灰霉病(Botrytis cinerea)、茄子黄萎病(Verticillium dahliae)的病原菌均有较强的抑菌作用。对其代谢产生的抗菌物质的稳定性测定表明:抗菌物质在偏酸性和中性条件下能够耐受121℃高温处理20 min;但在偏碱性条件下不具备热稳定性,热处理后失去原来的抑菌活性。采用硫酸铵分级沉淀得到抗菌粗蛋白,其中饱和度在30%~40%之间沉淀的蛋白抗菌活性最强。紫外吸收测定显示只有具有274 nm附近吸收峰的蛋白液有抑菌活性,且抗菌粗蛋白可引起白菜黑斑病菌菌丝畸形。     

台湾相思甲醇提取物抑菌活性研究

研究台湾相思(Acacia confusa Merr.)甲醇提取物及不同提取部位抑菌活性。采用超声波辅助提取法对台湾相思成分进行提取,用菌丝生长速率法测定提取物对11种植物病原真菌的抑菌活性,用液体培养基稀释法和滤纸片法测定提取物对14种动物病原细菌的抑菌活性;采用液-液萃取法对抑菌活性成分进行初步分离,测定各萃取部位的抑菌活性。结果表明,台湾相思甲醇提取物具有广谱抑菌活性,在10.0 g/L浓度下,对8种植物病原真菌和9种动物病原细菌有抑制活性。其中对甘蓝黑斑病菌(Alternaria oleracea)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)和甘蔗凤梨病菌(Ceratocystis paradoxa)的抑菌率均达89.55%以上,对蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)的最低抑制浓度为1.0 g/L;台湾相思对植物病原真菌和动物病原细菌均有广谱抑制作用,活性部位主要在正丁醇、乙酸乙酯部位。     

不同生物源农药对西洋参主要病害的室内抑菌活性及田间防效

采用菌丝生长速率法测定12种生物农药对西洋参(Panax quiquefolium L.)主要病害病原菌的抑制作用,并进行了4种药剂对西洋参根病的田间防效试验。室内抑菌测定结果表明,嘧菌酯、多黏类芽孢杆菌、2%氨基寡糖素水剂、荧光假单胞杆菌4种农药对西洋参黑斑病菌菌落生长均有较好的抑制作用。嘧菌酯、2%氨基寡糖素水剂对西洋参疫病菌的抑制效果较好。多黏类芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌对西洋参锈腐病病原菌的抑制效果较好。田间试验结果表明,荧光假单胞杆菌250倍液对西洋参病害的田间防治效果最好,防效最高可达95.17%。     

野核桃枝枯病菌拮抗细菌的筛选及鉴定

为得到对野核桃(Juglans regia L.)枝枯病有效的生防菌株,本研究采用平板对峙培养法筛选出对野核桃枝枯病菌(Juglanconis juglandina)具有拮抗作用的细菌菌株,对其进行形态学观察和16S rDNA序列同源性分析;观察拮抗细菌对菌丝生长的影响,分析该拮抗菌株的抑菌机制。结果表明,菌株QB002对野核桃枝枯病菌(J.juglandina)的生长抑制率为88.6%,同时对苹果腐烂病菌(Cytospora mali,C.salicicola)、枣果黑斑病菌(Alternaria alternata)、李褐腐病菌(Monilinia fructicola)都有一定抑制作用。该菌为革兰氏阳性细菌,在NA培养基上单菌落呈淡黄色,形状不规则,中间有褶皱,不透明,表面不光滑。结合形态特征及16S rDNA序列,明确菌株QB002为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),该菌能使供试病原菌菌丝畸形,从而抑制其生长。     

枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因BS2在毕赤酵母中的表达

 【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69 kD,表达水平29.77 mg?L-1,水解酪素酶活力27 800 U?g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。     

花椒内生细菌Y-6抗菌蛋白抑菌活性及稳定性研究

为明确花椒内生细菌Y-6抗菌物质种类与特性,丰富生物农药开发源,采用生长速率法、硫酸铵沉淀及聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法对其抗菌物质种类、抑菌活性、最佳硫酸铵沉淀饱和度及稳定性进行研究。结果表明,菌株Y-6代谢物对番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌和梨黑斑病菌具有较好的抑菌效果,抑菌率分别为90.4%、95.2%和90.1%。抗菌物质为蛋白质,在70%硫酸铵饱和度下可完全沉淀,其对番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌的抑菌圈直径分别为24 mm和26 mm。抗菌物质在p H值4~11、温度低于80℃和紫外照射12 h后仍表现出较好的抑菌活性。综上说明,花椒内生细菌Y-6抗菌蛋白具有一定的生物农药开发应用潜力。     

狭叶坡垒枝叶粗提物抑菌活性研究

采用菌丝生长速率法,以西瓜枯萎菌(Fusarium oxysporum Schl.f.sp.cucumerirum Owen)、烟草赤星菌[Alternaria longipes(Ell.et Eu)Tisdale et Wadk]、香蕉大灰斑菌[Curvularia lunata(Wakker)Boedijin]、烟草灰霉菌(Botrytis cinerea Pers)和水稻纹枯菌(Rhizoctonia solani Kuhn)为靶标,对采自广西十万大山的16种植物的甲醇粗提物进行了生物活性筛选,结果表明,狭叶坡垒(Hopea chinensis Hand.Mass)、水茄(Solanum touvum Swartz)等7种植物粗提物对5种供试真菌均有活性,其中狭叶坡垒抑菌活性最为显著;进一步测定了狭叶坡垒石油醚萃取层、乙酸乙酯萃取层及水萃取层对玉米大斑菌(Helminthosporium turcicum Pass)、稻胡麻叶斑菌(Helminthosporium oryzae Breda de Haan)和西瓜枯萎菌(F.oxysporum Schl.f.sp)等21种供试植物病原真菌的生物活性,结果表明,5 mg/mL狭叶坡垒乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最强,对水稻恶苗菌[Gibberella fujikuroi(Saw)Wollenw]、香蕉黑条叶斑菌(Mycosphaerella fijiensis Marelet)和香蕉褐缘灰斑菌(Cercospora musae Zimm)等18种植物病原菌均有一定抑制作用,其中对烟草黑胫病菌(Phytophthora nicotianae Breda)的抑制率达100%,对香蕉叶缘枯菌(Alternaria musae Bour.et Bat)、香蕉大灰斑菌[Curvalaria lunata(Wakker)Boedijin]、甘蔗凤梨病菌[Ceratocystis paradoxa(Dade)Moreau]、甘蓝黑斑菌[Alternaria brassicola(Schw.)Wiltshire]和水稻纹枯菌(R.solani)的抑制率分别为89.00%、94.12%、90.35%、89.93%和85.13%。对烟草黑胫病菌(C.nicotianae)、香蕉叶缘枯菌(A.musae)、香蕉大灰斑菌(C.lunata)、甘蔗凤梨病菌(C.paradoxa)、甘蓝黑斑菌(A.brassicola)和水稻纹枯菌(R.solani)的EC50分别为:0.475 8,2.642 9,0.614 7,0.467 4,0.977 7,3.463 7 mg/mL。对甘蔗凤梨病菌(C.paradoxa)、甘蓝黑斑菌(A.brassicola)进行孢子萌发实验,其EC50分别为0.716 6 mg/mL、1.784 4 mg/mL。研究结果为进一步研究狭叶坡垒枝叶中的抑菌活性成分提供了基础数据。     

一株抗多种植物病害菌株的筛选、鉴定及其活性成分研究

从农田土壤中分离得到1株对多种植物病原真菌有拮抗作用的菌株Loq18,经生理生化及分子鉴定确定为一株枯草芽孢杆菌,其无菌发酵液经硫酸铵沉淀得抗菌粗蛋白.为明确此抗菌粗蛋白的理化性质,研究了温度、pH变化、UV照射、有机溶剂和蛋白酶对抗菌蛋白稳定性的影响.结果表明,该抗菌粗蛋白具有良好的热稳定性,121℃高压灭菌处理20min后仍具有对照活性的95%以上;对酸碱不敏感,在pH值4～11范围内相对稳定;对紫外线穗定,在紫外光下照射10h以上时,其活性基本不受影响;经乙醚、丙酮等有机溶剂处理后仍具有对照活性的90%以上;对蛋白酶较稳定.     

枯草芽孢杆菌G87抗菌蛋白对稻瘟病菌和稻恶苗病菌的抑制作用

为明确枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G87抗菌蛋白的生物活性,采用菌丝生长、分生孢子萌发和芽管伸长抑制的方法,研究其对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)和稻恶苗病菌(Gibberella fujikuroi)的抑制作用。结果表明:抗菌蛋白能明显抑制2种病菌菌丝生长、分生孢子萌发和芽管伸长。1.20mg·mL-1抗菌蛋白对稻瘟病菌菌落直径和菌丝干重的抑制率分别达60%和80%以上;2.40mg·mL-1抗菌蛋白对稻恶苗病菌分生孢子萌发和芽管伸长的抑制率均达60%以上。抗菌蛋白还能显著破坏2种病菌菌丝形态,使菌丝细胞畸形膨大、原生质浓缩和外渗、细胞壁破损以及菌体崩溃等。因此,枯草芽孢杆菌G87抗菌蛋白具有重要的抗菌生物活性。     

细辛对番茄早疫病菌的抑制作用及其活性成分的分离

以番茄早疫病菌为供试植物病原菌,采用生物活性追踪法和活体盆栽试验法评价了细辛提取物的抑菌活性,并探索了细辛的杀菌活性成分。结果表明:细辛氯仿粗提取物在96和48 h对供试菌的菌丝生长和孢子萌发都有较强的抑制作用。其中对菌丝生长和孢子萌发的半效应浓度EC50分别为1.69和0.41 mg/mL。细辛氯仿粗提取物经萃取分离得到的石油醚、氯仿和甲醇组分中,石油醚组分对供试菌孢子萌发具有强抑制作用,处理48 h后抑制率达到100%;但处理96 h后对菌丝生长的抑制率仅有40%。氯仿组分对供试菌的菌丝生长和孢子萌发均具有较好的抑制作用,分别为72.27%和83.42%。对氯仿组分进行硅胶柱层析分离,得到4个高活性流分,在96 h对供试菌菌丝生长的抑制率达到85%以上。在盆栽试验中,4 mg/mL细辛氯仿提取物对番茄早疫病的保护和治疗作用达70%以上,与化学农药处理无显著差异。试验显示细辛对番茄早疫病菌具有较好的防治效果。     

不同溶剂提取花椒抑菌活性物质的初步研究

以花椒4种不同溶剂的提取物为供试药剂,采用生长速率法测定其对水稻纹枯病菌(Rhi-zoctonia solani)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、大葱紫斑病菌(Alternaria porri)和棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum)的抑制作用,以期探索提取花椒抑菌活性物质的最佳溶剂。结果表明,花椒4种不同溶剂的提取物对4种植物病原菌菌丝生长都有一定的抑制作用,其中二甲苯提取物的抑菌活性相对较强,当用量为0.5mL时,其对水稻纹枯病菌、番茄早疫病菌、棉花枯萎病菌和大葱紫斑病菌的抑菌率分别为80.0%、78.7%、73.3%和23.2%;花椒乙醇和丙酮提取物的抑菌活性次之;甲醇提取物的抑菌活性相对较弱,当用量为0.5mL时,其对水稻纹枯病菌、番茄早疫病菌、大葱紫斑病菌和棉花枯萎病菌的抑菌率分别为56.1%、33.0%、23.4%和24.9%。因此,提取花椒抑菌活性物质的最佳溶剂是二甲苯。     

生防枯草芽孢杆菌CAB-1抑菌蛋白产生条件及其稳定性研究

枯草芽孢杆菌CAB-1是一株对番茄灰霉病有显著防效的生防菌株,抑菌蛋白是其产生的主要抑菌物质之一。研究表明,菌株CAB-1产生抑菌蛋白的最佳培养条件为：接种量2%,培养温度30℃,转速180 r/min,装液量100 mL/250 mL,培养时间48 h。考马斯亮蓝法测得最佳培养条件下菌株CAB-1产生的粗蛋白浓度为0.16 mg/mL。该粗蛋白对胰蛋白酶及蛋白酶K不敏感,胃蛋白酶处理使其活性降低14%;抑菌蛋白在100℃以下处理30 min活性变化差异不显著,而121℃处理30 min其抑菌活性为对照的72%。抑菌蛋白对酸碱的耐受范围广,在pH值3~12的范围内抑菌活性均能保持在75%以上,pH值2时抑菌活性降低为对照的59%。经甲醇、氯仿、乙醚、乙酸乙酯及丙酮处理后该粗蛋白的抑菌活性变化不大。     

香根草提取物对植物病原真菌的抑制作用

测定了香根草提取物对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxgsporium）和葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloesporioides）这5种植物病原真菌的抑制作用。室内抑菌试验采用菌丝生长速率法测定了石油醚和乙酸乙酯萃取物对植物病原菌的抑制作用。结果表明,两部分萃取物对上述5种病原真菌均具有较好的抑制作用,其中对水稻纹枯病菌的抑制效果最好,EC50值分别为1.844和3.470 mg·mL-1。室外盆栽试验结果显示石油醚萃取物在浓度为0.025 g·mL-1时对水稻纹枯病菌保护防治效果达到66.70%,治疗防治效果为14.16%。该研究为植物病害防治和新型植物源杀菌剂的开发提供理论基础。     

克里本类芽孢杆菌TRCC 82001抑菌活性分析及发酵条件优化

分析克里本类芽孢杆菌TRCC 82001的抑菌活性和防病效果,优化其发酵条件以提升发酵液抑菌效果。通过平板对峙试验测定拮抗菌的抑菌活性,利用不同检测平板分析其产真菌细胞壁裂解酶特性,以单因素试验筛选其最优发酵培养基和最优发酵条件,最后通过离体枝条防治试验研究其防病能力。结果表明,克里本类芽孢杆菌TRCC 82001对金黄壳囊孢菌等多种植物病原真菌均有较好的抑菌活性,抑菌带宽度范围在10.00~13.33 mm;能产生蛋白酶、β-1,3-葡聚糖酶和纤维素酶;最优发酵培养基为马铃薯葡萄糖肉汤培养基;最佳发酵条件组合为时间3 d、温度30 ℃、pH 6.0、转速180 r/min、装液量20%和接种量1%;拮抗菌在离体枝条上对杨树腐烂病的抑制效果达到100%。该研究结果为该菌株及其抑菌物质在防治植物病害方面的应用奠定了基础。