亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因的克隆表达及其间接ELISA方法的建立

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病.口蹄疫在全球范围内传播甚广,欧、亚、非和南美的一些国家和地区都曾经成为口蹄疫的重灾区.该病传染性极强,危害严重.2005年起,我国部分地区发生了亚洲Ⅰ型口蹄疫疫     

口蹄疫病毒的抗原变异与逃避免疫反应

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是1898年首次发现的病毒性动物疾病，因其发病凶猛，被国际兽医局(OIE)列为A类传染病之首。口蹄疫病原体为口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)，主要侵害家养或野生的偶蹄类动物。作为一类烈性传染病，口蹄疫不仅损害了发病国家和地区的畜牧业生产，     

口蹄疫的诊断与综合防控

口蹄疫是危害全球养殖业一种重要传染病。从口蹄疫诊断、预防和控制措施等方面对其作简单的介绍，为有效防控口蹄疫提供参考。     

口蹄疫的征候学及流行病学

口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害偶蹄兽，其临诊特征为口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。此病一旦发病极易造成大流行，世界动物卫生组织将其列为A类传染病，我国将其列为一类传染病。     

防控猪口蹄疫的关键措施——消毒和免疫

猪口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的猪等偶蹄动物多发的一种急性、热性和高度接触性传染病，由于口蹄疫病毒的复杂性，加上目前环境中的一些不可控制性，使得对该病的治疗存在很大的困难。猪口蹄疫的发病与其它传染病一样，需要传染源，传染途径，易感猪群三个要素构成，缺少任一要素，猪口蹄疫病就不会发生，根据这一原理和口蹄疫病的疫原学特点，并基于科学防疫灭病的理念是“防重于治”，必须从消灭传染源、切断传染途径，建立高免猪群人手，     

猪口蹄疫防控特辑

口蹄疫是由口蹄疫病毒感染偶蹄动物引起的一类动物的急性热性接触性传染病，患口蹄疫的动物出现高热、跛行，并在皮肤与皮肤黏膜上出现疱状斑疹等症状。     

猪口蹄疫防疫的有效策略分析

口蹄疫是一种发生率较广的传染性疾病，主要是因为口蹄疫病毒（FMDV）的传播造成，通常，猪、牛、骆驼、羊是口蹄疫的多发动物群体，口蹄疫的主要特点有传播范围广、流行性快。猪口蹄疫是发生在猪群中的一种常见传染病，只要出现猪口蹄疫，短时间内就会出现大面积的迅速扩散，死亡率很高，给养殖户造成严重损失。因此，必须做好猪口蹄疫的防疫工作，本文具体分析猪口蹄疫的有效防疫策略。     

羊亚洲Ⅰ型口蹄疫免疫程序试验

口蹄疫是哺乳动物高度接触性烈性传染病，OIE列为A类传染病之首。2005年口蹄疫亚洲Ⅰ型在中国的少数地区暴发，那么研究FMD Asia—Ⅰ免疫程序，就成为了兽医工作的当务之急。     

两种口蹄疫免疫抗体监测方法的比较

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、烈性和高度接触性传染病。国家将其列为一类传染病,口蹄疫对养殖业构成严重威胁,可造成严重的经济     

猪口蹄疫免疫方法

口蹄疫是一种急性、热性和极易接触性传播的传染病,病原为口蹄疫病毒,该病毒可感染所有偶蹄动物,猪以口腔粘膜、鼻镜、蹄部和乳房皮肤发生水泡和溃烂为特征。本病的传染性极强,传播迅速,感染和发病率很高,可引起仔猪大量死亡，造成严重的经济损失，在国际上被划分为一类烈性传染病，是当前养猪业的大敌，免疫接种是预防猪口蹄疫的重要技术手段。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及重组蛋白的纯化

利用PCR技术扩增获得C型口蹄疫病毒VP1基因,将其克隆到原核表达载体pET-30α(+)上,构建重组表达质粒pET-VP1。质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE、Western blot分析,结果得到分子量约为33 ku的目的条带,表达产物占菌体总蛋白的35%,且该目的条带能被C型FMDV阳性血清识别,说明VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达。融合表达蛋白经镍柱纯化,重组蛋白纯度达90%以上。     

甲型H1N1流感病毒血凝素基因的原核表达及用于胶体金检测方法的研究

根据GenBank公布的甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列,合成HA全长基因,构建原核表达载体pET-30 Xa/LIC-HA.阳性质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测的结果表明,HA基因获得表达,产物具有免疫学活性,分子质量约...     

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒（canine parovirus,CPV）VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPV VP2基因插入原核表达载体pET-32a（+）中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 755 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导5 h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64 ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

基因C型鸭甲肝病毒VP1基因的克隆及原核表达

为原核表达基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1重组蛋白,本研究通过设计套式PCR引物,RT-PCR扩增DHAV-C VP1全基因,约为720 bp,将其亚克隆至pET-32a(+)载体中构建重组表达质粒pET-VP1。将其转化E.coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达了约47 ku的重组蛋白。Western blot分析表明,该重组蛋白可以与兔抗DHAV-C阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

口蹄疫病毒结构蛋白基因vp1的表达与应用研究

体外克隆口蹄疫病毒vp1基因，构建重组表达载体pET28a-vp1。将此重组质粒转化到受体菌BL21（DE3）中，进行诱导表达，SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表明，诱导5h后表达量达到最高，表达产物大小约为33Ku-40Ku，表达蛋白能与口蹄疫病毒阳性血清产生特异性免疫反应。经HPLC纯化后，以重组蛋白为抗原，建立检测VP1蛋白抗体的ELISA方法，检测猪牛血清样品，免疫抗体检测结果与口蹄疫液相阻断ELISA检测结果呈正相关，能反映出免疫抗体动态变化，对临床样品口蹄疫病毒血清抗体检测，两种方法有一定相关性，但不显著。所以以重组VP1蛋白为检测抗原的ELISA方法有望用于口蹄疫免疫抗体监测。     

鹿流行性出血病病毒VP7基因的克隆及原核表达

根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体转入大肠埃希菌(E.coliLMG194),用L-阿拉伯糖诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,EHDV VP7基因在LMG194中得到了表达,其表达产物可以与EHDV阳性血清特异性反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性。     

口蹄疫病毒VP2基因的原核表达及抗原性检测

将口蹄疫病毒VP2基因连接到原核表达载体pPROEX^TM HTb上，获得重组质粒pPR-VP2。将此质粒转化感受态菌DH5α中，经终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导，1h～6h依次收集菌液，SDS-PAGE电泳分析，在4h后表达量可达到高峰。经过软件分析，表达产物占总菌体蛋白的23．1％，大小为33Ku左右。根据Ni-NTA纯化系统说明操作，获得较纯的VP2融合蛋白。以牛抗O型口蹄疫病毒血清为第一抗体，通过Western blot和Dot ELISA鉴定，纯化后的VP2融合蛋白可以与牛抗O型口蹄疫病毒血清发生特异性反应。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆、原核表达和纯化

根据GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列,设计出针对CAV VP1大片段(608 bp)的引物,利用PCR方法从CAV基因组序列中扩增出VP1基因的大片段(608 bp),按照正确的读码框克隆到原核表达载体pET32a( )上,得到含VP1大片段的pET32a( )重组子,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blotting检测发现有分子质量约42 ku的融合蛋白表达,与预期分子质量大小一致,通过Ni亲和层析柱纯化出融合蛋白,经Western blotting鉴定,融合蛋白与His单抗能够结合.CAV VP1基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化为后续制备多克隆抗体和单克隆抗体提供了良好的抗原来源,也为研究VP1与其他CAV蛋白之间的相互关系奠定了基础.     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化

参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,对CPVVP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM—T载体,获得重组质粒pGM—T—VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a—VP2,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E．coli Rosetta（DE3）中,获得了基因工程菌株E．coli Rosetta（CVP2）,并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化。结果表明纯化样品中含有87kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带。E．coli Rosetta（CVP2）以包涵体形式表达出了CPV—YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒VP1基因的表达鉴定及其多抗制备

本研究旨在表达口蹄疫病毒(FMDV)的VP1全基因并制备特异性的多克隆抗体。利用PCR方法扩增Asia 1 IND 49197株VP1全基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为31.6ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA Purification System纯化后进行western blot和间接ELISA分析,结果显示重组蛋白能够被FMD阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶20480,病毒中和试验测定抗体效价为1∶64。本研究所表达的VP1蛋白可用于开发检测Asia1口蹄疫抗体的诊断试剂,所制备的多克隆抗体为进一步研究VP1的结构、功能以及抗原表位的鉴定提供了条件。