烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的半巢式RT-PCR检测

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)是我国禁止入境的检疫性有害生物。采用半巢式RT-PCR方法对这两种病毒进行了检测,用Trizol快速提取病毒总RNA,并根据TRSV和ToRSV的外壳蛋白基因设计特异性引物,经过第一轮RT- PCR和第二轮半巢式PCR扩增,TRSV样本分别得到359 bp和206 bp特异性片段,ToRSV样本分别得到340 bp和219 bp特异性片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,TRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在88%～97%的同源性,ToRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在96%～100%的同源性。研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,而半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这两种方法高出10~3倍以上。     

4种大豆种传病毒多重RT-PCR检测

进境大豆携带的病毒主要有菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、烟草条纹病毒(TSV)和南方菜豆花叶病毒(SBMV)等,均为大豆种传病毒,可随大豆种子实现远距离传播。本研究对这4种大豆病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物,并通过优化引物、模板浓度和扩增参数,在一个体系中成功对4种病毒进行了多重RT-PCR扩增,得到307bp、206bp7、17bp5、18bp共4条特异性条带,建立了能同时检测BPMV、TRSV、TSV和SBMV的多重RT-PCR检测体系。该方法快速、灵敏、简便,同时特异性强,在出入境检疫中具有广泛的应用前景。     

葡萄的两种检疫性病毒的多重RT-PCR检测

 本研究利用多重RT-PCR技术,对葡萄的检疫性病毒中番茄环斑病毒(ToRSV)和烟草环斑病毒(TRSV)进行检测,并研究了反应体系中各个参数对多重RT-PCR的影响。结果表明:可以在同一反应体系中实现对ToRSV和TRSV的RT-PCR检测,但模板浓度、引物浓度、循环数等3个因素对检测结果的准确性有较大的影响,3个参数的增加都会导致非特异性扩增的增多,而dNTP以及Taq酶的浓度对实验结果并无较大影响。     

逆转录环介导等温扩增技术检测烟草环斑病毒的研究

 本研究采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP),建立了一种快速、简便的烟草环斑病毒检测方法。根据TRSV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的梯度条带。特异性试验表明,引物对TRSV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比普通RT-PCR高10倍。通过反应温度和时间的优化,该方法只需在水浴锅中60℃等温扩增60 min,整个检测周期约1.5 h,结果采用SYBR green I染色显示,易于观察和判定。     

大麦条纹花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus（BSMV）是我国进境植物检疫性有害生物。为提高大麦条纹花叶病毒检测的灵敏度和特异性,缩短检测周期,根据该病毒不同分离株外壳蛋白（coat protein, CP）基因的保守序列设计特异性的引物和探针,建立了BSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,本检测方法特异性强,对南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus（SBMV）、小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus（WSMV）、玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus（TRSV）、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus（BPMV）和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus（ToRSV）6种病毒均无交叉扩增;且检测方法灵敏度高,对RNA模板的最低检测限达到5×10-4 ng/μL,与双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）和普通RT-PCR相比,本方法的灵敏度分别提高了10倍和100倍。此外,我们利用该方法对12批进口大麦进行检测,发现6批大麦中检出大麦条纹花叶病毒,占比约50%。总之,本研究建立的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强等优点,适合于BSMV的快速检测。     

单管多重RT-PCR同时检测大豆种子中三种检疫性植物病毒

我国大豆年进口量持续增长,快速、准确地检测进境大豆种子中可能携带的病原物是防止检疫性有害生物入境传播和扩散的有效手段。菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、烟草环斑病毒(TRSV)和番茄环斑病毒(ToRSV)均是被大豆种子携带的检疫性有害生物。本研究建立了在单一PCR管中同时检测这3种检疫性植物病毒及大豆内源基因Bd-30K的多重RT-PCR方法。研究结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有较好的特异性和灵敏度,检测含BPMV、TRSV和ToRSV RNA的最低浓度分别为0.45、0.0093和0.004ng/μL,从大豆种子中同时检测3种病毒的最低RNA浓度为0.58ng/μL。     

侵染唐菖蒲和百合3种病毒的多重RT-PCR检测方法

本文针对侵染百合和唐菖蒲的南芥菜花叶病毒、百合无症病毒和菜豆黄花叶病毒,建立了同时检测3种病毒的多重RT-PCR检测方法.该方法根据上述3种病毒保守的衣壳蛋白基因序列,设计特异性引物,优化了反应条件.通过对9种不同寄主和6种病毒的检测,验证该检测方法具有很高的特异性、稳定性,其灵敏度为植物总RNA稀释101～102倍.特别是,该方法缩短了检测周期,适合于植物病毒快速检测工作的需要.     

利用实时荧光RT-PCR方法检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒

根据番茄环斑病毒和烟草环斑病毒各分离物CP基因的保守序列分别设计并合成1对引物和1条TaqMan荧光探针,分别建立了ToRSV和TRSV的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法具有更加灵敏、特异、快速和简便的特点,在口岸病害检疫中具有广泛的应用前景。     

单管实时荧光RT PCR方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒

 本研究建立了大豆种子中菜豆荚斑驳病毒（BPMV）和烟草环斑病毒（TRSV）单管双重实时荧光PCR检测方法。将含有相同浓度的分别带有BPMV和TRSV CP基因的质粒溶液作为阳性对照,以受两种病毒侵染的大豆种子作为待测样品进行实时荧光PCR检测,结果表明能从同一管中同时检测出这两种病毒而不发生交叉反应。尽管在阳性对照中,二者的检测限相当,均可达到35 pg/mL,但在实际应用中,两种病毒由于在大豆种子中的浓度不一致而存在一定的差别。该方法快速、灵敏、简便,同时特异性更强,在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。     

利用Real-time RT-PCR方法检测苹果中苹果茎沟病毒

以含有苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)的苹果枝条为试材,设计扩增产物片段为176 bp的特异性引物,优化反应条件,构建标准曲线,建立了苹果茎沟病毒的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法.对该方法进行了灵敏度和重复性试验,并且利用建立的方法对受ASGV感染的苹果枝条和树叶进行定量检测.最后,比较了实时荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测的灵敏度.结果表明:样品的荧光定量PCR有良好的扩增曲线和溶解曲线,该方法的灵敏度可达6.8× 102拷贝/μL,检测其灵敏度是传统RT-PCR的100倍,所建立的荧光定量技术可用于田间样品中此病毒的检测,丰富了ASGV的检测手段,提高了检测灵敏度,具有较好的应用前景.     

<Emphasis Type="Italic">Tobacco ringspot virus</Emphasis> persists in the shoot apical meristem but not in the root apical meristem of infected tobacco

We analysed the kinetics of virus distribution in Tobacco ringspot virus (TRSV)-infected tobacco. Infected plants developed asymptomatic leaves above the symptomatic leaves that exhibited ringspots. We detected virus in the shoot apical meristem (SAM). Time-course immunohistochemical microscopy showed that TRSV continuously distributed in the centres of the SAM and in leaf primordia. In contrast, TRSV infection was transient in the root meristem. In western blot and RT-PCR analyses, TRSV infection occurred only within and around the ringspot tissues of the symptomatic leaf; however, TRSV was not or hardly detected in the asymptomatic leaves of inoculated tobacco plants. These results indicate that TRSV persists in the SAM, but that TRSV infection is transient in the root meristem and asymptomatic leaves.     

电化学酶联免疫分析检测烟草花叶病毒和烟草环斑病毒

以邻苯二胺 (OPD)底物为例 ,用抗原直接包被法 (DAC -ELISA)同线性扫描极谱法 (LSV)相结合 ,检测烟草花叶病毒 (TMV)的提纯液 ,检出限可达 0 2 5ng/ml,TMV粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 2 4 0 0 ;检测烟草环斑病毒 (TRSV)提纯液 ,检出限为 1 0ng/ml,粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 0 0 0 ,该方法的灵敏度比DAC -ELISA光度法提高了 5倍以上     

烟草环斑病毒PCR产物的克隆及部分序列分析

将ＴＲＳＶ的ＰＣＲ产物与ｐＧＥＴ－ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ连接,克隆到大肠杆菌ＴＧ１中,得到白色菌落,重组质粒通过酶切鉴定、ＰＣＲ扩增和部分序列分析,表明ＴＲＳＶ的ＰＣＲ产物确实插入了质粒,并已克隆到大肠杆菌中,测序列２４０个碱基,与资料显示的序列相比较,同源性达９２．５％,可用于解决病毒检疫应用中阳性对照有扩散危险的疑难问题。     

Localization of Transmissible and Nontransmissible Viruses in the Vector Nematode Xiphinema americanum

ABSTRACT The inner lining of the food canal of nematodes that transmit plantinfecting viruses is regarded as the retention region of viruses. To characterize the location of transmissible and nontransmissible viruses in the vector nematode Xiphinema americanum, three nepoviruses, Tobacco ringspot virus (TRSV), Tomato ringspot virus(TomRSV), and Cherry leaf roll virus(CLRV), and one non-nematode-transmissible virus, Squash mosaic virus (SqMV), were evaluated for transmission efficiency and localization sites in the nematode. Transmission trials showed highest transmission efficiency for TomRSV (38% with 1 and 100% with 10 nematodes, respectively), intermediate efficiency for TRSV (27% with 1 and 65% with 10 nematodes, respectively), and no transmission for CLRV and SqMV. Electron microscopy and immunofluorescent labeling revealed that TRSV was primarily localized to the lining of the lumen of the stylet extension and the anterior esophagus, but only rarely in the triradiate lumen. Within a nematode population, particles of TRSV were no longer observed in these three regions 10 weeks after acquisition, and it is assumed that there was gradual and random loss of the virus from these areas. The percentage of nematodes that were labeled by virus-specific immunofluorescent labeling in a population of viruliferous nematodes decreased gradually after TRSV acquisition when the nematodes were placed on a nonhost of the virus, and the loss of immunofluorescent labeling paralleled the decrease in the ability of the nematode population to transmit the virus. TomRSV was localized only in the triradiate lumen based on thin-section electron microscopy. No virus-like particles were observed in any part of the food canal of nematodes that had fed on CLRV-infected plants. Virus-like particles that appeared to be partially degraded were observed only in the triradiate lumen of nematodes that had fed on SqMV-infected plants. These results clarified the status of localization of two nontransmissible viruses in X. americanum and presented evidence that two nematode-transmissible viruses, TRSV and TomRSV, are localized in different regions of the food canal of X. americanum.     

番茄褐色皱果病毒SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用

根据番茄褐色皱果病毒（tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）外壳蛋白（coat protein,CP）的保守基因序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I的ToBRFV实时荧光RT-PCR检测方法,并对其进行了特异性、灵敏度检测,对自然感染ToBRFV的番茄、辣椒种子进行了检测验证。结果表明,构建的实时荧光RT-PCR检测ToBRFV阳性的番茄种子总RNA和重组质粒标准品的检测低限分别为0.2 ng/μL和50.0拷贝/μL,均为普通RT-PCR检测灵敏度的100倍;对番茄花叶病毒（tomato mosaic virus,ToMV）、番茄环斑病毒（tomato ringspot virus,ToRSV）、番茄黑环病毒（tomato black ring virus,TBRV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus,TSWV）、辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和烟草环斑病毒（tobacco ri...