鲤疱疹病毒Ⅱ型主要免疫原性蛋白的鉴定

为了鉴定CyHV-2的主要免疫原性蛋白,本研究用分离的CyHV-2-YC-1分离株(下简称CyHV-2)感染异育银鲫尾鳍细胞系(GiCF),用蔗糖密度梯度超速离心法对细胞感染液中的CyHV-2进行纯化,纯化后的CyHV-2病毒免疫小鼠制备抗CyHV-2多克隆抗体。纯化的病毒颗粒经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色后,用抗CyHV-2多克隆抗体进行Western blotting分析和质谱鉴定。结果显示,透射电镜下观察发现50%～66%的蔗糖梯度多见完整囊膜包裹的CyHV-2病毒颗粒,也有少量囊膜破损的病毒颗粒。Western blotting结果显示,抗CyHV-2多克隆抗体与多种病毒蛋白具有特异性免疫反应,质谱鉴定显示,其中8种主要免疫原性蛋白分别是ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132。研究表明,通过蔗糖密度梯度超速离心法提纯CyHV-2病毒颗粒后,本研究制备的抗CyHV-2多克隆抗体能够特异性识别CyHV-2病毒的主要免疫原性蛋白。本研究将为CyHV-2免疫学检测方法的建立以及疫苗的研制提供更多...     

鲤疱疹病毒2型武汉株的分离与鉴定

采用细胞培养、超薄切片电镜观察、巢式PCR检测以及病毒DNA克隆与测序分析等技术, 从湖北武汉一循环水养殖系统中患出血病异育银鲫(Carassius auratusgibelio)体内分离鉴定了一株鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)病毒, 命名为鲤疱疹病毒2型武汉株(CyHV-2-WH)。患病鱼组织匀浆液接种锦鲤鳍条细胞系(Koi-Fin)可产生典型的细胞病变效应。用患病鱼组织匀浆液与细胞培养物分别人工感染异育银鲫, 均可重复出与自然发病相同的症状, 死亡率达100%。患病鱼脾与肾脏组织超薄切片电镜观察结果显示, 病毒为具囊膜的球形病毒, 囊膜直径为170~200 nm, 病毒衣壳直径为110~120 nm, 病毒在细胞核内复制、组装。采用CyHV-2的特异引物对病鱼样本和感染细胞培养物样本进行巢式PCR检测, 均能扩增出357 bp的目的条带, 将该扩增产物进行测序与比对分析后发现, 其与GenBank中已报道的CyHV-2毒株的DNA解旋酶基因高度同源(99.44%以上), 与鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)也有较高的同源性(81.55%)。系统进化分析结果显示, CyHV-2-WH株与JS2012、H.Fukuda、YC110907等CyHV-2病毒株属同一分支。

     

鲤疱疹病毒3型ORF136基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

为了对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)ORF136基因编码蛋白进行功能研究和血清学诊断,本实验通过对ORF136基因推导的第31~157位氨基酸序列进行PCR扩增,并与原核载体pET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备ORF136多克隆抗体,运用Western blot和间接免疫荧光技术对抗体进行鉴定。结果表明,重组融合表达蛋白大小与预期一致,约为35 kD,且主要分布在包涵体中。Western blot分析显示,免疫兔后获得的纯化ORF136多克隆抗体能特异性识别纯化的CyHV-3和感染CyHV-3的KS细胞;间接免疫荧光分析进一步表明ORF136多抗能识别感染CyHV-3的KS细胞。ORF136多克隆抗体的制备为ORF136蛋白功能研究和CyHV-3血清学诊断方法的建立提供了重要基础。     

四川地区一株锦鲤疱疹病毒的分离鉴定及系统进化分析

2015年5月,四川某鲤养殖场暴发一种传染性疾病,导致鲤大面积死亡,死亡率高达80%。为研究此次疾病病因和流行规律,将病料进行解剖、细菌学检查、病理组织观察、PCR鉴定、病毒分离和系统进化分析。结果显示,发病鱼眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑,病鱼鳃严重坏死,肾脏肿大。细菌检查为阴性。组织病理学观察,病变最明显的是鳃和肾脏。病鱼鳃丝血管扩张充血,鳃小片呼吸上皮细胞肿胀、脱落。鳃丝基部的上皮细胞大量增生,层次增多。肾小管上皮细胞组织结构紊乱,细胞肿胀,管腔变狭小,有崩裂和坏死现象。提取病鱼的肾脏和鳃组织DNA为模板,针对世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的Sph基因进行PCR检测,出现特异性扩增产物。将病鱼的肾脏和肝脏组织研磨过滤灭菌后,腹腔注射20尾健康鲤,实验组表现为急性死亡(累积死亡率为90%),出现与自然发病鱼相同的症状。将组织匀浆接种到普通鲤脑细胞系(CCB),盲传3代后可稳定地观察到典型的细胞病变。细胞培养物染色超薄切片电镜观察结果显示,病毒为有囊膜的球状,病毒粒子直径为180~200 nm。对分离株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲1型毒株。本研究首次报道我国西南地区养殖鲤中KHV感染引起大面积死亡,为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供重要依据。     

锦鲤疱疹病毒天津株的分离与鉴定

为分析近年来天津地区养殖鲤(包括锦鲤)暴发性死亡的病因,利用病原菌分离、细胞培养、电镜观察、组织病理切片、人工感染实验、PCR和荧光定量PCR检测、基因分型等方法对患病鱼及病原进行了研究。结果显示,在患病鱼体表未发现大量寄生虫;在肝、脾、肾等内脏组织中未能分离到细菌;在鳃组织中发现大量的圆形病毒颗粒;使用患病鱼组织滤液感染锦鲤鳍条原代细胞,可观察到典型的细胞病变效应(CPE),注射患病鱼组织滤液和产生病变的细胞上清液可分别导致健康锦鲤93.3%和86.7%的死亡率;通过病理组织切片观察,主要病变组织为鳃、肝脏和肾脏。采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测方法进行PCR检测发现KHV呈阳性,且KHV在鳃组织中含量最高,肾脏次之,脑组织中最少。结合TK基因全长序列建立系统进化树和基因型分析,证实此次分离到的KHV为亚洲型毒株,属于I++II–基因型,将其命名为KHV-TJ1601株。这是我国华北地区首次报道KHV I++II–基因型的存在,可为KHV的进化分析和疫苗制备提供基础资料。     

锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定

2013年4月,广东省一锦鲤养殖场暴发不明病因疾病,濒死锦鲤在塘边游动缓慢直至死亡,死亡率高达100%。现场采样发现,发病锦鲤体长25 cm,眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑点,解剖发现内脏器官包括肝、脾、肾肿大。细菌分离结果显示,内脏器官肝脏和肾脏中未分离到细菌。提取自然发病鱼的肝、脾、肾、鳃组织DNA作为模板,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测引物进行PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物。NCBI的Blast搜索结果显示,扩增序列与KHV胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因核苷酸序列同源性为99%。病鱼内脏组织研磨过滤除菌后,腹腔注射20尾锦鲤,可复制出与自然发病相似的症状,并于7 d内全部死亡。取病鱼的鳃和肾脏研磨过滤除菌后进行细胞感染实验,结果显示,组织滤液感染CCB细胞后,盲传5代可以观察到典型的细胞病变效应(CPE)。将出现典型CPE的CCB细胞进行超薄切片制备和电镜观察,电镜下病毒呈对称20面体,直径约100 nm。将出现典型CPE的细胞进行间接免疫荧光实验,可以观察到特异性荧光。根据TK基因全长序列建立系统进化树,证实该毒株为KHV亚洲型毒株,暂命名为KHV-GZ1301株。研究结果可为KHV起源进化、分类以及疾病防控提供重要材料。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66基因DNA疫苗载体的构建及其免疫效果

鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)能够引起鲫大量死亡,严重威胁我国水产养殖业的健康发展,目前,针对CyHV-2尚无有效的商业化疫苗或治疗措施。为构建CyHV-2DNA疫苗,本研究将其衣壳蛋白ORF66编码基因克隆至pVAX1真核表达载体上,构建重组质粒pVAX-ORF66。此外,在BL21(DE3)pLysS中对ORF66蛋白进行了原核表达,表达蛋白经纯化后免疫新西兰白兔制备了ORF66特异性抗体。酶联免疫吸附(ELISA)检测显示,制备抗体效价达1∶20000以上。将pVAX-ORF66质粒转染金鱼脑细胞系(GFB),利用制备的ORF66抗体进行间接免疫荧光(IFA)检测,结果显示,ORF66蛋白可以在细胞中大量表达,且主要定位于细胞质中。将pVAX-ORF66质粒肌肉注射鲫后进行CyHV-2免疫保护实验,结果表明,其相对免疫保护率达55.6%。本研究针对CyHV-2构建了一种制备简单、成本低廉的DNA疫苗,为鲫造血器官坏死病的免疫预防及感染分子机制研究奠定了前期实验基础。     

锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定

鲤疱疹病毒3型(cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)囊膜蛋白ORF65基因全长1 785 bp,编码594个氨基酸。该研究在稀有密码子分析及信号肽与跨膜结构预测的基础上,将pORF65中的N端信号肽与C端跨膜区段删除后进行密码子优化与基因合成,将合成的截短 ORF65 (truncated ORF65) 插入pET32a (+)载体,构建了pET32a-trunORF65;进一步采用DNAstar、ABCpred、BepiPred 1.0软件预测了pORF65的5个B细胞表位优势区段,以合成的截短ORF65为模板,通过SOE-PCR将5个B细胞表位优势区段编码序列融合后插入pET32a (+)载体,构建了pET32a-modORF65。重组质粒分别转入BL21 (DE3)菌株,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot分析,pET32a-modORF65获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为56.4 kD。此外,利用rProtein G亲和层析纯化了锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)血清IgM,免疫小鼠,制备了鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体。在上述研究的基础上,将纯化的pORF65作为包被抗原,鼠抗锦鲤IgM多克隆抗体作为检测抗体,建立了间接ELISA方法,该方法可以检测pEGFP-ORF65 DNA疫苗免疫锦鲤后产生的特异性抗体。     

鲤疱疹病毒3型ORF148 DNA疫苗对建鲤鱼苗的免疫保护

鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV),是一种高传染性、致死性病毒。为开发新型CyHV-3 DNA疫苗,前期研究中将CyHV-3 ORF148基因插入pEGFP-N1构建重组质粒,在此基础上,本研究通过转染试验、间接免疫荧光试验证实pORF148-EGFP融合蛋白可以在CCB-J细胞系和建鲤体内表达;将重组质粒作为DNA疫苗,肌肉注射免疫建鲤鱼苗,ELISA检测表明免疫pEGFP-ORF148重组质粒可以显著提高建鲤血清特异性抗体水平; RT-qPCR检测显示,免疫pEGFP-ORF148重组质粒后,建鲤脾脏和头肾中的免疫相关基因如IFN-a1、Mx-1、CXCa、CXCR1、TNF-α、IL-1β及IgM基因表达量均显著提高。攻毒实验显示, CyHV-3攻毒21 d后, PBS组、pEGFP-N1组和pEGFP-ORF148组的建鲤存活率分别为30%、35%和85%,免疫pEGFP-ORF148可以显著提高建鲤的存活率(P0.01)。本研究旨在为CyHV-3 DNA疫苗的应用提供理论依据。     

四川地区养殖鲫鲤疱疹病毒Ⅱ型的鉴定及病理学研究

为探究疾病病因和流行特点,对患病鲫进行剖检、病理学观察、分子生物学检测及人工感染实验。结果显示,患病鲫临床表现为离群独游、浮头、全身发黑及体表出血等。剖检发现鳃、肝脏、肾脏等器官出血、肿胀和坏死,鳔点状出血。组织病理观察显示,鳃呼吸上皮细胞肿胀、坏死及脱落;肾脏局灶性坏死;脾脏组织广泛变性坏死,造血系统崩解;肝脏发生空泡变性和坏死。透射电镜观察到脾脏和肾脏中存在4种大小不同的病毒颗粒,分别为DNA病毒内核、空衣壳、实心衣壳和有包膜的成熟病毒粒子。未成熟的病毒粒子存在于细胞核,成熟的病毒粒子存在于细胞质。电镜下可见鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)在细胞核内完成核酸复制和核衣壳装配,囊膜蛋白在出核后获得。细胞核萎缩、核染色质边缘化,线粒体肿胀、坏死、嵴断裂,细胞质空泡化。取患病鲫组织匀浆滤菌后接种到鲤上皮瘤细胞系(epithelioma papulosum cyprinid cell line,EPC)和胖头鲤肌肉细胞系(fathead minnow cell line, FHM),盲传3代后未见细胞病变。通过腹腔注射患病鲫组织匀浆进行人工感染实验,实验组鲫表现出与自然感染鲫相同的临床症状,...     

Identification of novel immunogenic proteins of Vibrio alginolyticus by immunoproteomic methodologies

Vibrio alginolyticus is one of the most serious diseases in cultured marine and freshwater fish and shellfish. The absence of suitable vaccine or virulent marker can be the bottleneck to control V. alginolyticus infection. In this study, immunoproteomic approaches were undertaken to study the immunogenicity of the whole‐cell protein of V. alginolyticus HY9901. The whole‐cell proteins were analysed by two‐dimensional gel electrophoresis and subsequent immunoblotting using the rabbit anti‐V. alginolyticus HY9901 serum. A total of 55 immunogenic proteins were identified by immunoproteomic analysis. Of the 55 proteins, 51 are specific immunoreactive proteins and four are nonspecific immunoreactive proteins. Furthermore, outer membrane protein N (spot 2) was used as immunogens to immunize Epinephelus coioides for investigation of protective abilities and activities. The E. coioides immunized with OmpN has abilities to fight against infections caused by V. alginolyticus. The other novel immunogenic proteins may be developed as alternative antigens for further study of V. alginolyticus vaccine and diagnostics. These data show that immunoproteomics methods can be successfully applied in identifying immunogenic proteins of V. alginolyticus, which helps to search for the protective antigens in future.     

Identification of immunogenic proteins within distinct molecular mass fractions of Flavobacterium psychrophilum

Flavobacterium psychrophilum is the aetiological agent of bacterial coldwater disease (CWD), and this pathogen has large economic impacts on salmonid aquaculture worldwide. Previously, it was demonstrated that high levels of protection against F. psychrophilum challenge were conferred to rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), by immunization with distinct molecular mass fractions of the bacterium, and specific antibodies were correlated with protection. In this study, an immunoproteomic analysis of F. psychrophilum was performed using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting with serum from fish immunized with high- and mid-molecular mass fractions of the bacterium. Mass spectrometry was used to determine the protein identity, and 15 immunogenic proteins were positively identified following Mascot searches of the F. psychrophilum genome. Based on known function and immunogenicity of homologous proteins in other bacterial pathogens, antibodies specific for several of the identified proteins may be important for protective immunity from CWD. These include outer membrane protein OmpA (P60), trigger factor, ClpB, elongation factor G, gliding motility protein GldN and a conserved hypothetical protein. This work increases the understanding of the protective humoral immune response of rainbow trout against these distinct molecular mass fractions of F. psychrophilum and provides new potential targets for recombinant protein vaccine development.     

鲤疱疹病毒2型和3型三重PCR检测方法的建立与应用

鲤疱疹病毒2型和3型主要感染鲫(金)鱼(Carassius auratus)、鲤鱼(Cyprinus carpio)和锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)及其杂交种,具有高度的传染性和致病性,对养殖鲤科鱼类危害严重。为了建立快捷、高效且能同时检测这2种类型鲤疱疹病毒的检测技术,本研究根据鲤疱疹病毒的DNA聚合酶基因(2、3型)、解旋酶基因(2型)和胸苷激酶基因(3型)的保守序列,设计了3对特异性引物,通过对三重PCR的反应条件进行优化,建立起鲤疱疹病毒2型和3型三重PCR检测方法,并运用该方法对实验室保存的鲫鱼和鲤鱼组织样品进行检测。结果显示,该三重PCR检测方法仅在鲤疱疹病毒阳性样品中扩增出3条特异性条带,表现出良好的特异性;以克隆的目的基因质粒为模板,进行10倍梯度稀释,该检测方法能检出的极限值为2.85×102 copies/μL,表现出较高的灵敏性;运用该方法检测122份鲫鱼和60份鲤鱼样品,其结果与运用国家标准(GB/T 36194-2018)和行业标准(SC/T 7212.1-2011)方法检测的结果一致。本研究表明,构建的三重PCR检测方法不仅具有较高的准确性和灵敏度,还能同时检测2种类型的鲤疱疹病毒,有效提高检测效率。     

First detection of Cyprinid Herpesvirus 2 (CyHV‐2) in goldfish (Carassius auratus) in France

Massive mortalities of Carassius auratus (L.) occurred in a farm in France during summer 2014. Fish presented anorexia, loss of scales and large amounts of mucus on the gills. Necrosis of the distal tip of the filament and the lamellae, combined with fusion of the lamellae, was observed, as well as necrosis in the hematopoietic organs and in the digestive tract. The histological examination led to hypothesize the implication of a virus in the mortality. The presence of cyprinid herpesvirus 2 (CyHV‐2) in dead fish was demonstrated by amplification and sequencing of portions of the DNA polymerase and helicase genes, both sequences exhibiting 100% identity with CyHV‐2 from Japan. In an attempt to find genetic markers of variation, two regions containing tandem repeats in the Japanese genome were amplified from a virus‐positive sample from the present outbreak. A first region (mB) was fully identical to the Japanese isolate. However, the second region (mA) exhibited a range of deletions and substitutions compared to CyHV‐2 from Japan. This is the first report of CyHV‐2 in France in association with mortality of goldfish and the first identification of a molecular marker for its tracing.