长鳍吻免疫因子基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异

根据鲤科鱼类同源序列设计并合成了长鳍吻(Rhinogobio ventralis)应激因子HSP70、抗体IgM、抑炎性因子IL-10和促炎性因子IL-1b基因特异引物,以长鳍吻皮肤组织总RNA为模板,RT-PCR扩增获得长度分别为412、463、520和217 bp的上述4种免疫因子基因cDNA部分序列。同时通过RT-PCR比较患小瓜虫病长鳍吻和对照组长鳍吻皮肤和肠道组织中各免疫因子的表达差异,结果显示:在皮肤组织中,IgM和IL-10在感染组鱼体中表达量显著高于对照鱼(P<0.05),HSP 70和IL-1b的表达则没有差异;在肠道组织中,IgM、IL-10和IL-1b在感染组鱼体中表达量显著增高,HSP 70的表达量没有差异。本研究首次对长鳍吻的免疫因子进行了分析,指出免疫因子IgM和IL-10在鱼体中免疫应答反应中较为灵敏,为养殖过程中长鳍吻应激监测方面奠定了理论基础。     

长鳍吻鮈性腺发育的初步观察

采用常规石蜡切片技术对野生长鳍吻鮈(Rhinogobio ventralis(Sauvage et Dabry))性腺进行了组织学观察,描述了其各类型生殖细胞形态及卵巢、精巢的分期特征。结果显示:长鳍吻鮈卵巢为细线状或扁条状,精巢为细线状或直棍状;卵细胞发生经历了卵原细胞、初级卵母细胞和次级卵母细胞3个阶段,精细胞发生经历了精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及精子5个阶段;性腺发育分为6个时期,卵巢中第Ⅱ时相晚期至Ⅲ时相早期的初级卵母细胞中出现核仁外排现象;同一时期卵巢中存在多种时相的卵母细胞,故推测其卵巢发育类型为部分同步型,精巢为小叶型结构。     

草鱼HSP70基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异

根据鲤热休克蛋白70(Heat shock protein,HSP70)序列(AY120894)设计并合成一对引物,以草鱼(Cteno-pharyngodon idella)肝胰脏组织总RNA为模板,RT-PCR扩增获得草鱼HSP70基因cDNA部分序列,并进行了组织表达差异性研究。结果显示:所获为序列为480 bp,获得GeneBank登陆号为FJ483832。序列测序结果显示,HSP70扩增序列与鲤、斑马鱼、鲋的同源性为:93%、91%、93%。另外,所获序列HSP70在草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、粘液、性腺、鳔、肝胰脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12个组织的表达存在差异,HSP70在草鱼这12个组织中均检测到表达,其中在鳍中表达最高,极显著高于其他组织(P<0.01);在鳔中表达次之,且与脑、心脏、性腺中表达差异不显著;在粘液中表达最低。     

草鱼HSP90基因cDNA序列克隆及其组织表达差异

根据斑马鱼HSP90(Heat shock protein)序列(NM_131328)设计并合成一对引物,提取草鱼肝脏组织总RNA,RT-PCR扩增获得草鱼HSP90基因cDNA部分序列596 bp,获得GenBank登陆号为FJ517554.将测序结果利用DNAman软件与其他几种已知序列的鱼进行比对,结果表明,草鱼HSP90与斑马鱼、鲤、鲋的同源性依次为90%、89%、92%.同时利用半定量(Semi-quantitative,SQ)RT-PCR技术检测HSP90在草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、粘液、性腺、鳔、肝脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12个组织的表达差异.结果表明,HSP90在草鱼除了鳍外的其他11个组织中均检测到表达,其中在心脏中表达最高,但与鳃、性腺、脑、脾脏中的表达无显著差异(P>0.05),在脂肪、粘液、鳔组织中的表达显著低于其他几种组织(P<0.05),在肝脏、肌肉与肠中的表达无显著差异(P>0.05).     

基于循环水养殖系统的长鳍吻鮈亲鱼培育、催产和孵化技术初探

2012—2015年,采用室内循环水养殖系统开展了长鳍吻鮈(Rhinogobio ventralis)亲鱼培育、人工催产和孵化技术研究。结果显示:3年间长鳍吻鮈均能在循环水养殖系统中培育成熟,2014年5月—2015年4月间培育存活率和成熟率最高,分别为85.3%~100%和77.3%~100%;对培育成熟的亲鱼进行了4种不同外源激素(PG、HCG、LRH-A2、LRH-A2+DOM)催产实验,结果为LRH-A26μg/kg+DOM 5 mg/kg合剂催产率最高,达88.3%;14、16、18、20和22℃5个温度组的受精卵孵化实验结果显示,孵化时间(H)与温度(T)呈显著负相关关系(H=0.573T2-30.393T+418.178,R2=0.982,P0.01),18℃和20℃组的孵化率分别为54.27%和56.07%,显著高于其他各组,表明长鳍吻受精卵适宜孵化温度范围为18~20℃。     

长江干流长鳍吻鮈(Rhinogobio ventralis)繁殖生物学

2012年3月-2014年12月对长江上游宜宾江段采集的521尾野生长鳍吻(鱼句)进行了繁殖生物学研究.结果显示,长鳍吻(鱼句)种群雌雄比为1.41∶1,繁殖期为3-5月,盛期为4月上旬至5月上旬.繁殖季节可通过吻端细小“珠星”鉴别雌雄,雄鱼最小性成熟年龄为2+龄,最小成熟体长为173 mm,体重为90.4 g,成熟系数为0.36％;雌鱼最小性成熟年龄为3+龄,最小成熟体长为185 mm,体重为119.6 g,成熟系数为11.30％.繁殖群体中,雌性优势龄组为3+龄,雄性优势龄组为2+龄和3+龄.统计结果显示,长鳍吻(鱼句)绝对繁殖力(F)为16399-39835(26816±7875)粒/尾,体重相对繁殖力(FW)为162-234(189±23)粒/g,体长相对繁殖力(FL)为877-1659(1231±246)粒/cm.通过对性腺成熟系数、卵径分布频率以及性腺组织切片结果的综合分析认为,长鳍吻(鱼句)属于完全同步产卵类型.     

双须骨舌鱼卵黄蛋白受体基因(vtgr)组织表达及生物信息学分析

为探究卵黄蛋白受体(Vitellogenin receptor,Vtgr)在双须骨舌鱼性腺发育的作用及组织表达规律,本研究运用RACE技术首次克隆获得双须骨舌鱼vtgr cDNA全序列,该序列全长为2 841 bp,开放阅读框(ORF)为2 556bp,编码氨基酸851个,5'端非编码区26 bp,3'端非编码区258 bp。生物信息学分析显示,vtgr蛋白分子质量为93.6 ku,等电点为4.78,含有8个低密度脂蛋白受体A结构域(LDLa),5个低密度脂蛋白受体YWTD结构域(LY),2个类表皮生长因子结构域(EGF),1个钙结合类表皮生长因子结构域(EGF-CA),1个跨度为23个氨基酸的跨膜结构域,属于极低密度脂蛋白受体(vldlr),是亲水性跨膜蛋白。多序列比对分析表明,双须骨舌鱼vtgr高度保守,与美丽硬仆骨舌鱼(Scleropages formosus)相似度最高为95.96%。系统进化树分析发现,与美丽硬仆骨舌鱼聚为一支,与鲽形目、鲤形目、鲑形目亲缘性较远。qRT-PCR结果分析发现,双须骨舌鱼vtgr在雌雄鱼的8个不同组织中均有表达,在卵巢和精巢中的相对表达量显著高于鳃、肝、脾、心脏、头肾、脑等组织(P0.05)。此外,vtgr在雌雄鱼性腺发育Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期表达分析表明,在卵巢中vtgr相对表达量依次递减,且Ⅱ期显著高于Ⅲ和Ⅳ期(P0.05);精巢中3个时期vtgr表达无显著差异(P0.05),但Ⅱ和Ⅲ期表达量显著低于卵巢(P0.05)。研究表明,vtgr基因编码区序列有较高保守性。Vtgr在双须骨舌鱼前期卵巢发育中发挥着重要作用。     

哲罗鲑胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA分子克隆、序列分析及组织表达

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从哲罗鲑(Hucho taimen)肝脏的总RNA中扩增出胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的c DNA开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列,运用软件对其进行生物信息学分析,并利用荧光实时定量PCR技术检测了哲罗鲑成鱼不同组织中IGF-Ⅰ mRNA的表达情况。结果显示,IGF-Ⅰ基因的c DNA开放阅读框为573 bp,编码190个氨基酸,蛋白质等电点为9.21,氨基酸结构由信号肽、B、C、A、D结构域及E肽组成;氨基酸序列与其他鲑科鱼类具有较高的同源性,其中与北极红点鲑的IGF-Ⅰ同源性最高(99.2%);组织表达分析显示,哲罗鲑IGF-Ⅰ mRNA在肝脏中表达量最高,在鳃、前肠中次之,在脑、头肾、脾、心、胃和肌肉等组织中的表达量较低。     

脊尾白虾抗细胞凋亡因子DAD1基因的克隆及其组织表达分析

取健康脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)成体, 体长(5.81±0.32) cm, 体质量(1.18±0.35) g。根据本实验室已构建的脊尾白虾血细胞全长cDNA文库进行EST测序分析, 获得脊尾白虾抗细胞凋亡因子DAD1基因的cDNA全长并命名为EcDAD1基因。该序列全长645 bp, 包括5′非编码区184 bp, 开放阅读框345 bp和3′非编码区116 bp, 共编码114个氨基酸, 预测分子量为12.85 kD, 理论等电点为8.75。同源性分析表明, 脊尾白虾抗细胞凋亡因子EcDAD1氨基酸序列与其他物种DAD1有高度同源性, 与斑节对虾(Penaeus monodon)的相似性最高, 为92%; 与其他无脊椎动物的相似性为73%~80%。系统进化分析表明, 脊尾白虾EcDAD1与斑节对虾的DAD1紧密聚为一支。荧光定量PCR分析结果表明, EcDAD1基因在脊尾白虾血细胞、鳃、肝胰腺、肌肉、卵巢、肠、胃和眼柄中均有表达, 其中卵巢中的相对表达量最高。感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和WSSV后6 h和12 h, 脊尾白虾血细胞和肝胰腺中EcDAD1的表达量较对照组均显著增加(P<0.01), 且不同时间点间差异显著, 表明EcDAD1基因可能在脊尾白虾抵抗病原体入侵机体的过程中具有重要作用。

     

中华鳖MyD88部分序列克隆及其在组织中的表达差异分析

MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)是多数TLRs(Toll like receptor,TLRs)信号转导过程中的关键接头分子。研究根据MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)TIR结构域(Toll-like/IL-1 receptor domain)保守区设计简并引物,通过PCR扩增,成功地从中华鳖脾脏cDNA中扩增出351bp的目标序列。测序后经结构域和序列比较分析,扩增片段为中华鳖的MyD88 TIR结构域。该序列与大黄鱼、鸡等脊椎动物的MyD88的TIR结构域序列同源性和相似性分别为72.9%～86%和77.6%～83.6%。以热灭活嗜水气单胞菌刺激中华鳖后,经荧光定量PCR检测,在48h内,肝、脾和肾组织中MyD88 mRNA相对表达量均出现不同程度的增加,尤以脾脏中的增幅最为明显,为对照组的6.89倍;中华鳖心脏成纤维样细胞经20ng LPS刺激后1～8h,MyD88表达量有所提高,24h的表达量最高。该研究结果将为开展中华鳖天然免疫奠定良好基础。     

三峡库区长鳍吻鮈种群遗传多样性的初步研究

用磁珠富集法构建了长鳍吻(魚句)(AAAC)n寓集文库.从中分离并鉴定得到13个微卫星位点.对三峡库区重庆江段的40尾长鳍吻(魚句)群体进行了遗传多样性的初步研究,其中6个位点呈现多态性(1个位点为中度多态,5个位点为高度多态),等位基因数目为1～11个,观测杂合度在0.20～0.85.这些多态性位点将为长鳍吻(魚句)及其近缘种的种群遗传研究提供有力的遗传学资料.     

长江上游长鳍吻鮈Rhinogobio ventralis的个体繁殖力

2012~2015年在长江上游宜宾江段采集样品,分析研究长鳍吻鮈Rhinogobio ventralis的个体繁殖力及其与各体征指标的关系。结果表明:长鳍吻鮈的绝对繁殖力(F)变动范围为16 399~40 021粒/尾,平均为(27 943±7 777)粒/尾;体长相对繁殖力(FL)变动范围为87~165粒/mm,平均为(120.9±19.8)粒/mm;体质量相对繁殖力(FW)变动范围为124~234粒/g,平均为(163.8±21.7)粒/g。繁殖力与体征指标的相关分析表明:F、FL与体长、体质量、净体质量、卵巢质量以及年龄均呈正相关,达到极显著水平(P0.01);FW仅与体质量、净体质量以及成熟系数显著相关(P0.01);进一步回归分析显示:F、FL与体长、体质量、净体质量均呈二次函数相关,即繁殖力随体长、体质量增加而增长。     

金沙江长鳍吻鮈的含肉率及其营养成分分析

试验测定了长鳍吻鮈(Rhinogobio ventralis)含肉率及其肌肉常规营养成分(蛋白质、脂肪、灰分、水分)、矿物元素(钙、磷、钠、镁、铜、锌、铁、锰、铬、硒)和氨基酸组成,并对其营养价值作了综合评定。结果表明,长鳍吻鮈含肉率为(69.51±4.91)%;肌肉(鲜样)中水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量分别为(70.14±0.72)%、(17.26±0.47)%、(11.28±0.64)%、(0.87±0.03)%;肌肉中17种常见氨基酸(除色氨酸外)总含量为(16.15±0.26)%;其中,必需氨基酸含量为(6.31±0.11)%,占氨基酸总含量的39.10%。必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比值为64.20%。鲜味氨基酸含量为(6.27±0.11)%,占氨基酸总含量的38.83%。必需氨基酸指数为82.17。长鳍吻鮈的限制性氨基酸主要是异亮氨酸、蛋氨酸+胱氨酸、缬氨酸。10种矿物元素中,钙、磷、钠、镁4种常量元素的平均含量在296.32～3278.14μg/g,而铜、锌、铁、锰、铬、硒6种微量元素含量的平均值则在0.06～112.5μg/g;平均钙磷比为1∶2.1。     

金沙江长鳍吻鮈的含肉率及营养成分分析

试验测定了长鳍吻鮈（Rhinogobio ventralis）含肉率及其肌肉常规营养成分（蛋白质、脂肪、灰分、水分）、矿物元素（钙、磷、钠、镁、铜、锌、铁、锰、铬、硒）和氨基酸组成,并对其营养价值作了综合评定。结果表明,长鳍吻鮈含肉率为（69.51±4.91）%;肌肉（鲜样）中水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量分别为（7...