银腺杨转Cry I Ac和API双价抗虫基因的研究

在建立以银腺杨（84K）叶片为外植体的再生系统基础上，通过农杆菌介导法把CryⅠ4c和API双价抗虫基因导人银腺杨（84K）基因组中。转化杨树叶片，在含有卡那霉素的培养基上诱导不定芽和诱导生根，获得了400株卡那霉素抗性转化再生植株。抗性植株经PCR检测，有70株呈阳性。通过Southern杂交和ELISA检测进一步证明CryⅠ4c和API双价抗虫基因已整合到银腺杨（84K）基因组中，拷贝数1～2个，并得到了表达。转化植株用杨扇舟蛾幼虫进行饲虫试验，结果表明昆虫幼虫的死亡率高达60．0％～80．0％。同时，存活幼虫的生长发育也受到了明显抑制。本研究结果为杨树抗虫育种提供了新的种质资源。     

银腺杨转Cry I Ac和API双价抗虫基因的研究

在建立以银腺杨(84K)叶片为外植体的再生系统基础上,通过农杆菌介导法把Cry I Ac和API双价抗虫基因导入银腺杨(84K)基因组中.转化杨树叶片,在含有卡那霉素的培养基上诱导不定芽和诱导生根,获得了400株卡那霉素抗性转化再生植株.抗性植株经PCR检测,有70株呈阳性.通过Southern杂交和ELISA检测进一步证明Cry I Ac和API双价抗虫基因已整合到银腺杨(84K)基因组中,拷贝数1～2个,并得到了表达.转化植株用杨扇舟蛾幼虫进行饲虫试验,结果表明昆虫幼虫的死亡率高达60.0%～80.0%.同时,存活幼虫的生长发育也受到了明显抑制.本研究结果为杨树抗虫育种提供了新的种质资源.     

南林895杨抗旱耐盐基因DREB1C的转化

以美洲黑杨杂种优良无性系南林895杨为转基因受体材料,利用农杆菌介导法转化与逆境胁迫相关的DREB1C基因.经潮霉素筛选,共获得80株抗性植株,经PCR及RT-PCR检测有30株抗性植株呈阳性,初步证明DREB1C基因已整合到南林895杨基因组中.抗性试验结果初步表明,转基因植株的抗旱、耐盐性均有所提高.     

抗虫转基因杨树的培育及其抗虫性初步研究

以杨树优良新品种欧美杨107(Populus×euramericanacl."74/76")为试材,通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法,将Bt毒蛋白基因导入107杨的叶片及茎段外植体,经潮霉素抗性筛选,获得了转基因再生植株。提取转基因植株的总DNA,经PCR扩增,部分植株呈阳性反应,证明目的基因已经整合到杨树基因组中。以转基因杨树叶片饲喂天幕毛虫幼虫的杀虫试验结果表明,转基因杨树表现出一定的杀虫活性。     

AtMET1基因在84K杨中的遗传转化及诱导表达分析

[目的]研究拟南芥甲基化转移酶基因AtMET 1在银腺杨84K(Populus alba×P. glandulosa ‘84K’)中的诱导表达特性,为建立杨树甲基化诱导变异体系、进而实现杨树品种改良等奠定基础。[方法]以白杨派优良品种84K杨的无菌苗叶片为受体材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与AtMET1基因导入84K杨基因组中;经潮霉素筛选获得抗性植株,通过常规PCR检测、DNA测序等方法对抗性植株进行鉴定。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行诱导处理,处理时间为0、3、6、12、24、48、96、144 h,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外源基因AtMET1表达量变化。[结果]本研究共获得了潮霉素抗性芽648个,经生根筛选获得18株抗性植株,经分子检测证实全部为转基因植株,分别标号为AM-1～18#。qRT-PCR结果显示:化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因AtMET1的表达量即达到最大值,随后在处理6 h时表达量下降,处理12 h时有所回升,处理24 h后表达量降低至不足12 h时的一半。[结论]化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtMET1基因的表达,为进一步研究MET1基因在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础,也为今后杨树化学诱导表达研究及品种改良提供新思路、新方法。     

国槐转雪花莲凝集素基因及抗蚜性

通过农杆菌介导法将雪花莲外源凝集素基因(gna)导入国槐叶片,获得转基因再生植株,经卡那霉素抗性筛选,PCR和Southern blot检测证实,gna基因已经整合进入国槐基因组中。凝血活性检测表明,大部分转基因植株表现出一定的凝血活性,对照未转化植株的凝血活性很低。室内离体叶片虫试试验进一步证明,转基因植株较非转基因植株有一定的抗蚜虫能力。     

mtlD/gutD双价基因转化美洲黑杨×青杨的研究

利用叶盘法开展了mtlD gutD双价基因转化美洲黑杨×青杨的研究 ,经诱导不定芽及诱导生根阶段卡那霉素 (选择性抗生素 )连续筛选 ,获得了 38株卡那霉素抗性植株。抗性植株经PCR检测 ,2 8株呈阳性。对其中 5株PCR阳性植株进行Southern及Western杂交 ,有 4株二者均呈阳性 ,证明双价基因成功整合到美洲黑杨×青杨基因组中并得到表达。耐盐实验表明这 4株转基因植株抗NaCl能力比对照均有不同程度提高     

741杨双Bt基因的遗传转化及转基因株系的抗虫性

以含有Cry3Aa基因的重组质粒pBCC3为基础,利用PCR和DNA重组技术,从pBCC3中克隆出抗虫基因Cry3Aa,将其正向插入载体pCAMBIA1305的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,构建成pCAMBIA1305-Cry3Aa植物表达载体,并导入根癌农杆菌EHA105。采用农杆菌介导的遗传转化法,将Cry3Aa基因转入已转Cry1Ac+API基因的741毛白杨无性系pB29中,获得转双Bt基因的741杨。在含潮霉素的培养基中进行多次继代筛选,获得抗性稳定的无性系9个,编号为pCCA1—pCCA9。采用特异引物分别对转基因植株进行PCR检测,结果显示Cry1Ac基因稳定存在于pB29中,Cry3Aa基因已整合到各无性系的基因组DNA中。ELISA毒蛋白检测,转基因株系都有Cry1Ac和Cry3Aa杀虫蛋白表达。用转基因植株叶片进行柳蓝叶甲(鞘翅目)和美国白蛾(鳞翅目)室内饲虫试验结果表明,转基因植株具有双抗性。根据对测试昆虫的致死率划分高中低3个抗性水平,其中pCCA2,pCCA5,pCCA6,pCCA9具有双高抗;pCCA3,pCCA4和pCCA7对柳蓝叶甲表现出中、低抗性,对美国白蛾则高抗;而pCCA1表现对美国白蛾的极低抗性,对柳蓝叶甲则高抗。     

转抗菌肽基因毛白杨的培育及其对溃疡病的抗性

以毛白杨为转基因受体材料,利用根癌农杆菌介导法转化来源于益母草的阳离子抗菌肽基因LJAMP2。经卡那霉素筛选,共获得50株抗性植株。GUS组织染色和PCR检测显示有30株抗性植株呈阳性,初步证明外源目的基因已整合到毛白杨基因组中。RT-PCR证实抗菌肽基因LJAMP2在转基因植株中能大量表达。离体抗病性试验表明:转基因毛白杨细胞粗提液的抑菌能力明显强于非转基因植株。进一步将溃疡病菌接种在转基因和野生型毛白杨茎段上培养30天,转基因植株的病级指数均低于非转化植株。上述抗性试验结果表明:在毛白杨中超量表达益母草抗菌肽基因LJAMP2能显著提高其溃疡病抗病性。     

RNA干涉培育低木质素杨树

采用改良的CTAB法提取南林95杨的基因组DNA,经PCR扩增得到肉桂酰辅酶A还原酶CCR基因的第4个外显子部分序列,通过中间载体pUCCRNAi,构建含正反向干涉片段的pBI121表达载体,导入农杆菌LBA4404。利用叶盘法侵染南林95杨,获得3株转基因植株,经分子鉴定证实干涉片段已导入南林95杨。测定Klason木质素及综纤维素含量的结果显示:转基因植株Klason木质素含量与对照相比平均降低了9.86%,综纤维素含量与对照相比平均增加了3.17%,纤维长宽比明显增加,均表明转基因植株更有利于造纸。     

RNA干涉培育低木质素杨树

采用改良的CTAB法提取南林95杨的基因组DNA，经PCR扩增得到肉桂酰辅酶A还原酶CCR基因的第4个外显子部分序列，通过中间载体pUCCRNAi，构建含正反向干涉片段的pBll21表达载体，导入农杆菌LBA4404。利用叶盘法侵染南林95杨，获得3株转基因植株，经分子鉴定证实干涉片段已导入南林95杨。测定Klason木质素及综纤维素含量的结果显示：转基因植株Klason木质素含量与对照相比平均降低了9．86％，综纤维素含量与对照相比平均增加了3．17％，纤维长宽比明显增加，均表明转基因植株更有利于造纸。     

转ugb基因银腺杂种杨的耐涝性

对导人透明颤菌血红蛋白(vitreoscilla hemoglobin,VHb)基因vgb银腺杂种杨进行Southern印记杂交和RTPCR检测,证实vgb基因已整合到杨树基因组中,并在转录水平上得到表达.在温室对4个转基因株系及对照盆栽扦插苗进行模拟持续淹水胁迫试验,研究淹水条件下植株的生长及生理性状.结果表明,随着淹水时间的延长苗木逐渐死亡.对照植株在淹水17天后死亡率达66.67%,而4个转基因株系死亡率均低于50.00%,其中T81最低,只有25.00%;同时4个转基因株系在淹水胁迫时能够保持较高的叶绿素含量,并且膜质过氧化物MDA含量均低于对照植株;涝渍胁迫下转基因株系生长受抑制程度低于对照植株.说明在淹水胁迫下vgb基因的表达增强了银腺杂种杨叶绿素含量的积累,进而促进了转基因植株的生长,提高了转基因株系对淹水的忍受能力.     

北方速生丰产林栽培技术及人工林发展趋势

转基因林木新品种培育始于80年代中期。1988年,美国依阿华大学首先利用从马铃薯中提取蛋白抑制基因为目的基因,以根癌农杆菌 Ti 质粒为载体,对杨树进行转化,获得卡那霉素植株。1991年,B·H·Mcoown等人利用电激法将 Bt基因导入杨树,获得抗     

柞蚕抗菌肽D基因转化桉树培育抗青枯病株系的研究

通过二次正交旋转组合设计对尾叶桉叶盘愈伤组织分化培养基优化 ,获得尾叶桉 (Eucalyptusuro phylia)叶盘外植体的再生植株。将携带外源目的基因的根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)与尾叶桉U6无性系叶盘共培养 ,经愈伤组织诱导、卡那霉素筛选和植株再生 ,获得 2 0个小芽 ,再将小芽转入附加卡那霉素(Kam) 4 0 μg·mL- 1 的E3-B培养基中诱根 ,获得 8株存活且可再生的转化子。取转化苗叶片作胭脂碱合成酶活性检测电泳后呈阳性 ;分别以γ 32 p dCTP及地高辛标记柞蚕抗菌肽D基因作探针 ,与转化苗DNA作点杂交及Southern印迹杂交检测 ,结果均呈阳性。以上结果表明 ,柞蚕抗菌肽D基因已整合到尾叶桉基因组中。将从桉树青枯病重病区分离的强毒青枯菌 (Pseudomonasspp .)株 (9910 16 )以 1× 10 9cfu·mL- 1 浓度接种转化试管苗 ,以未经转基因的尾叶桉U6 无性系试管苗为对照 ,结果表明转化苗接种死亡率 5 6 7% ,对照死亡率为 86 7% ,由此可推出导入柞蚕抗菌肽D基因的尾叶桉转化苗明显提高了对青枯菌的抗性     

反义磷脂酶Dγ基因与几丁质酶基因转化美洲黑杨G2

建立美洲黑杨G2组培再生体系,确立美洲黑杨G2分化最适宜培养基和生根培养基.然后分别进行卡那霉素和潮霉素敏感性试验,利用叶盘法依次将反义磷脂酶Dγ(Anti-PLDγ)基因和几丁质酶(CH5B)基因转入美洲黑杨G2中.首先转入反义磷脂酶Dγ基因,经诱导不定芽及生根阶段卡那霉素(选择性抗生素)连续筛选,获得了21株卡那霉素抗性植株.抗性植株经PCR及PCR-Southern杂交检测,有13株均呈阳性,证明Anti-PLDγ基因成功整合到美洲黑杨G2基因组中.耐盐性试验表明,4株转基因植株抗NaCl能力比对照都有不同程度提高.选择4号株系继续转入几丁质酶基因,通过潮霉素(选择性抗生素)筛选不定芽及诱导生根获6株潮霉素抗性植株,经PCR及PCR-Southern杂交检测,6株均呈阳性,证明CH5B基因成功整合到美洲黑杨G2基因组中.由于CH5B基因与报告基因GUS处于同一开放阅读框(ORF)内,因此通过GUS基因的组织化学染色分析,证明了6株转化植株几丁质酶基因均获得正常表达.     

84K杨PagMSBP1/2a基因对木质素合成的影响

【目的】膜类固醇结合蛋白(MSBP)是一类定位在细胞质膜上的类固醇受体蛋白,通过响应激素调节信号、参与类固醇代谢影响植物生长发育过程。研究杨树MSBP对生长发育过程的影响,尤其是对木材形成过程的作用,为杨树木材品质改良提供支撑。【方法】以拟南芥MSBP1蛋白序列在毛果杨、银腺杨84K基因组中进行同源序列比对,获取杨树MSBP的核苷酸和氨基酸序列,构建系统进化树并绘制基因结构图谱;利用qPCR分析杨树MSBP基因在84K杨顶芽、根、茎、叶中的相对表达量;在AspWood表达谱数据中分析同源基因在木材形成中的表达模式;构建35 S∷GFP-PagMSBP1/2a植物表达载体,通过农杆菌介导瞬时转化烟草叶片,激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位情况;构建35 S∷PagMSBP1/2a植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化84K杨,通过震荡切片观察转基因和对照植株茎段木质部差异;采用乙酰溴法和间苯三酚染色法,分析转基因和对照植株的木质素含量以及木质素在杨树茎段维管组织中的分布。【结果】同源比对鉴定出杨树7个MSBP成员,根据进化关系和基因结构对杨树基因进行命名,其中与AtMSBP1、AtMSB...     

正交设计在杨树最佳遗传转化体系的建立

本试验以建立的南林95杨高频再生体系为基础,利用正交试验设计,通过GUS组织染色分析法研究了预培养时间、茵液浓度、As浓度、侵染时间和共培养时间5个因素在4个水平上对南林95杨遗传转化的影响,并探讨了南林95杨转化中添加卡那霉素的适宜浓度。运用DPS软件对试验结果进行分析,建立了杨树遗传转化体系。结果表明：外植体预培养7d,在含As200μmol／L的茵液浓度为0．6的农杆菌液中侵染20rain,共培养3d为最佳遗传转化体系,适宜的卡那霉素筛选浓度为50mg／L;本试验共获得6株转化植株,经GUS染色检测和PCR分析表明．GUS基因已初步整合进入南林95杨基因组中。     

ACC合酶cDNA克隆及其对美洲黑杨体内乙烯产生的反义抑制

利用ＲＴＰＣＲ技术克隆了大豆ＡＣＣ合酶基因ＧＭＣＡＣＣＳＩ编码区１５ｋｂ的ｃＤＮＡ片段,经酶切图谱分析和序列分析鉴定后,反向插入到２元载体ｐＢｉｎ４３８中,构建了表达ＡＣＣ合酶反义ＲＮＡ的植物表达载体,转化农杆菌后用该农杆菌侵染美洲黑杨叶片,在含卡那霉素的ＭＳ培养基上选择转化子和植株再生,通过ＰＣＲ检测从抗卡那植株中选到１５株转基因植株,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析初步确证了外源基因是以单拷贝插入到杨树基因组ＤＮＡ中;对杨树幼苗乙烯释放的测定结果表明转基因杨树幼苗的乙烯释放量为对照的２２％。     

通过RNAi技术抑制杨树c3h基因表达提高糖转化效率

利用克隆得到的毛白杨c3h1基因构建其RNAi抑制表达载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘法转化银腺杨无性系84 K,Realtime PCR检测表明其转基因株系323、325和322中c3h1基因表达量较野生型植株分别下调89.04%、82.22%和68.38%;茎横切片组化染色和显微结构观察表明转基因植株木质部发育和木质素沉积方式发生了改变;木质素、纤维素含量测定及苯酚—硫酸法总糖含量与HPLC法可溶性总糖和单糖含量检测结果表明:转基因植株木质素含量平均降低23.00%,最高可达39.71%;酸前处理效率最高提高了41.39%;未经酸处理直接酶解的糖化效率是对照植株的2.34～2.72倍,322株系和323株系比对照植株经酸前处理后再酶解的糖化效率高出81.18%和375.53%。     

转CpTI基因毛白杨的获得

毛白杨是我国特有的树种 ,与其他派别的杨树相比抗性较强 ,品质优良 ,生长迅速。但蛀干害虫桑天牛专门危害毛白杨 ,造成了很大损失。生物技术的发展为害虫防治提供了一条崭新的途径 ,人们寄希望于通过基因工程手段导入外源抗虫基因培育抗虫新品系。ＭｃＣｏｗｎ( 1 991 )将苏云金杆菌毒蛋白(Ｂ .ｔ毒蛋白 )导入银白杨×大齿杨 ,获得一株转基因植株 ,并对舞毒蛾幼虫有毒杀作用 ,国内的研究者同样将Ｂ .ｔ毒蛋白基因导入黑杨派树种获得抗虫转基因植株 (陈　颖 ,1 995;田颖川 ,1 993;王学聘 ,1 997) ,但害虫易对Ｂ .ｔ毒蛋白产生耐受性的问题不…