植物青枯病原细菌胞外蛋白相关基因的克隆

 用含有转座子Tn5的铜绿假单胞杆菌PAO1826(pMO75∷Tn5,Km^r)诱变我国马铃薯青枯菌小种3号菌株PO41,获得6000多个胞外多糖正常产生的接合子。经SDS-PAGE电泳,筛选出2个胞外蛋白减少9种的突变株PM2644和PM239,其可以引起烟草叶片典型的过敏性反应,致病力比野生型菌株显著降低,皆为原养型菌株。Southern杂交的结果表明,突变株染色体上只有1个转座子插入位点。标记交换证明,9种胞外蛋白缺失与转座子插入相偶联的频率为100%。以聚半乳糖醛酸酶和内葡聚糖酶2种胞外酶为指示蛋白进行定量测定的结果表明,在突变株上清液中和菌体细胞内都没有这2种胞外酶的存在。以突变株PM2644为受体菌,通过基因功能互补的方法,从野生型青枯菌基因文库筛选到2个阳性克隆pPSP1和pPSP2,它们既能恢复2个突变株产生胞外蛋白的能力,也能将2个突变株的致病力恢复到接近野生型菌株的水平。     

无致病力青枯菌株对番茄青枯病的防治效果

用紫外诱变法获得的青枯无致病力菌株ATm0 4 4和Asp0 6 1对致病菌没有直接的抑制作用 ;处理番茄后对青枯病产生抗性 ;两菌株可在番茄体内定殖并繁殖 ,移栽浸根是最佳的处理方法。盆栽试验结果表明 ,番茄经ATm0 4 4和Asp0 6 1处理后 ,分别较对照推迟 9和 7d发病 ,2 0d后的防效达 56 .7%和 53.4 %。田间小区试验结果表明 ,经ATm0 4 4和Asp0 6 1菌悬液浸根处理番茄 ,1 5d后对青枯病的防治效果分别为 53.8%和 37.7%。     

烟草感染青枯菌后的组织病理变化

病症观察表明,烟草感染青枯菌后168h叶片全部萎蔫下垂、褐变。茎部切片表明,青枯菌处理72h,个别导管内出现了染色较深的物质,髓部和皮层的部分薄壁细胞出现破损。120h后导管内染色较深的物质增多,导管堵塞程度加大。168h后局部区域的木质部和韧皮部分离。对感病植株的叶进行青枯病菌分离,结果表明:从叶中可分离出致病青枯菌,并可以导致复感植株得病继而死亡。     

青枯雷尔氏菌胞外蛋白指纹多态性分析

 采用SDS-PAGE技术对70株不同来源及致病力青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）进行胞外蛋白指纹多态性分析,研究结果表明,供试青枯雷尔氏菌菌株呈现丰富的胞外蛋白指纹多态性,多态性比率为100%。不同来源青枯雷尔氏菌分泌的胞外蛋白不同,EZ-Tn5TM插入诱变菌株电泳出20条不同大小蛋白条带,分子量集中在20~97 kD ,且菌株间蛋白条带相似或完全相同;60Co辐射诱变菌株共电泳出16条不同大小的蛋白条带,多数蛋白分子量44.3 kD;野生型菌株电泳的蛋白条带最多,共获得26条不同大小的蛋白条带。进一步对37株不同致病力的野生型菌株进行胞外蛋白含量测定,结果表明,不同致病力菌株胞外蛋白含量差异大,强致病力菌株分泌的胞外蛋白含量较高,为1.026～5.963μg/mL,无致病力菌株胞外蛋白含量较低,为0.083～0.761 μg/mL。     

烟草青枯病菌分离株RSXJ-1的培养性状及其生物型鉴定

从江西省峡江县烟区采集呈典型症状的青枯病烟株,采用平板梯度稀释分离法分离获得一株病原菌分离株,命名为RSXJ-1。在完成致病性测定的基础上,通过分子生物学方法将该菌株鉴定为茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。本文研究了该菌株在不同培养基上的培养性状,结果表明该菌株的培养性状与R.solanacearum的培养性状相一致;对该菌株进一步进行生物型研究,结果显示该菌株能利用乳糖、麦芽糖、纤维二糖、甘露醇和山梨醇氧化产酸并能还原硝酸盐;而不能利用甜醇氧化产酸,据此将该菌株鉴定为生物型Ⅲ-1。     

PMA-qPCR定量检测青枯菌活菌方法的建立

本文将叠氮溴化丙锭(PMA)与荧光实时定量PCR技术相结合,建立了一种适于青枯菌不同小种菌株活细胞精准、快速检测的PMA-qPCR方法。通过单因素变化试验对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了PMA终浓度为15 ng/μL,黑暗孵育时间为10 min,曝光时间为5 min的PMA预处理体系。试验结果表明,当活菌比例大于10%,PMA-qPCR的测定结果均在理论活菌数相对应的95%置信区间内。检测灵敏度测试结果显示,该方法适用于活菌数在5.0×10~2～5.0×10~8 cfu/mL范围内菌悬液的检测。本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范围内有效去除青枯菌死菌的干扰,定量检测出活菌数量,研究结果可为植物细菌性青枯病的流行规律研究提供新的技术支撑。     

大蒜根系分泌物对烟草青枯病的影响

为探讨大蒜根系分泌物对烟草青枯病菌的抑菌活性,采用抑菌圈法和盆栽试验研究了大蒜根系分泌物及其主要成分对烟草青枯病的影响。结果表明：大蒜根系分泌物浓度为1g/mL时,对烟草青枯病菌抑制效果最好,其抑菌率为53.67%。大蒜根系分泌物4种成分的抑菌效果由强到弱依次为：2,6-二异丙基苯酚>二烯丙基二硫>2,6-二叔丁基对甲酚>邻苯二甲酸二丁酯。其中,2,6-二异丙基酚对烟草青枯病菌的抑制作用最强,在1和5mmol/L时的抑菌率分别为99.66%和100.00%;在盆栽试验中也具有较好的防治效果,接种后7 d和14 d后,其防效分别为34.75%和31.35%。因此,大蒜根系分泌物及其成分均对烟草青枯病有明显的抑制作用。本研究揭示了大蒜作为轮作或间作作物对烟草青枯病的防控机理,以及大蒜根系分泌物和2,6-二异丙基酚作为烟草青枯病防治剂的潜力。     

7种杀菌剂对姜瘟病菌Z-AQ-2菌株的抑菌活性

青枯菌4号生理小种引起的姜瘟病是我国生姜生产上的巨大障碍。本研究以分离自5种不同寄主的8株青枯菌为研究对象,采用最小抑制浓度法(MIC)评价了它们的铜抗性水平,发现分离于山东安丘的4号小种Z-AQ-2菌株的铜抗性水平最高,为1.6mmol/L;采用生长速率法测定了7种常用杀菌剂对Z-AQ-2菌株的室内毒力,结果表明:3%中生菌素可湿性粉剂对姜瘟病菌的抑菌活性最高,其EC50为5.2mg/L,其次为6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂,EC50为21.2mg/L,20%叶枯唑可湿性粉剂在3种不含铜的农药中EC50值最高,为58.7mg/L,4种铜制剂抑菌效果相对较差,EC50为51.5~148.7mg/L;进一步采用Colby法评价了叶枯唑与氢氧化铜、叶枯唑与中生菌素以及中生菌素与氨基寡糖素的混用效果,结果表明:三组药剂的混用均可产生增效或加成效果。     

我国植物青枯菌菌株的遗传多样性和组群划分

 采用15条随机引物对我国11个省(市、区)6种不同寄主植物的43个青枯菌代表性菌株和4个国外青枯菌菌株,进行了PCR扩增.引物OPB11、OPA15、OPE1和OPZ10对上述所有菌株扩增获得了相似的产物电泳图谱,分别具1~5条谱带不等;引物OPB7、OPA10和OPF1对马铃薯菌株获得了相同的产物图谱,但对其它寄主菌株的产物间有明显差别;引物OPA14、OPC,6、OPG14、OPF5、OPK14、OPK20和OPK17对于不同菌株的扩增产物多态性很强.供试菌株被聚类为2个组群,即组群A和组群B.组群A中又可分为7个亚组(A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7),其中A1含有2个类型(A1-1、A1-2);组群B中也可分为2个亚组(B1、B2),其中B1含有3个类型(B1-1、B1-2、B1-3),B2也含有3个类型(B2-1、B2-2、B2-3).RAPD组群A中包含了27个来自我国不同地区的马铃薯菌株,主要是3号小种、生化变种2;组群B中含有20个来自不同地区、不同寄主的菌株,分属于其它不同的小种和生化变种.研究结果表明,我国青枯菌菌株RAPD组群的划分与菌株的地理来源关系不大,而与寄主来源有明显相关性.此外,通过对我国青枯菌菌株组群进行同源性PCR分析表明,来源自马铃薯的3号小种菌株属于美洲分支"Americanmm",而来自其它寄主的青枯菌1号、5号小种菌株属于亚洲分支"Asiaticum",与本研究RAPD组群A和组群B的划分是一致的.     

荧光假单胞杆菌3000亿个／克可湿性粉剂防治辣椒青枯病试验

辣椒青枯病是由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种土传病害,一旦发生,会严重减少辣椒产量。试验通过单位面积施用不同剂量的荧光假单胞杆菌3000亿个／g可湿性粉剂以明确其防治辣椒青枯病的效果。结果表明：荧光假单胞杆菌3000亿个儋可湿性粉剂能够很好的控制辣椒青枯病,防治效果明显高于对照,且对作物安全。     

福建及贵州等地烟草青枯菌系统发育分析

[目的]探寻烟草上青枯菌的系统发育.[方法]采用演化型分类框架对福建及贵州等地的62个烟草青枯病菌株进行鉴定分析.[结果]基于内切葡聚糖酶基因系统发育学的分析结果表明:所有参试菌株均归属于青枯菌亚洲分支的4个序列变种,分别为序列变种15、17、34和44;尚未发现归属于美洲或非洲分支的烟草青枯病菌株.其中序列变种15和17为优势菌系,序列变种34的菌株都来自福建省,只发现3个菌株属于序列变种44.基于avrA基因的氨基酸序列比对结果表明4个序列变种的avrA基因都属于RS1000类型.[结论]本研究表明福建及贵州等地烟草上的青枯菌存在一定的遗传分化.     

广东茄科青枯菌致病力分化及其DNA多态性分析

 分别采自广州、增城、东莞、花都、三水、清远、电白、高要8个菜区的番茄、茄子和辣椒上的31个青枯病菌株,经人工接种于10个鉴别寄主植物上,结果表明,它们的致病力存在明显的差异。聚类分析这31个菌株,可以聚为3个组:第I组菌株主要来自种植番茄和茄子历史较长的广州、东莞、增城老菜区,其致病力较强;第Ⅱ组菌株主要分离自茄子和辣椒上,其致病力中等;第Ⅲ组菌株主要来自近年来新发展的三水市各番茄产区,它们的致病力较弱。从200个随机引物中筛选出17个引物用于上述31个菌株DNA的RAPD分析,共扩增出523条带,其中468条为多态性带,占89.5%。聚类分析这31个菌株,又可聚为4个簇群:第I簇群主要分离自已推广种植多年的丰顺、金丰等抗病番茄品种上;第Ⅱ簇群分离自抗病的番茄新品种新星、年丰和石碣紫红茄上;第IV簇群主要分离自辣椒和茄子;而第Ⅲ簇群来源包括番茄、茄子和辣椒这3种寄主植物。上述试验结果说明,广东茄科青枯菌的致病力存在明显的分化现象,其DNA存在较高的遗传多样性。     

崂山常见中药材提取物对烟草青枯病菌的抑制作用

以烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum为病原指示菌,从艾叶Artemisiae argyi等40种崂山常见中药材95%乙醇提取液中筛选对其具有明显抑制作用的活性物质。结果表明,32种(80%)药材提取物显示出不同程度的抑菌作用,其中公丁香Syzygium aromaticum提取物抑菌活性最强,其抑菌圈直径达19.53 mm。采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用法分析鉴定了公丁香提取物中12种化学组分,其中相对含量最高的丁香酚(40.43%)抑菌活性最强,抑菌圈直径达18.50 mm,处理6 h对病菌的抑制中质量浓度(EC₅₀)值为0.0292 mg/mL。本研究表明崂山地区抑菌植物具有丰富的多样性,公丁香提取物中活性成分丁香酚具有防治烟草青枯病的良好应用潜力。     

壳聚糖对青枯劳尔氏菌生长及其生物膜形成的影响

为建立快速检测壳聚糖抑菌效果的方法,研究其对青枯菌生物膜形成的影响并探索其抑菌机理,利用酶标仪检测壳聚糖与菌悬液混合培养物的吸光值,计算抑菌率,同时利用结晶紫染色法对壳聚糖处理后青枯菌生物膜形成能力进行评价,并进行透射电镜观察.结果表明,在壳聚糖浓度低于0.15 mg/mL时,随浓度增加其抑菌效果亦显著增加,其浓度超过0.15 mg/mL之后,其抑菌效果达到同一水平,最高抑菌率为74.3％;而壳聚糖浓度对青枯菌生物膜形成能力未产生显著影响;透射电镜观察结果显示:壳聚糖通过破坏青枯菌细胞膜抑制细菌生长.     

茄青枯拉尔氏菌Rs-T02在3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯作用下的差异蛋白分析

为探明3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯(MG)抑制茄青枯拉尔氏菌的机制,利用二维电泳技术,分析了MG作用下茄青枯拉尔氏菌Rs-T02菌株的差异蛋白。结果发现在MG作用下的菌体中检测出29个差异蛋白点。采用质谱技术鉴定出22个差异蛋白,其中新增蛋白11种、缺失蛋白5种、表达上调蛋白1种和表达下降蛋白5种。这些蛋白参与能量代谢、信号转导、物质运输和DNA修复等途径。我们推测,与能量代谢相关的新增蛋白spot 9和缺失蛋白spot 65可能与MG抑制茄青枯拉尔氏菌的机制有关。     

繁殖青枯菌噬菌体无毒菌株的筛选及应用

利用噬菌体防治植物细菌性病害,关键技术是噬菌体的扩大繁殖,利用宿主菌繁殖,应用时存在一定的风险。本研究通过继代培养筛选致病性丧失的青枯菌菌株作为青枯菌噬菌体扩繁的宿主,结果表明,通过对野生青枯菌株RSsw326连续超过20代的培养,获得了一株菌落圆形、游动性弱的变异菌株;再通过刺叶、注射和伤根等方法接种烟苗,30 d后无萎蔫症状出现,将该菌株命名为RSsw326-2;测试表明,该菌株对青枯病菌没有拮抗作用,可被从福建不同烟区分离纯化的8株噬菌体裂解。利用菌株RSsw326-2作为宿主,进行青枯菌噬菌体的扩大繁殖,培养36 h,效价可达10¹⁰ PFU/mL。将无毒菌株RSsw326-2+噬菌体的共培养液刺叶、伤根和不伤根接种烟苗,35 d后均无症状出现,而将毒性菌株RSsw326+噬菌体的共培养液刺叶接种后14 d、伤根接种后28 d发病率都为100%,不伤根接种烟苗35 d,发病率为66.7%。无毒菌株RSsw326-2+噬菌体的共培养液对盆栽烟苗防病试验结果表明,发病时间推迟8 d,并且在接种后21 d时对烟草青枯病的防效达74.1%,显著高于对照组。本研究采用继代培养筛选获得的无毒菌株作为噬菌体扩大繁殖的宿主,为今后研制噬菌体制剂的生产提供了参考。     

烟草青枯病内生拮抗菌的筛选、鉴定及其防效测定

 植物体内的大量微生物,在进化的过程中,由于长期生活在植物特定部位,因而与植物形成了一种特殊的关系,这些微生物在植物体内大量繁殖和扩散,有望成为生物防治有潜力的微生物。内生细菌是植物体内大量存在的微生物之一,具有在植株体内分布广、定殖能力强、防效好以及增殖和扩散快等优点,因而成为发展前景很好的植物病害生防菌。     

生防菌ANTI-8098A对青枯雷尔氏菌的抑菌特性

本文测定了不同培养阶段的生防菌ANTI-8098A对青枯雷尔氏菌的抑制作用、加热处理对ANTI-8098A抑菌作用的影响、不同培养阶段的生防菌液在190～900nm波长范围内的光吸收值,分析了光吸收值与抑菌作用间的相关性。结果表明,生防菌ANTI-8098A的抑菌作用在培养12h后开始出现,48h时达到最强;生防菌液经沸水浴加热后会丧失小部分抑菌活性,使生防菌液对青枯雷尔氏菌的抑制中浓度（EC50）较未加热的提高14.40%;不同培养阶段的生防菌培养液在波长190、260、280和400nm处的吸收值相近,而在450～900nm的波长范围内,培养液的吸光值随着培养时间的延长而上升,这一变化趋势与培养液抑菌作用的变化趋势相一致;生防菌液的抑菌作用与其在190nm处的吸光值呈负相关,与其在450nm处的吸光值呈正相关。研究结果提示,生防菌ANTI-8098A的抑菌物质可能为非蛋白类的耐热毒素,并且能被450～900nm波长、尤其是450nm波长的光所标记。     

Implication of C-terminal mutation of PopA of Ralstonia solanacearum strain OE1-1 in suppression of bacterial wilt

Ralstonia solanacearum strain OE1-1 causes bacterial wilt on tobacco plants. The popA -mutant 31b, derived from OE1-1 by insertion of transposon Tn 4431 , did not cause wilt on tobacco plants inoculated through the roots. However, when 31b was directly inoculated into xylem vessels, the tobacco plants wilted, similarly to those inoculated with OE1-1. 31b retained its exopolysaccharide productivity and its type-III secretion function. Furthermore, 31b grew in intercellular spaces and systemically infected tobacco plants, similarly to OE1-1. popA consists of an operon with popB and popC , and suppression of popB and popC expression resulting from polar mutation by transposon insertion did not affect the virulence of 31b. The mutated popA ( popA31b ) was composed of 960 nucleotides, including 39 derived from Tn 4431. A recombinant mutant from OE1-1, where popA31b was introduced by marker exchange, showed the same phenotype as 31b. PopA31b protein was extracellularly secreted by 31b co-cultured with Arabidopsis thaliana . These results suggest that PopA31b extracellularly secreted by 31b in intercellular spaces may be implicated in suppression of disease development, leading to inability of the bacteria to induce wilt on plants. Taken together, interactions between host plants and R. solanacearum existing in intercellular spaces immediately after invasion may be involved in disease development.     

青枯菌无致病力菌株对烟草青枯病的控病作用初步研究

从茄子、番茄、辣椒、烟草青枯病株中分离出116株无致病力青枯菌,室内平板喷雾法拈抗试验结果表明,有21株菌在NA培养基上可明显抑制青枯菌TbRs的生长;烟草MSK326品种温室盆栽控病试验表明,Tnljdl-3和Aujd8—2—1两株菌具有较好控病效果,20d后的相对防效分别为58．4％和97％。